許 濤 魯正釗 夏冬健 萬 菁 姜書涵 宋江華

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽 合肥 230036)

結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleraceavar.capitataL.)屬于十字花科蕓薹屬，又稱甘藍(lán)、包菜等，是在全國各地廣泛栽培并可周年供應(yīng)的重要蔬菜作物之一[1-2]。近年來，由于甘藍(lán)種植區(qū)已擴大到北方保護(hù)地，生產(chǎn)上對耐低溫的品種需求逐漸提高[3-4]。而目前耐寒甘藍(lán)材料的篩選主要以人工在低溫條件下篩選，該方法易受環(huán)境影響，選擇效率較低，給生產(chǎn)帶來巨大的損失，因而開展甘藍(lán)耐寒基因的鑒定及標(biāo)記其連鎖分子的輔助選擇，將大大提高耐寒甘藍(lán)的育種效率[5-6]。

F-box 基因家族是植物中最大的基因家族之一，根據(jù)其蛋白C 末端結(jié)構(gòu)域的不同被劃分為不同的亞家族[7-9]。F-box基因編碼的蛋白能夠調(diào)節(jié)多種多樣的生命活動，如延緩植物衰老、調(diào)控植物開花以及響應(yīng)生物脅迫、低溫和干旱等逆境脅迫[9-11]。潘櫻等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box基因BlAFB2 可能在光皮樺(Betula luminifera)低氮脅迫響應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控功能。尹恒等[13]成功從谷子中克隆到與早期耐旱響應(yīng)相關(guān)的F-box基因SiFBX。Liu 等[14]克隆了2 個F-box基因，發(fā)現(xiàn)其為sy-2 候選基因，可能與辣椒(Capsicum annuum)的溫敏性密切相關(guān)。Song 等[15]在苜蓿(Medicago sativa)中發(fā)現(xiàn)了部分F-box基因表達(dá)響應(yīng)熱脅迫誘導(dǎo)。然而，關(guān)于F-box基因參與甘藍(lán)對溫度脅迫抗逆反應(yīng)方面的研究卻鮮有報道。

本研究從結(jié)球甘藍(lán)中克隆了BoFBX117 基因cDNA 全長，分析結(jié)球甘藍(lán)BoFPB7 序列特征及BoFBX117 基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究BoFBX117 基因在結(jié)球甘藍(lán)耐寒性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以結(jié)球甘藍(lán)BoJF-16-1(JF)為試驗材料，用于克隆基因及分析基因在不同組織器官中的表達(dá)。以耐低溫品種BoZG-16-1(ZG)和低溫敏感品種BoYC-16-1(YC)為低溫脅迫處理的試驗材料。試驗材料均來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物育種工程實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫脅迫處理和取材 結(jié)球甘藍(lán)3 個品種分別采用穴盤育苗培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為12～16℃，光照時間為16 h/8 h(光照/黑暗)。對JF 品種的幼葉和蓮座期葉片、根、莖分別取樣，用于組織器官表達(dá)試驗。對ZG和YC 品種進(jìn)行低溫處理，當(dāng)植株長至6～7 片真葉時，將處理溫度設(shè)為4、2、0、-2℃，處理6、12、24 h 分別取葉片為樣品。以未處理(0 h)常規(guī)培養(yǎng)的ZG 和YC 植株葉片作為對照組(CK)。將樣品包裹在錫箔紙內(nèi)，迅速置于液氮中并儲存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因克隆 本研究前期已完成對結(jié)球甘藍(lán)F-box基因家族的鑒定，從中篩選出一個可能與低溫脅迫相關(guān)的基因BoFBX117。利用Primer Premier 5.0 設(shè)計全長引物，上 游 引物BoFBX117-F 為:ATGACTTCAGATGCTCTCAA，下游引物BoFBX117-R:TCAACTTGCCTCTTCGAACG。樣品總RNA 提取采用TRIzol 法根據(jù)RNA 快速提取試劑盒(成都百菲特科技有限公司)操作進(jìn)行，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)操作步驟合成雙鏈cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性30 s，98℃變性10 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃終延伸2 min，30 次循環(huán)。反應(yīng)體系(50 μL):2×Accurate Tap Master Mix 酶26 μL，cDNA 模板4 μL，上、下游引物各1 μL，補足ddH2O 18 μL。采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用DNA 凝膠回收試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)回收擴增產(chǎn)物，并與克隆載體pMD19-T 連接。得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單菌落培養(yǎng)，獲得重組體，用質(zhì)粒DNA 提取試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)提取質(zhì)粒并進(jìn)行質(zhì)粒PCR 鑒定，鑒定正確后的陽性菌液送北京擎科生物有限公司測序。

1.2.3 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因序列分析 將測序得到的基因序列與BrassicaDatabase ( http:/ /brassicadb.org/brad/)網(wǎng)站中下載的序列進(jìn)行比對；利用在線軟件 ProtParam ( https:/ /web. expasy. org/protparam/)分析BoFBX117 基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的多序列比對，并通過MEGA6.0 進(jìn)行蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因表達(dá)分析 通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RTqPCR)檢測BoFBX117 在結(jié)球甘藍(lán)JF 不同組織器官中的表達(dá)情況；檢測分析ZG、YC 隨著處理溫度的不同(4、2、0、-2℃，處理時間為24 h)以及在4℃條件下不同處理時間(0、6、12、24 h)該基因的表達(dá)量差異。以GAPDH為內(nèi)參基因，按照qPCR 引物設(shè)計原則設(shè)計引物，上游引物BoFBX117-F:CACAAGCAGTAAACCACA GTTC，下游引物BoFBX117-R:TGCTCTGCCAAGGTCA TAAG；上游引物GAPDH-F: GCTAACTGCCTTGCTCCA CTT，下游引物GAPDH-R:CGGCTCTTCCACCTCTCCAG T。

以結(jié)球甘藍(lán)低溫處理葉片cDNA 為模板，進(jìn)行RT-qPCR 表達(dá)差異分析。20 μL 反應(yīng)體系如下:10 μL KOD SYBR qPCR Mix、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL cDNA 溶液(已稀釋)、6 μL ddH2O。RT-qPCR 反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性，2 min；98℃變性，10 s；55℃退火，10 s；72℃延伸，1 min；循環(huán)40次。循環(huán)結(jié)束后從55℃上升至95℃，每10 s 上升0.5℃，繪制融解曲線，以檢測引物擴增的特異性。采用2-ΔΔCt法計算各樣品基因表達(dá)量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Origin 8.0 和SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖，用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因克隆

以結(jié)球甘藍(lán)JF 葉片cDNA 為模板，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了大小為936 bp 的條帶(圖1)。經(jīng)測序驗證后，獲得了目的基因的cDNA 全長。該基因位于結(jié)球甘藍(lán)5 號染色體上，命名為BoFBX117。GenBank 登錄號為XM_013731217.1。

圖1 BoFBX117 PCR 擴增電泳Fig.1 BoFBX117 PCR amplification electrophoresis

2.2 BoFBX117 編碼蛋白的序列特征

BoFBX117 基因編碼311 個氨基酸(圖2)，在第58～第105 氨基酸之間存在一個F-box 保守結(jié)構(gòu)域，屬于F-box 蛋白家族。該氨基酸序列與已登錄的其他植物的FBP7 相似性較高，命名為BoFBP7。利用ProtParam 在線工具對BoFBP7 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測分析，結(jié)果表明，化學(xué)式為C1620H2521N451O451S11，不穩(wěn)定指數(shù)為51.01，大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白[16]。分析BoFBP7 蛋白序列可知，氨基酸殘基含量最高的是Arg(R)，占比9.6%；Lev(L)和Val(V)含量其次，依次分別為9.0%和7.7%，Cys(C)含量最低，占比為1.3%，預(yù)測編碼蛋白的分子量為30.14 kDa，理論等電點為9.71。

圖2 BoFBX117 基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列Fig.2 The BoFBX117 gene sequence and its amino acid sequence

2.3 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI BLAST 檢索得到其他植物已知的FBP7 蛋白與結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 所編碼BoFBP7 蛋白的氨基酸序列。BLAST 比對結(jié)果顯示，BoFBX117所編碼蛋白BoFBP7 與同屬的蕪菁(Brassica rapa)(RID58279.1)FBP7 蛋白親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)99.36%。與同科的蘿卜(Raphanus sativus) (XP _018437435.1)、山崳菜(Eutrema salsugineum) (XP_006416265.2、)、擬南芥(Arabidopsis thaliana) (NP_564150.1)的FBP7 蛋白親緣關(guān)系也較近，分別為98.39%、96.13%和92.26%。利用DNAMAN 軟件對包括結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 蛋白在內(nèi)的13 種植物進(jìn)行序列多重比對分析，發(fā)現(xiàn)不同植物的FBP7 之間具有較高的一致性，其一致性達(dá)到85.40%(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)13 個物種的FBP7 蛋白分為三大分支，包括結(jié)球甘藍(lán)在內(nèi)的10 種植物為一個分支，其中結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 與同屬的蕪菁FBP7 蛋白親緣關(guān)系最近，屬于同一分支(圖4)。

2.4 結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因的表達(dá)分析

圖3 結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 同源蛋白的多重比對分析Fig.3 Multiple comparative analysis of BoFBP7 homologous proteins in Brassica oleracea

圖4 結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of BoFBP7 in Brassica oleracea

2.4.1BoFBX117 基因在不同組織中的表達(dá) 利用RT-qPCR 對BoFBX117 基因在結(jié)球甘藍(lán)JF 不同組織中表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BoFBX117 基因的表達(dá)具有顯著的組織特異性，其在蓮座葉中的表達(dá)量最高，是幼葉中表達(dá)量的7.3 倍；根中的表達(dá)量次之，是幼葉中表達(dá)量的7.2 倍；其次是莖，是幼葉中表達(dá)量的3.3倍；而在幼葉中表達(dá)量最低(圖5)。

圖5 BoFBX117 基因在不同組織器官中的表達(dá)Fig.5 Expression of BoFBX117 gene in different tissues and organs

2.4.2BoFBX117 基因低溫處理的表達(dá)模式分析為研究BoFBX117 基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)特性，采用不同低溫和不同時間對結(jié)球甘藍(lán)幼苗進(jìn)行處理，并對BoFBX117 基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析(圖6)。在不同低溫處理下，BoFBX117 在品種YC 中的相對表達(dá)量隨溫度降低逐步增加，在-2℃達(dá)到最大值，其表達(dá)量是對照組的4 倍。品種ZG 除2℃處理外，其余處理表達(dá)量均顯著升高，在0℃達(dá)到最大值，是CK 表達(dá)量的19.2 倍。對比分析兩品種，在CK 和-2℃處理中，ZG 的表達(dá)量顯著低于YC；而在4℃和0℃處理中，ZG 表達(dá)量顯著高于YC。結(jié)果表明，結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因的表達(dá)受低溫脅迫的誘導(dǎo)，隨著溫度降低BoFBX117 基因的表達(dá)量總體呈上升趨勢。

圖6 BoFBX117 基因在低溫脅迫處理下的表達(dá)Fig.6 Relative expression of BoFBX117 gene under low temperature

在不同脅迫時間下，品種YC 中BoFBX117 的相對表達(dá)量先增后減，在脅迫6 h 最高，是CK 表達(dá)量的3.6 倍，脅迫12 h 時表達(dá)量是CK 的1.2 倍，而脅迫24 h 時表達(dá)量較CK 下降了84%。在品種ZG 中，除脅迫12 h 基因相對表達(dá)量較CK 有所下降外，其他處理組相對表達(dá)量逐步上升，并在脅迫24 h 達(dá)到最高，是CK的3 倍。將兩品種對比分析時，YC 在脅迫6、12 h 條件下，表達(dá)量均高于ZG，而處理24 h 時，表達(dá)量顯著低于ZG。結(jié)果表明，該基因在耐脅迫品種和低溫敏感品種中存在表達(dá)差異，而在這兩個品種中的表達(dá)差異反映該基因與結(jié)球甘藍(lán)不同品種耐寒性強弱可能有密切聯(lián)系。

3 討論

在自然條件下，植物的生長會受到內(nèi)部或外部的脅迫刺激，面對這些脅迫，生物體已經(jīng)進(jìn)化出多種調(diào)節(jié)機制來協(xié)調(diào)其生命活動，其中F-box 蛋白酶體途徑是最重要的生物調(diào)節(jié)體系之一[9，17-18]。本研究應(yīng)用RTPCR 技術(shù)克隆得到BoFBX117 基因的cDNA 全長為936 bp，編碼311 個氨基酸，分子量為30.14 kDa，理論等電點為9.71。該基因編碼的BoFBP7 蛋白在N 端含有典型的F-box 結(jié)構(gòu)域，屬于F-box 蛋白家族，這種結(jié)構(gòu)域通常介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，其保守序列較少，僅有幾個位置的氨基酸殘基比較保守[19-20]。此外，結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 蛋白與同屬蕪菁的FBP7 親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99.36%。與同科的擬南芥AtFBP7 同源性也高達(dá)92.26%，這表明結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 所編碼FBP7 蛋白與其他植物的FBP7 蛋白有密切的遺傳關(guān)系。據(jù)報道，擬南芥AtFBP7 是響應(yīng)溫度脅迫的F-box 蛋白，在寒冷和高溫條件下，該蛋白表達(dá)量變化明顯[21]。推測，結(jié)球甘藍(lán)BoFBP7 蛋白可能也發(fā)揮著相似的生物學(xué)功能。

已有關(guān)于F-box基因參與擬南芥、番茄(Solanum lycopersicum)和小麥(Triticum aestivum)等植物非生物脅迫調(diào)控的研究報道。小麥中F-box基因TaFBA1 能夠響應(yīng)多種非生物脅迫[22-24]，能在植物不同器官中調(diào)控多個靶位點來優(yōu)化植物生長發(fā)育。在干旱、氧化及鹽脅迫條件下，超表達(dá)TaFBA1 的轉(zhuǎn)基因煙草生長發(fā)育情況優(yōu)于野生型。在擬南芥中MAX2 是一種多功能的F-box 蛋白，它不僅在多種信號傳導(dǎo)中起調(diào)節(jié)作用，還能調(diào)控光形態(tài)發(fā)生、響應(yīng)生物及非生物脅迫[25-27]。但在結(jié)球甘藍(lán)中相關(guān)的研究還非常有限。本研究對BoFBX117 基因在低溫脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)，這為進(jìn)一步了解該基因在響應(yīng)結(jié)球甘藍(lán)非生物脅迫中所發(fā)揮的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box基因在植物葉片發(fā)育中起作用。Baute 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，玉米(Zea mays)F-box基因ZmFBX92 在擬南芥中異位表達(dá)能夠?qū)е聰M南芥的葉片增大，而擬南芥中同源基因AtFBX92 超表達(dá)后，則觀察到相反的作用，推測可能與F-box 蛋白FBX92 影響細(xì)胞分裂導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量不同有關(guān)。Liu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，番茄中F-box基因SlGID2 的轉(zhuǎn)基因株系葉片細(xì)胞更小更緊湊，而當(dāng)其沉默后植株便出現(xiàn)矮化。本研究中，BoFBX117 基因在結(jié)球甘藍(lán)JF 幼葉和蓮座葉中的相對表達(dá)量存在顯著差異，推測在植株的生長過程中，結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因可能在調(diào)控葉片細(xì)胞分裂數(shù)量和大小方面發(fā)揮重要功能。

已有研究結(jié)果表明，低溫脅迫會誘導(dǎo)F-box基因的表達(dá)。據(jù)報道，辣椒(Capsicum annuum)F-box基因CaF-box受低溫脅迫誘導(dǎo)[30]。對雜草稻和栽培水稻低溫處理時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box基因OsF-BOX28 被誘導(dǎo)表達(dá)[31]；Wang 等[32]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥F-box 蛋白CPR1與UBC13 相互作用以響應(yīng)低溫脅迫。本研究中，結(jié)球甘藍(lán)BoFBX117 基因受低溫誘導(dǎo)，表達(dá)量隨處理溫度的降低而呈現(xiàn)上升趨勢，且在耐低溫品種和低溫敏感品種中表達(dá)量存在顯著差異，暗示BoFBX117 基因可能在結(jié)球甘藍(lán)耐寒機制中具有重要功能，這將為后續(xù)結(jié)球甘藍(lán)耐寒生理及分子機制研究提供線索和思路。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)克隆得到BoFBX117 基因cDNA，全長為936 bp，編碼311 個氨基酸，屬于Fbox 蛋白家族，該基因在結(jié)球甘藍(lán)蓮座葉中的表達(dá)量最高，根次之，在幼葉中的表達(dá)量最低，表現(xiàn)出明顯的組織特異性，且受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說明該基因可能參與植株抵御低溫脅迫的過程。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究F-box基因在結(jié)球甘藍(lán)抵御低溫脅迫中的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)，為抗逆品種篩選及提高結(jié)球甘藍(lán)等作物對低溫脅迫的適應(yīng)能力提供了思路和方向。