鄭方媛 周秀雯 袁 望 馮 濤 李素芳 潘家榮

(中國計量大學生命科學學院/浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室/海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 310018)

肉類及其相關(guān)產(chǎn)品的摻假欺詐行為在世界各地屢有發(fā)生，影響消費者對食品安全的信心[1-2]。2013年，中國新聞媒體報道了一個犯罪團伙利用狐貍、水貂、老鼠等未經(jīng)檢驗檢疫的動物肉制品，添加明膠等偽造羊肉，非法盈利超過1 000 萬元人民幣[3]。2014年，全球最大的連鎖零售企業(yè)沃爾瑪因進貨查驗制度未落實到位，在標簽為五香驢肉的產(chǎn)品中鑒定出狐貍DNA[4]。類似馬肉丑聞[5]報道的事件不僅破壞企業(yè)的社會聲譽，更會對經(jīng)濟、宗教、道德造成嚴重影響，甚至對消費者健康造成損害[6-7]。狐貍臭腺肉體通常不作為食用肉，流入市場會引起消費者不適甚至健康問題。針對肉類摻假嚴重的現(xiàn)狀，迫切需要建立快速、可靠和特定的動物種類識別鑒定方法保護消費者免受這些惡意行為的侵害。

目前，肉源性成分的鑒定大多利用基于DNA 以及PCR 分析方法相關(guān)的技術(shù)，如實時PCR 技術(shù)[8]、聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[9]、物種特異性/常規(guī)PCR[10]或DNA 條形碼[11]。Wu 等[6]以核DNA 為靶點，結(jié)合多重PCR和實時熒光PCR 技術(shù)，通過分析電泳帶、擴增曲線和標準曲線，有效地鑒別了狐貍?cè)?、貂肉、狗肉和兔肉成分，研究表明實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果具有線性良好(R2＞0.99)、重復(fù)性好等優(yōu)點。Li 等[12]利用雙重PCR 技術(shù)結(jié)合核酸內(nèi)切酶消化，通過分析產(chǎn)物電泳長度，DNA 測序鑒定出牛肉和羊肉中1%(m/m)含量的狐貍、貂和浣熊成分。相對于基于蛋白檢測的方法，常規(guī)PCR 法、實時PCR 法等基于核酸的檢測方法具有穩(wěn)定性好、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。

交叉引物等溫擴增( cross-primer isothermal amplification，CPA)是一種核酸等溫擴增技術(shù)[13-14]，利用鏈置換型DNA 聚合酶可在60 min 內(nèi)實現(xiàn)無溫度循環(huán)的擴增，設(shè)備簡單，在醫(yī)學、流行病學和食品安全領(lǐng)域廣泛用于病毒和病菌的檢測[15-19]。橫向流動試紙條技術(shù)(lateral flow dipstick，LFD)成本低且具有較高的特異性和敏感性，在檢測致病細菌、蛋白質(zhì)、重金屬、真菌毒素和核酸方面起著重要的作用[20-21]，在肉源性成分檢測方面大多結(jié)合PCR 擴增技術(shù)[22-23]。雖然目前已有多種擴增、檢測方法用于肉源性成分的鑒定，但對于企業(yè)和監(jiān)管部門來說，還缺乏準確、低成本、快速的現(xiàn)場檢測方法，將等溫擴增技術(shù)與核酸檢測試紙條結(jié)合運用能有效滿足現(xiàn)場快速檢測的實際需求。

本研究利用CPA 技術(shù)與一次性核酸試紙條檢測技術(shù)，以狐貍?cè)鉃檠芯繉ο螅H、羊、豬、鼠、鴨、牛肉為對照，以物種線粒體基因為靶標，用生物素和6-羧基熒光素(6-Carboxyfluorescein，6-FAM)標記狐貍?cè)馓禺愋訡PA 引物，利用產(chǎn)物標記與試紙條膠體金、檢測線物質(zhì)的特異性結(jié)合建立狐貍?cè)庠葱猿煞挚焖贆z測方法，旨在為食品監(jiān)管部門、肉制品加工企業(yè)、超市和消費者提供可靠的摻假檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狐貍樣本(2 kg)由山東省濟寧市嘉祥縣養(yǎng)殖場提供，牛、羊、豬和鴨樣本(各2 kg)購自浙江省杭州市物美大賣場(高沙店)，驢樣本(0.5 kg)購于市場專營店，鼠樣本(0.5 kg)為實驗室留存樣本。購買的樣本均為新鮮的肌肉組織，將樣本分裝標記，置于-20℃冰箱儲藏備用。一次性核酸檢測試紙條[(disposable nucleic acid detection strip)，類型:D003-03，包裝:10條/包×5]購自優(yōu)思達生物技術(shù)杭州有限公司。

BstDNA 聚合酶(BstDNA polymerase，目錄號:M0275S，8 000 U·mL-1)、MgSO4(100 mmol·L-1)，拜爾迪生物技術(shù)(北京)有限公司；液氮，杭州今工特種氣體有限公司；西班牙瓊脂糖(biowest agarose G-10)，米克化工儀器(杭州)有限公司。

由生工生物工程股份(上海)有限公司合成非標記引物[純化方法: 高效親和純化(high affinity purification，HAP)]和標記引物[純化方法:高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)]。提供動物基因組DNA 快速抽提試劑盒(目錄號:B518221)、脫氧核苷三磷酸溶液(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs，目錄號:B500056)、50×TAE 緩沖液(目錄號:B548101)、DNA 分子量標準Marker A(25～500 bp，目錄號:B600303)、DNA 分子量標準Marker C(100～1 200 bp，目錄號:B600333)、1×TE 緩沖溶液(Tris-EDTA，目錄號:B548106)、甜菜堿(Betaine，目錄號:B106221，規(guī)格:100 g)、4S Red Plus 核酸染色劑(目錄號:A606695)和雙蒸餾水(ddH2O，目錄號:A500197)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PICO 17 臺式離心機、Nanodrop-2000 核酸蛋白分析儀，美國Thermo 公司；HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；Powerpac HC 1645052 伯樂高流核酸 電 泳儀，美國Bio-Rad 公 司； Tanson 3500 10T5553-825 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；XH-C 漩渦混合器，江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 肉樣品(驢、羊、豬、牛、狐貍、鴨、鼠)化凍后剔除肥肉、骨組織，各取80 g 剪碎的精肉標記備用。單一肉樣品處理方式為從每種標記的精肉樣本中取5 g 肉末，用研缽碾碎后標記用于提取DNA。羊和狐貍混合肉樣品處理參考Abd El-Razik 等[24]的方法，在羊肉樣品中加入狐貍?cè)猓側(cè)狻醚蛉?m ∶m)為9∶10、8 ∶10、7 ∶10、6 ∶10、5 ∶10、4 ∶10、3 ∶10、2 ∶10、1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000、1 ∶10 000，分別取不同比例的混合肉樣5 g用液氮處理后，用研缽磨成粉末標記備用。

1.3.2 DNA 提取 分別取每個單一肉種的研磨樣品以及不同比例羊和狐貍混合肉的液氮研磨粉末樣品各25 mg，參照動物基因組DNA 快速抽提試劑盒使用手冊提取樣品總DNA。提取的DNA 用核酸蛋白分析儀檢測，并將其濃度調(diào)整約為100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計 從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)檢索狐貍、驢、鼠、羊、鴨、牛、豬的全線粒體完整基因組，利用DNAMAN 軟件比對狐貍(GenBank 序列號:KP342451.1， NC026529.1， KP200876.1，KP050554.1)、 驢(GenBank 序列號: MK100122.1，MH605334.1，MG426188.1，KT221838.1 )、 鼠( GenBank 序列號: D83491.1，KY018919.1，AP014941.1，NC005089.1)、 羊(GenBank 序列號:KT148968.1， KU575248.1， KU681201.1，EF490456.1)、 鴨(GenBank 序列號: AF090337.1，NC028346.1，KT345702.1，KJ833586.1)、牛(GenBank序 列 號: AF492351.1，MF925711.1，MF663794.1，MG820631.1) 和豬(GenBank 序列號:NC012095.1，AP003428.1，AB298688.1，NC000845.1)的肉源內(nèi)非特異性片段及肉源間特異性片段。選取物種內(nèi)差異較小或一致的若干序列片段與其他6 個物種的線粒體區(qū)段再次比對完成狐貍特征性片段篩選，該區(qū)段基因為線粒體ND5 基因的一段序列。使用Oligo 7 和Primer 5 軟件結(jié)合手工調(diào)整設(shè)計5 條狐貍的特異性引物(4s，5a，2a1s，2a*，3a*)(圖1)，設(shè)計的引物序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性驗證。

圖1 狐源特異性CPA 引物系統(tǒng)設(shè)計圖Fig.1 The design diagram of fox specificity CPA primer system

1.3.4 產(chǎn)物檢測方法 依據(jù)CPA 的反應(yīng)原理圖[14，25]，擴增產(chǎn)物為一系列長度不等的條帶，本試驗設(shè)計的狐貍特異性擴增體系擴增出最短的2 個產(chǎn)物分別為2a1s-3s-2s/2s1a-3a-2a(114 bp)，2a*1s-3s/2s1a-3a*(82 bp)，將這2 個產(chǎn)物作為電泳圖的觀測產(chǎn)物。將2a*1s-3s/2s1a-3a*(產(chǎn)物2)作為一次性核酸檢測試紙條的檢測產(chǎn)物，產(chǎn)物2 中2a1s-3a*標記為生物素，2a1s-3s*標記為6-FAM，檢測產(chǎn)物被雙標記(圖2-A)。通過生物素與鏈霉親和素的特異性結(jié)合，將帶有生物素的產(chǎn)物與一次性核酸測試紙條的膠體金結(jié)合，熒光素與檢測線上的熒光素單克隆抗體結(jié)合，在檢測線上顯示陽性，質(zhì)控線區(qū)域含有生物素，與連有鏈霉親和素的膠體金結(jié)合來指示試紙條的有效性(圖2-B)。

圖2 CPA 擴增及產(chǎn)物檢測方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of CPA amplification and product detection methods

核酸電泳檢測方法為在3%瓊脂糖凝膠上以100 V 的電壓對5 μL 擴增產(chǎn)物進行30 min 電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴增條帶。一次性核酸檢測試紙條檢測方法為取5 μL 擴增產(chǎn)物滴加于樣品墊，將試紙條的樣品墊向下插入含有100 μL 試紙條緩沖溶液的微孔板中，15 min 內(nèi)拍照記錄判讀區(qū)的檢測結(jié)果。

1.3.5 CPA 反應(yīng)特異性測試 以狐貍?cè)釪NA 作為陽性對照，鼠、鴨、牛、羊、豬、驢6 種肉的總DNA 和ddH2O 為參照。所有DNA 模板均使用1×TE 稀釋至100 ng·μL-1。20 μL 的CPA 初始反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)溫度63℃，反應(yīng)時間60 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取5 μL 擴增產(chǎn)物利用核酸電泳和一次性核酸檢測試紙條進行檢測。

表1 CPA 反應(yīng)體系Table 1 The CPA reaction system

1.3.6 CPA 反應(yīng)靈敏度測試 將保存的狐貍?cè)釪NA樣品(100 ng·μL-1)稀釋至濃度為100、50、25、10、1、0.1 ng·μL-1，進行擴增靈敏度試驗。反應(yīng)產(chǎn)物用核酸電泳和一次性核酸檢測試紙條分別進行檢測，以確定CPA 反應(yīng)體系對單一狐貍?cè)釪NA 的靈敏度。

1.3.7 CPA 反應(yīng)檢測限測試 將狐貍?cè)馀c羊肉質(zhì)量比分別為9 ∶10、8 ∶10、7 ∶10、6 ∶10、5 ∶10、4 ∶10、3 ∶10、2 ∶10、1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000、1 ∶10 000 的DNA(100 ng·μL-1) 作為模板進行CPA 擴增，產(chǎn)物用核酸電泳和一次性核酸檢測試紙條進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPA 擴增特異性試驗結(jié)果

以狐貍、鼠、鴨、牛、羊、豬和驢肉DNA 為模板進行CPA 擴增試驗，電泳結(jié)果見3-A。以ddH2O 為模板的陰性對照無擴增產(chǎn)物，說明反應(yīng)系統(tǒng)自身不發(fā)生擴增；以狐貍?cè)釪NA 為模板的反應(yīng)產(chǎn)物在電泳圖上顯示核酸條帶，最短的2 個條帶長度與理論長度(2a*1s-3s/2s1a-3a*:82 bp，2a1s-3s-2s/2s1a-3a-2a:114 bp)相符，以鼠、鴨、牛、羊、豬和驢肉DNA 為模板的擴增結(jié)果中無CPA 特征條帶。說明以狐貍DNA 設(shè)計的特異性引物系統(tǒng)只能擴增狐貍源性成分且具有良好的特異性。一次性核酸檢測試紙條檢測結(jié)果與電泳結(jié)果一致，說明一次性核酸檢測試紙條能正確檢測狐貍DNA的擴增產(chǎn)物。

2.2 CPA 擴增靈敏度試驗結(jié)果

將狐貍?cè)釪NA 濃度從100 ng·μL-1稀釋至0.1 ng·μL-1，并用作CPA 反應(yīng)的模板。電泳圖在DNA 濃度大于10 ng·μL-1時顯示陽性結(jié)果(圖4-A)。一次性核酸檢測試紙條在10 ～100 ng·μL-1濃度下顯示陽性結(jié)果(圖4-B)，在1 ng·μL-1濃度下陽性較弱，結(jié)果判讀不可靠。因此檢測狐貍源性成分的CPA 擴增方法靈敏度為10 ng·μL-1。

圖4 狐源CPA 系統(tǒng)擴增靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 The sensitivity test results of fox source-CPA system amplification

2.3 CPA 擴增對混合肉的檢測限試驗結(jié)果

通過對羊肉和狐貍?cè)獠煌瑩奖然旌先馓崛〉腄NA 進行CPA擴增，確定了狐貍源特異性CPA檢測體系的檢測限，電泳圖上觀察靈敏度為9%(圖5-A)。一次性核酸檢測試紙條上觀察到的靈敏度為1%(圖5-B)。因此檢測狐貍源性成分的CPA 綜合試紙條法對羊和狐貍混合肉的檢測限為1%。

圖5 狐源CPA 系統(tǒng)擴增檢測限結(jié)果Fig.5 The detection limit test results of fox source-CPA system amplification

3 討論

特種毛皮動物(如貂和狐貍)的皮毛是高檔紡織材料，不法養(yǎng)殖場為獲取高額利潤會利用激素加速動物生長或促成皮毛光鮮以獲得更多更優(yōu)質(zhì)皮毛，大量剩余肉體低價出售給食品和飼料制造商，經(jīng)過加工處理后進入市場，難以覺察。這些被丟棄或流入市場的肉體組織也容易成為很多病原體的宿主，如寄生蟲[26]。因此，食用狐貍?cè)饪赡軐θ梭w健康造成危害甚至造成生命危險。目前肉類鑒定主要基于靈敏度高、準確性優(yōu)、重復(fù)性好的PCR 檢測技術(shù)開發(fā)研究，多選擇羊、牛、鴨、豬等常見家養(yǎng)經(jīng)濟食用肉類作為研究對象[27-29]。本研究的主要目的是建立一種狐貍?cè)獾目焖贆z測方法，有助于保護消費者免受因食用含有狐貍?cè)馐称范斐傻膫Α?/p>

引物特異性設(shè)計是物種有效鑒定的前提[30]。本研究基于線粒體ND5 基因區(qū)域比對了各物種的種內(nèi)種間差異，其中設(shè)計的狐貍3a*引物與其他物種的堿基差異比率范圍為35%～88%，高于Kim 等[8]設(shè)計的牛特異性引物beef F 與其他19 個物種的堿基差異比率范圍(30%～45.8%)。此外3′端多態(tài)性區(qū)域的差異比對分析也是特異性重要考量因素，在確證引物體系能有效擴增的前提下，CPA 方法中多引物參與、尤其是交叉引物的引入為狐貍的特異性檢出提供了優(yōu)勢。本研究用5 種市售常見食用肉類以及可作為摻假肉的鼠肉作為對照驗證了狐貍特異性CPA 引物系統(tǒng)的有效性。多物種同步檢測開發(fā)是目前肉源物種檢測的研究趨勢[30-34]。在擴增層面，雖然包含5 條引物的CPA系統(tǒng)增加了對單個狐貍物種DNA 的特異性，但如果多物種特異性引物體系同步參與擴增，會受到多引物之間的選擇或競爭性抑制，多個物種的擴增效率會有所不同，從而出現(xiàn)一個目標物種的檢測產(chǎn)物優(yōu)先擴增的情況[31，33]。在檢測方法層面，目前多物種同步檢測多利用膜高通量雜交系統(tǒng)[30]，鑒于市場檢測對檢測方法便攜和快速的需求，后續(xù)研究將在此檢測方法的基礎(chǔ)上考慮多檢測線試紙條配合多組抗原抗體標記的開發(fā)以應(yīng)對多物種同步檢測。

檢測限和靈敏度是評價檢測方法的重要指標，待檢目標物、DNA 質(zhì)量及檢測方法均會對其產(chǎn)生影響。Abd El-Razik 等[24]通過將馬肉或驢肉與牛肉混合，應(yīng)用PCR 技術(shù)和電泳條帶分析研究了牛粗加工肉與馬、驢組織摻假的情況，其檢出限為0.01%。Riztyan等[23]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)結(jié)合試紙條的檢測技術(shù)對牛肉丸子中豬DNA 進行檢測，檢測限為0.01%。Qin 等[22]應(yīng)用PCR 技術(shù)和試紙條快速鑒別摻假牛肉中的鴨肉，優(yōu)化后體系檢測到的檢測限為0.05%。楊冬燕等[35]利用多重熒光PCR 鑒定羊肉摻假，檢測限最低為7%。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPA 技術(shù)結(jié)合試紙條法對單一狐貍源性成分的靈敏度為10 ng·μL-1，對羊和狐貍混合樣品的檢測限為1%，綜合市場肉品實際摻假現(xiàn)狀，該檢測限和靈敏度可基本滿足需求。

CPA 技術(shù)具有響應(yīng)迅速，設(shè)備要求低和操作容易的優(yōu)勢，尤其是對于易衰變且需在短時間內(nèi)測試的樣品具有較好的應(yīng)用潛力。但該技術(shù)中復(fù)雜的引物系統(tǒng)容易導(dǎo)致非特異性擴增，引物二聚化，以及短條帶的目標產(chǎn)物易導(dǎo)致氣溶膠污染引起結(jié)果假陽性等問題。此外，該方法設(shè)計的狐貍特異性擴增體系配合核酸檢測試紙條的檢測方法對本試驗6 種肉源以外的其他動物源性(如與狐貍親緣較近的狗、貉等犬科動物以及更多種類的常見市場肉類)的特異性擴增試驗有待進一步研究與填充，以適應(yīng)更廣的食品市場檢測應(yīng)用領(lǐng)域。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，依據(jù)狐貍源性特異性DNA 區(qū)段設(shè)計的CPA 等溫擴增體系結(jié)合一次性核酸試紙條的檢測方法對狐貍源性成分具有良好的特異性，且能夠正確檢測出狐貍和羊肉混合樣品中的狐貍源性成分。交叉引物等溫擴增技術(shù)結(jié)合一次性核酸試紙條檢測方法可應(yīng)用于動物源性成分的檢測，對單一狐貍源性成分的靈敏度為10 ng·μL-1，對混合肉制品中最低狐貍源成分檢出比例為1%。本方法可為等溫擴增技術(shù)在狐貍源性成分鑒定方面的應(yīng)用以及相關(guān)技術(shù)的研究和開發(fā)提供一定的參考，但在狐貍源性成分的微量/痕量檢測方面還需進一步研究。