魯耀雄 高 鵬 李棉勇 崔新衛(wèi) 朱校奇 彭福元* 戴良英

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，湖南長沙 410128；2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所，湖南長沙 410125；3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長沙 410128）

百合枯萎病又稱根腐病、莖腐病，是百合生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的一種真菌性土傳病害（丁丁 等，2011；Rao et al.，2013），由尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮孢菌（F.rnoniliforme）和茄腐皮鐮孢菌（F.solani）等病原菌侵染引起，其中以尖孢鐮孢菌分離頻率和致病率最高，是其主要的病原菌（楊秀梅 等，2010）。百合種植具有明顯的地域性特征，主要集中在湖南龍山和隆回、甘肅蘭州、江西萬載、江蘇宜興等地，這些地區(qū)百合種植歷史悠久，連作現(xiàn)象十分普遍，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，多年連作百合的枯萎病發(fā)病率高達70%以上（李琬玥 等，2016）。百合枯萎病危害大，分布廣，防治難（張藝萍 等，2018），嚴(yán)重影響了百合的產(chǎn)量和質(zhì)量，阻礙了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（武志江 等，2015）。

蚯蚓被稱為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能方面占有重要地位，其通過調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境來緩解作物連作障礙（畢艷孟和孫振鈞，2018）。一方面，蚯蚓通過挖掘、排泄等活動提高了土壤孔隙度、團聚體穩(wěn)定性、土壤pH 和礦質(zhì)氮含量（王笑 等，2017），調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)（Chen et al.，2018），提高微生物量碳（姚影 等，2015），增強微生物活性（Akca et al.，2014），且隨著蚯蚓耕作年限的延長微生物活性逐漸升高（鄭憲清 等，2015），改良了土壤微生態(tài)環(huán)境和促進養(yǎng)分循環(huán)（曹佳 等，2015），有利于植物根系生長和養(yǎng)分的吸收利用，增強了作物的抗病能力（Bertrand et al.，2015）。另一方面，蚯蚓通過選擇性地取食土壤中真菌、破壞真菌菌絲、和真菌競爭食物資源，導(dǎo)致病原真菌數(shù)量減少（Dempsey et al.，2011；Plav?in et al.，2017），特別是鐮孢菌數(shù)量的降低（Wolfarth et al.，2011），有效降低了作物枯萎病的發(fā)生（Bi et al.，2018）。目前，國內(nèi)外大量研究主要集中在利用蚯蚓糞中含有大量的拮抗微生物等有益菌群（Huang et al.，2013；袁向華 等，2017），抑制連作土壤中尖孢鐮孢菌等病原真菌的數(shù)量（潘鳳兵 等，2019），降低土傳病害的發(fā)病率（Gopalakrishnan et al.，2011；穆靜娟 等，2017），達到緩解作物連作障礙的目的（田給林和張潞生，2016）。然而，有關(guān)蚯蚓活動對連作百合枯萎病的影響研究較少。

本試驗以百合枯萎病為研究對象，研究接種蚯蚓條件下對盆栽連作百合生長、產(chǎn)量、土壤容重和根際微生物數(shù)量的影響，統(tǒng)計百合成熟期的枯萎病病情指數(shù)，并對枯萎病發(fā)病情況與土壤的生物特性進行相關(guān)性分析，旨在探討蚯蚓活動與連作百合枯萎病發(fā)病情況的相互關(guān)系，為深入理解蚯蚓與土傳病害的相互作用機制提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試百合品種為卷丹百合，由湖南龍山綠葉百合農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供。

土壤采自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心高橋基地百合連作兩年的旱地紅壤土，土壤基本理化性質(zhì)為：pH 值5.42，有機質(zhì)含量21.18 g·kg-1，全氮1.56 g·kg-1，全磷0.87 g·kg-1，全鉀20.7 g ·kg-1，堿解氮108.45 mg·kg-1，有效磷95.87 mg ·kg-1，速效鉀135.33 mg·kg-1。

牛糞來源于中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所長沙農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測研究站的牛場，蚯蚓糞在湖南省農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所的實驗室由牛糞經(jīng)蚯蚓轉(zhuǎn)化而成，原材料理化性質(zhì)和微生物特性見表1。蚯蚓品種為大平2 號赤子愛勝蚓，來源于湖南省湘北蚯蚓養(yǎng)殖有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在湖南省農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所的網(wǎng)室內(nèi)進行，百合種植于2017 年9 月25 日，收獲于2018 年7 月26 日。采用盆栽試驗，設(shè)4 個處理：CK1，全施化肥；CK2，牛糞表施（百合種球覆蓋部分土壤，在其上方表施牛糞，施用量為22 500 kg·hm-2，按照干基算，下同）；T1，蚯蚓糞（按照牛糞經(jīng)蚯蚓轉(zhuǎn)化成蚯蚓糞后約為牛糞的80%計算，蚯蚓糞的施用量為18 000 kg·hm-2，蚯蚓糞與土壤按照質(zhì)量干基比1∶3 混合均勻覆蓋百合種球）；T2，牛糞表施接種蚯蚓（牛糞表施用量為22 500 kg·hm-2，投放大平2 號赤子愛勝蚓，每條質(zhì)量為0.40～0.45 g，接種量為75 kg·hm-2，約每株百合投放蚯蚓1 條）。每處理按照N、P2O5、K2O 養(yǎng)分投入量為450、375、600 kg·hm-2計算（牛糞、蚯蚓糞計入養(yǎng)分投入量），則換算成每盆的N、P2O5、K2O 養(yǎng)分投入量為10.0、8.3、13.3 g，不足的養(yǎng)分用化肥補齊，化肥種類為尿素（含N 46.4%）、過磷酸鈣（含P2O512%）和硫酸鉀（含K2O 50%），所有化肥在播種時一次性撒施在百合種球下方土壤中。由于接種的大平2 號赤子愛勝蚓為表層蚯蚓，且卷丹百合的莖根生長在表層土壤，所以牛糞采用表施。按每公頃種植18 萬株百合計算，盆的長寬高尺寸為40 cm × 30 cm × 16 cm，每盆栽種4 株百合，種植行間距為15 cm × 25 cm，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)5 盆，一共60 盆。為防止鮮牛糞過快干掉和雜草生長，在所有處理上面覆蓋一層1～2 cm 厚的稻草。

1.3 測定項目和方法

記錄百合的出苗率，以及苗期（2018 年4月12 日）、旺長期（5 月20 日）的株高、莖粗和SPAD 值。株高、莖粗分別使用卷尺、游標(biāo)卡尺測量。采用SPAD-502PLUS 葉綠素儀測定苗期從上往下數(shù)展開葉的第15 片葉，旺長期從上往下數(shù)展開葉的第25 片葉的SPAD 值。在苗期的晴天下午15：00 用土壤溫度計測定水平距離百合主莖12 cm處，深5 cm 和10 cm 的地溫。在百合旺長期隨機抽取每重復(fù)中的1 盆，在水平距離百合主莖12 cm處的位置用環(huán)刀取土壤，采用環(huán)刀法測定其含水量、田間持水量、孔隙度、容重，隨后從盆中挖取整株百合，去掉非根際土壤，然后抖動百合球莖收集掉落的根際土壤，分成2 份，1 份經(jīng)稀釋涂布平板法測定土壤的細菌、真菌、放線菌和鐮孢菌數(shù)量（張雪艷 等，2009；魯耀雄 等，2015），1 份測定土壤的pH 和有機質(zhì)含量，并挑取整盆的蚯蚓進行數(shù)量統(tǒng)計。調(diào)查成熟期（7 月16 日）百合枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，并于7 月26 日收獲百合并測定產(chǎn)量。

百合枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)以株為單位，根據(jù)百合枯萎病發(fā)病程度進行分級調(diào)查，每重復(fù)調(diào)查16 株，記錄調(diào)查總株數(shù)、各級病株數(shù)。調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)（張麗麗 等，2012）：0 級為植株莖稈正常，全株無病葉；1 級為病株底部變黃或變紫葉片數(shù)不超過整株葉片數(shù)的25%，莖頂端變淺紫色，心葉向一側(cè)輕度彎曲；2 級為病株底部葉片枯萎或枯萎葉片數(shù)占整株的25%～50%，莖上部變紫色且明顯彎曲；3 級為病株枯萎葉片數(shù)占整株的50%以上，莖中上部變紫色，且嚴(yán)重彎曲；4 級為全株表現(xiàn)枯萎或整株枯死，莖基部維管束變褐。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2017 和SAS 8.1 軟件進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差異法（1east significant difference，LSD）進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓活動對連作百合出苗率的影響

由圖1 可以看出，不同處理的百合出苗率隨著時間推移逐漸升高，其中T2 處理的出苗率最高，其次是CK1，CK2 最低，且T2 處理同時期各重復(fù)樣本之間的標(biāo)準(zhǔn)差相對最小，說明T2 處理的百合出苗更整齊?？梢?，蚯蚓活動下的連作百合出苗要快于其他處理，其整齊度也優(yōu)于其他處理。

2.2 蚯蚓活動對連作百合生長和產(chǎn)量的影響

由表2 可知，百合的株高、莖粗和SPAD 值在苗期和旺長期都以T2 處理最好，且其株高、莖粗在苗期和旺長期都顯著高于同期的其他處理。百合產(chǎn)量最高的也是T2 處理，種球平均鮮產(chǎn)量為98.26 g·個-1，顯著高于其他處理，比CK1 提高了9.94%，比T1 處理提高了6.88%。相比其他處理，蚯蚓活動促進連作百合生長發(fā)育，更有利于增加連作百合的產(chǎn)量。

表2 蚯蚓活動對連作百合生長和產(chǎn)量的影響

2.3 蚯蚓活動對連作百合土壤理化性質(zhì)的影響

由表3 可知，土壤的pH、有機質(zhì)含量、含水量、田間持水量和總孔隙度都以T2 處理最大，其pH、有機質(zhì)含量、田間持水量都顯著高于其他處理，相比CK1，T2 處理的pH 更接近中性，有機質(zhì)含量提高了43.28%，田間持水量提高了33.36%。T2 處理的土壤容重顯著小于其他處理，為1.01 g·cm-3。土層5 cm 和10 cm 處的地溫都是CK1 最高，其次是T1 處理，CK2 最低。相比其他處理，蚯蚓活動（T2）提高了連作百合土壤的pH、有機質(zhì)含量、含水量和田間持水量，增大土壤的總孔隙度，有利于百合的根系生長。

2.4 蚯蚓活動對連作百合根際土壤微生物和蚯蚓數(shù)量的影響

由表4 可知，連作百合根際土壤的細菌數(shù)量以T2 處理最多，顯著高于其他處理，比CK1、CK2 和T1 處理分別增加了4.76、2.90、1.63 倍；真菌數(shù)量以T2 處理最少，與T1 處理差異不顯著，顯著低于CK1 和CK2，分別減少了66.03%和80.11%；T2 處理的放線菌數(shù)量顯著高于其他處理，比CK1、CK2 和T1 處理分別增加了2.58、5.32、1.34 倍；T2 處理的鐮孢菌數(shù)量顯著低于其他處理，比CK1、CK2、T1 處理分別減少了69.36%、72.99%、50.14%；T2 處理的蚯蚓數(shù)量為19.33 條 ·盆-1，比原接種的4 條·盆-1增加了3.83 倍，說明接種的蚯蚓得到了較好的生長繁殖。相比其他處理，蚯蚓活動（T2）提高了根際土壤細菌和放線菌數(shù)量，降低了真菌和鐮孢菌數(shù)量。

表3 蚯蚓活動對連作百合土壤理化性質(zhì)的影響

表4 蚯蚓活動對連作百合根際土壤微生物和蚯蚓數(shù)量的影響

2.5 蚯蚓活動對連作百合枯萎病發(fā)生的影響

由表5 可知，連作百合枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)以T2 處理最低，分別為39.58%和17.71，都顯著低于其他處理，其次都是T1 處理；T2 處理相對于CK1 的防治效果為53.42%、相對于T1 處理的防治效果為42.37%。說明蚯蚓活動（T2）相比其他處理更有利于降低連作百合的枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，防控連作百合枯萎病的效果更好。

表5 蚯蚓活動對連作百合枯萎病發(fā)生的影響

2.6 連作百合枯萎病與根際土壤生物學(xué)性狀的相關(guān)性分析

由表6 可知，蚯蚓數(shù)量與細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為0.974 和0.956，與真菌數(shù)量和鐮孢菌數(shù)量呈負相關(guān)；連作百合枯萎病發(fā)病率與真菌數(shù)量和鐮孢菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為0.953和0.985，與細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量和蚯蚓數(shù)量呈負相關(guān)；連作百合枯萎病病情指數(shù)與真菌數(shù)量和鐮孢菌數(shù)量呈正相關(guān)，其中與鐮孢菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r為0.975，與細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量和蚯蚓數(shù)量呈負相關(guān)，其中與放線菌數(shù)量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r為-0.960。說明蚯蚓活動增加了細菌和放線菌數(shù)量，減少了真菌和鐮孢菌數(shù)量，優(yōu)化了連作百合根際土壤的微生物區(qū)系，尤其是鐮孢菌數(shù)量的下降是降低連作百合枯萎病發(fā)生的關(guān)鍵因子。

表6 連作百合枯萎病與根際土壤生物學(xué)特性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論和討論

為了緩解百合連作過程中土傳病害的發(fā)生（Wu et al.，2014），種植戶需要噴灑大量農(nóng)藥進行防治（陳希 等，2015），且施藥量不斷加大（沈克儉 等，2018），導(dǎo)致環(huán)境污染、生態(tài)失衡和農(nóng)殘超標(biāo)（張娜娜 等，2018），不利于產(chǎn)區(qū)的百合種植和加工業(yè)可持續(xù)發(fā)展。蚯蚓是土壤改良的“工程師”，在連作百合中，接種的蚯蚓將牛糞轉(zhuǎn)化成蚯蚓糞，并通過自身的活動與土壤混合，提高土壤pH、有機質(zhì)含量和養(yǎng)分有效性（李歡 等，2011；鄭憲清 等，2012），增加土壤的含水量、田間持水量和孔隙度（李彥霈 等，2018），有利于土壤養(yǎng)分循環(huán)利用（Blouin et al.，2013），促進了百合的出苗和生長，本試驗結(jié)果也與前人研究相一致。但是由于土壤含水量大，水分蒸發(fā)吸熱量大，導(dǎo)致土層5 cm 和10 cm處的地溫不是最大的。雖然牛糞表施（CK2）的含水量比全施化肥（CK1）要高，但是由于表施牛糞容易結(jié)殼，通氣性差，春季時土壤溫度上升慢些，土層5 cm 和10 cm 處的地溫最小（表3），導(dǎo)致其出苗初期的出苗率低于其他處理。

蚯蚓活動改變了土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)（于建光 等，2012；楊格格 等，2017），主要表現(xiàn)為增加細菌和放線菌數(shù)量（魯耀雄 等，2019），減少真菌數(shù)量。本試驗中，細菌數(shù)量增多是土壤肥力提高的表征，說明蚯蚓活動能夠較好地提高土壤肥力，促進連作百合的生長，真菌和鐮孢菌數(shù)量的減少，降低了土傳真菌病原菌的侵染，有效減少百合枯萎病的發(fā)生，有效緩解百合連作障礙，有利于增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。而牛糞表施處理（CK2）的土壤真菌數(shù)量最多，顯著高于其他處理，一方面是牛糞沒有經(jīng)過堆肥腐熟，帶有較多病原菌，另一方面是牛糞表施于連作百合土壤中，濕度和營養(yǎng)更容易滋生病原菌，導(dǎo)致百合枯萎病的發(fā)病最嚴(yán)重，因此，投入到大田中的畜禽糞便等有機物料需要經(jīng)過蚯蚓過腹或者高溫堆肥腐熟。蚯蚓糞含有大量的有益微生物菌群，很多專家學(xué)者應(yīng)用蚯蚓糞來緩解作物土壤連作障礙，本試驗中施用蚯蚓糞（T1）對連作百合枯萎病的防治效果差于接種蚯蚓（T2），一方面，蚯蚓活動有利于提高土壤中細菌和放線菌數(shù)量，減少真菌數(shù)量（表4），促進養(yǎng)分循環(huán)，減少連作百合枯萎病的發(fā)生（表5），而蚯蚓糞中的微生物由于缺少了與蚯蚓互作，其數(shù)量和活性在土壤環(huán)境中可能逐漸衰退；另一方面，蚯蚓還通過自身活動和代謝產(chǎn)物（蚯蚓糞）擴散，持續(xù)保持土壤疏松度和養(yǎng)分供應(yīng)，涵養(yǎng)水分（表3），有利于百合根系的生長，促進出苗，提高出苗整齊度（圖1），促進了連作百合的生長發(fā)育。

在研究蚯蚓活動降低連作百合土傳病害時，由于田間試驗不好控制土壤中蚯蚓的數(shù)量和缺少可以飼養(yǎng)的土蚯蚓品種，所以采用盆栽試驗并接種大平2 號赤子愛勝蚓（可飼養(yǎng)，便于觀察），同時為了蚯蚓能夠在試驗中較好的生長繁殖，施用牛糞和覆蓋稻草，可能與土蚯蚓活動對緩解連作百合障礙的作用有所差異。百合具有球根和莖根，尤其是莖根生長在土壤表層，是投入表層蚯蚓的活動范圍，有利于它們的相互作用；牛糞表施增加了蚯蚓數(shù)量，蚯蚓活動的增強更有利于調(diào)控土壤微生物區(qū)系，降低連作百合的枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，達到緩解土壤連作障礙的目的。但是利用平板培養(yǎng)得到的微生物種類和數(shù)量均有限，大部分根際微生物都無法用現(xiàn)代的技術(shù)手段進行培養(yǎng)，無法全面認(rèn)識和了解蚯蚓活動對連作百合根際微生物的影響。因此，還需利用宏基因組等高科技手段進一步深入研究分析蚯蚓活動與根際微生物中哪些特征菌群可能存在互作關(guān)系，這些特征微生物群落豐度的變化又是否與土壤肥力的提升和作物的抗病促生有關(guān)。