王明月,胡財(cái)江*,安孟飛,申 暢,孫澤銳,趙云麗,王宣軍,盛 軍**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 普洱茶教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,云南 昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201;4.云南大學(xué),云南 昆明 650091)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鲝亩率构趋来嘈栽黾印⒐钦埏L(fēng)險(xiǎn)增加的代謝性骨骼疾病[1,2]。由于全球人口老齡化越來(lái)越嚴(yán)重,OP成為了一種日益普遍的疾病,并成為全世界存在的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[3,4],尤其是在絕經(jīng)后婦女人群中發(fā)病的概率最大，因?yàn)樵诮^經(jīng)后婦女的雌激素分泌水平下降，這會(huì)導(dǎo)致骨量減少，從而增加患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。目前我國(guó)治療OP的方法主要是藥物法,但它會(huì)引發(fā)一系列的副反應(yīng),因此日常保健對(duì)于OP的治療作用重于服用藥物。鐵皮石斛是一種藥食同源的中草藥,具有極高的藥用價(jià)值以及豐富的生理活性,包括降低患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[7]、增強(qiáng)免疫功能[8]、預(yù)防肝損傷[9]、抑制腫瘤活性[10]、抗炎[11]等作用,并且其多糖還具有降血糖[12]、降血壓[13]以及具有有效清除自由基從而起到抗氧化活性[14,15]等生理功能。但是迄今有關(guān)鐵皮石斛對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果的報(bào)道較少,尤其是對(duì)骨微結(jié)構(gòu)方面的影響報(bào)道幾乎沒(méi)有,鑒于此，筆者探討了鐵皮石斛提取物在改善切除卵巢小鼠的骨微結(jié)構(gòu)方面的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF級(jí)ICR小鼠,體重在28～30 g,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SYXK(滇)K2013-0004。實(shí)驗(yàn)室溫度在(24±1)℃,相對(duì)濕度為50%～60%。

1.2 樣品與儀器

鐵皮石斛莖在2011年收集于云南省,由普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所所長(zhǎng)付開(kāi)聰教授鑒定,并且憑證標(biāo)本(2011-DPE-1)存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將石斛莖用打粉機(jī)粉碎,在80 ℃條件下溫浸3次,每次1 h,3次的加水量依次為20倍、15倍、15倍。將濾液減壓濃縮(-0.06～-0.08 MPa,50～70 ℃),將相對(duì)密度0.90～1.05(60 ℃)的提取物減壓干燥(-0.06～-0.10 MPa,≤70 ℃)至干,粉碎,過(guò)80目篩,得深棕色粉末，即鐵皮石斛提取物樣品,其水分含量小于5%。在實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量的鐵皮石斛提取物樣品，用雙蒸水混懸定容至相應(yīng)溶度，備用。戊酸雌二醇片,由Bayer公司生產(chǎn)。S1-114電子天平，由北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)。μCT100 Micro-CT，由瑞士SCANCO Medical AG公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

將72只小鼠按照隨機(jī)區(qū)組法分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、雌二醇組(E2組)、鐵皮石斛提取物低劑量組(DCE-Low組)、鐵皮石斛提取物中劑量組(DCE-Medium組)和鐵皮石斛提取物高劑量組(DCE-High組)。在分組后，模型組與處理組均摘除小鼠雙側(cè)卵巢,而假手術(shù)組僅切除小鼠兩側(cè)卵巢周圍同樣重量的脂肪組織。術(shù)后小鼠恢復(fù)1周，然后通過(guò)灌胃的方式給予樣品,給予劑量分別為1.50 mg/kg(E2組)、0.35 g/kg(DCE-Low組)、0.70 g/kg(DCE-Medium組)和1.05 g/kg(DCE-High組),連續(xù)灌胃3個(gè)月,每周稱重;在解剖前禁食12 h；在解剖后取小鼠左側(cè)股骨進(jìn)行影像學(xué)觀察。

2.2 影像學(xué)檢測(cè)

通過(guò)μCT 100 Micro-CT對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠的左側(cè)股骨進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，采集參數(shù)為:分辨率10 μm；曝光時(shí)間300 ms；電壓70 kV；電流200 μA。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS 17.0和Graph Pad Prime 5處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；兩組間的比較使用t-test,P值小于0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果與分析

顯微CT分析的結(jié)果(圖1)顯示:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)顯著被破壞;而用雌二醇與鐵皮石斛提取物低、中和高劑量分別給骨質(zhì)疏松模型小鼠連續(xù)灌胃3個(gè)月后,與模型組相比,E2組(陽(yáng)性對(duì)照組)小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)改善不太明顯,但是鐵皮石斛提取物處理可明顯改善小鼠由于切除卵巢而導(dǎo)致的骨小梁結(jié)構(gòu)損傷的情況。

如圖2所示：與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的骨密度顯著降低(P<0.05)；而用雌二醇與鐵皮石斛提取物低、中和高劑量分別給骨質(zhì)疏松模型小鼠連續(xù)灌胃3個(gè)月后,與模型組相比,E2組以及DCE-High組可明顯改善小鼠由于切除卵巢而導(dǎo)致的骨密度下降的情況(P<0.05或P<0.01)。

如圖3所示：Model組與Sham組相比,骨小梁厚度極顯著降低(P<0.01)；而E2組和DCE-High組與模型組相比，骨小梁厚度顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

如圖4所示：Model組與Sham組相比,骨小梁分離度極顯著增加(P<0.01)；E2組的骨小梁分離度與模型組相比有所增加(P>0.05)；但是DCE低、中、高劑量組與模型組相比，雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有降低骨小梁分離度的趨勢(shì)(P>0.05)。

由圖5可見(jiàn)：Model組與Sham組相比,骨小梁數(shù)目顯著減少(P<0.05)；E2組與模型組相比，骨小梁數(shù)量略有減少；但是DCE三個(gè)劑量組與模型組相比，骨小梁數(shù)量有回升的趨勢(shì)(P>0.05)。

從圖6可以看出：Model組與Sham組相比,骨小梁體積比顯著減少(P<0.05);E2組與模型組相比，骨小梁體積比幾乎處在同一水平；但是DCE組與模型組相比，骨小梁體積比有所改善(P>0.05)。這些結(jié)果表明用鐵皮石斛提取物處理小鼠可明顯改善切除卵巢導(dǎo)致的骨微結(jié)構(gòu)退變。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥已發(fā)展成為可引起大規(guī)模的臨床和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題的一種具有全球挑戰(zhàn)性的疾病[16]。前人研究已經(jīng)證明目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物有一定的副作用并且在臨床上受限制[6],因此探索從植物中提取的天然產(chǎn)物來(lái)替代藥物的應(yīng)用具有十分重要的意義。這些替代療法可能表現(xiàn)出更好的活性和更少的副作用。藥用植物鐵皮石斛在以前的研究中就作為一種功能性食品和藥物來(lái)使用[17],它主要含有石斛多糖、生物堿、氨基酸、微量元素和菲類化合物等有效成分[18]。之前有學(xué)者報(bào)道了鐵皮石斛可以治療多種病理疾病，包括免疫、炎癥、癌癥和高血糖[10,19]等,然而到目前為止有關(guān)鐵皮石斛在治療骨質(zhì)疏松癥方面的應(yīng)用報(bào)道極少。

行卵巢切除術(shù)(OVX)誘導(dǎo)的小鼠是一個(gè)被廣泛接受的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?它可以模擬雌激素缺乏引起的人類骨丟失。這是一個(gè)非常經(jīng)典的動(dòng)物模型，已被廣泛應(yīng)用于研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松并且由食品藥品監(jiān)督局推薦[20-22]。骨密度是檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥骨硬度和骨質(zhì)量的重要指標(biāo)[23,24];盡管早期研究已經(jīng)證明了由OVX誘導(dǎo)的模型組小鼠與假手術(shù)組相比,骨密度會(huì)降低[25,26],但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用鐵皮石斛提取物處理小鼠可以防止小鼠股骨的骨密度下降。骨小梁體積分?jǐn)?shù)表示骨組織體積與組織體積的比值,它能直接反映骨量的變化情況,同時(shí)也是評(píng)價(jià)松質(zhì)骨骨量的常用指標(biāo)之一[27,28]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在骨質(zhì)疏松模型小鼠中,模型組的骨小梁體積分?jǐn)?shù)與假手術(shù)組相比明顯減少[29]；本實(shí)驗(yàn)也得到了同樣的結(jié)果,但是用鐵皮石斛提取物處理后小鼠的骨小梁體積分?jǐn)?shù)明顯有所改善。因?yàn)楣切×旱墓琴|(zhì)量與骨微結(jié)構(gòu)緊密相關(guān),因此通過(guò)骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)可以計(jì)算出骨小梁厚度、骨小梁分離度以及骨小梁數(shù)目,這些參數(shù)是評(píng)價(jià)骨小梁空間形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要指標(biāo)。前人研究表明,在OVX誘導(dǎo)的小鼠中,模型組小鼠與假手術(shù)組相比,骨小梁厚度與骨小梁數(shù)量明顯降低，并且骨小梁分離度會(huì)增加[30-32]；但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用鐵皮石斛提取物處理小鼠可以使這些參數(shù)得到改善。

總的來(lái)說(shuō),這項(xiàng)研究的結(jié)果表明連續(xù)12周灌胃給予小鼠鐵皮石斛提取物可明顯增加骨密度,改善骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)僅從影像學(xué)分析了鐵皮石斛對(duì)OVX小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響,還需對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。