石磊泰 綜述，李玉華 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629

20 世紀(jì)60 年代，人們使用人二倍體細(xì)胞（human diploid cell，HDC）生產(chǎn)病毒性疫苗，如口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，該疫苗及其他病毒性疫苗已成功免疫數(shù)十億兒童，免疫結(jié)果表明，采用HDC 生產(chǎn)的疫苗安全有效［1］?？袢∈怯煽袢〔《靖腥疽鸬囊灾袠猩窠?jīng)系統(tǒng)癥狀為主的一種動(dòng)物源性傳染病，病死率幾乎100%。全球每年狂犬病死亡例數(shù)約60 000 例，主要發(fā)生在亞洲和非洲，我國(guó)為狂犬病流行國(guó)家［2-3］。疫苗是預(yù)防狂犬病最主要的手段，目前，人用狂犬病疫苗使用的細(xì)胞基質(zhì)包括鼠腦、猴腎細(xì)胞、原代地鼠腎細(xì)胞和HDC［4］，其中HDC 由于具有無(wú)致癌性、無(wú)外源因子污染、細(xì)胞性狀較穩(wěn)定等特點(diǎn)，成為WHO 認(rèn)可的更安全的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于人用疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)中。本文就HDC 在人用狂犬病疫苗中應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 HDC 的特性及建株背景

2010 年，WHO 提議以HDC 替代原代猴腎細(xì)胞用于生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗及其他病毒疫苗。與原代猴腎細(xì)胞比較，HDC 低溫保存時(shí)可保持較低的群體倍增水平，并可建立冷凍保存的細(xì)胞庫(kù)，日后可擴(kuò)展為數(shù)十年的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞來(lái)源，且不含外源因子，接種免疫缺陷動(dòng)物后不形成腫瘤［1］。

HDC 作為病毒性疫苗生產(chǎn)的主要細(xì)胞基質(zhì)之一，20 世紀(jì)60 年代，美國(guó)Wistar 研究所進(jìn)行了一系列人胚胎二倍體細(xì)胞建株培養(yǎng)工作，HAVFLICK等［5］從正常胚胎（妊娠3 個(gè)月）肺組織中提取并建立了Wistar Institute-38（WI-38）人二倍體細(xì)胞系［6］；JACOBS 等［7］于 1966 年 9 月從 1 名 14 周男性胎兒的正常肺組織中提取并建立了Medical Research Council-5（MRC-5）細(xì)胞株［8］。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物學(xué)研究所于1973 年建立了人二倍體細(xì)胞株KMB17，取材于4 月齡女胎的肺組織，體外培養(yǎng)9 個(gè)月，該細(xì)胞株至少對(duì)71 種病毒敏感且不具致癌性［9］。目前，KMB17 細(xì)胞已成功應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗、甲型肝炎減毒活疫苗、甲型肝炎滅活疫苗及腸道病毒71 型滅活疫苗的制備及研究［10-12］。2BS 細(xì)胞是北京生物制品研究所于1973 年分離建株，細(xì)胞取自3 月齡女胎的肺組織［13］。目前，2BS 株細(xì)胞主要應(yīng)用于水痘減毒活疫苗的研究及生產(chǎn)［14］。

2015 年，MA 等［15］從 1 名 3 個(gè)月胎兒的肺組織中提取了一種新的HDC 并建株，命名為Walvax-2。在Walvax-2 和 MRC-5 細(xì)胞繁殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，二者生長(zhǎng)速度、細(xì)胞活力和病毒敏感性方面存在差異，Walvax-2 細(xì)胞復(fù)制更快，48 h 的融合度與MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)72 h 的融合度相同；另外，Walvax-2 細(xì)胞在上述時(shí)間內(nèi)獲得了58 次細(xì)胞倍增，MRC-5 細(xì)胞達(dá)48 次傳代；Walvax-2 細(xì)胞培養(yǎng)病毒的滴度與MRC-5細(xì)胞相當(dāng)或優(yōu)于MRC-5 細(xì)胞。

2 HDC 在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用

美國(guó) Wistar 研究所 WIKTOR 等［16］于 1962 年開(kāi)始用狂犬病固定毒巴斯德PM-1503 3M 株在HDC的WI-38 株上適應(yīng)傳代，1965 年將第52 代適應(yīng)株制備成生產(chǎn)用主毒種。1966 年將該主毒種轉(zhuǎn)讓給法國(guó)Merieux 研究所，1969 年轉(zhuǎn)讓給德國(guó)Behring 廠，1971 年轉(zhuǎn)讓給美國(guó)Wyeth 廠。法國(guó) Merieux 研究所早期使用WI-38 細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病疫苗，隨后進(jìn)行了人二倍體細(xì)胞疫苗（human diploid cell vaccine，HDCV）的開(kāi)發(fā)研究，改用MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒，經(jīng)β-丙內(nèi)脂滅活，濃縮后制備成凍干疫苗，于1974年在法國(guó)首次獲得生產(chǎn)許可證，1978 年開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。由于純化的HDCV 接種后尚存在輕微的局部不良反應(yīng)，德國(guó)Behring 廠后續(xù)開(kāi)發(fā)了蔗糖梯度區(qū)帶離心的濃縮純化疫苗，并經(jīng)β-丙內(nèi)脂滅活，于1978 年獲生產(chǎn)許可證，接種后不良反應(yīng)率有所下降。Wyeth 廠仍采用WI-38 細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒，經(jīng)磷酸丁三脂滅活病毒，過(guò)濾濃縮后制備疫苗［17-18］。

1980 年，法國(guó)賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的HDC狂犬病疫苗（Imovax?）在美國(guó)獲批使用，該狂犬病疫苗是一種無(wú)菌、穩(wěn)定、冷凍干燥的狂犬病病毒懸浮液，由賓夕法尼亞州費(fèi)城Wistar 研究所獲得的毒株P(guān)M-1503-3M 經(jīng)MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)超濾濃縮及β-丙內(nèi)酯滅活制備而成，每劑疫苗（1.0 mL）含有少于100 mg的人白蛋白、150 μg 硫酸新霉素和 20 μg 酚紅指示劑，滅活劑β-丙內(nèi)酯含量少于0.000 05%，效力高于2.5 個(gè)國(guó)際單位的狂犬病病毒抗原［19］。HDC 狂犬病疫苗（Imovax?）上市后（1990 — 2015 年）不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，共報(bào)告1 611 例不良反應(yīng)，其中最常見(jiàn)的3 種不良反應(yīng)包括發(fā)熱（18.2%）、頭痛（17.9%）和惡心（16.5%），大部分不良反應(yīng)較輕，均為注射局部反應(yīng)、超敏反應(yīng)和非特異性體質(zhì)癥狀；93 例（5.8%）嚴(yán)重病例，其中4 例死亡與疫苗接種無(wú)關(guān)［20］。

國(guó)內(nèi)采用微載體生物反應(yīng)器成功實(shí)現(xiàn)了HDCV的規(guī)模化生產(chǎn)。2014 年，國(guó)產(chǎn)的人用狂犬病疫苗（MRC-5 細(xì)胞）在國(guó)內(nèi)獲批上市，與國(guó)外同類產(chǎn)品細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝比較，微載體技術(shù)可大幅提高細(xì)胞密度和培養(yǎng)基利用率，生物反應(yīng)器的全自動(dòng)化控制培養(yǎng)條件及全封閉管路系統(tǒng)，即使不添加抗生素，也能有效控制污染，同時(shí)降低了批間差異，提高了培養(yǎng)規(guī)模和效率，使產(chǎn)品質(zhì)量更穩(wěn)定、均一、可控［21］。

CAI 等［22］選取江蘇省淮安市漣水縣常住狂犬病感染高危風(fēng)險(xiǎn)區(qū)10 ～60 歲的健康人群，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組600 名，按“Essen”暴露后接種程序，分別于第 0、3、7、14 和 28 天經(jīng)上臂三角肌肌內(nèi)各注射1 劑疫苗，試驗(yàn)組接種國(guó)產(chǎn)凍干人用狂犬病疫苗（HDC），對(duì)照組接種進(jìn)口凍干人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）。所有受試者在每次接種后留觀30 min，觀察即時(shí)反應(yīng)，并于第 6、24、48、72 h 觀察局部和全身反應(yīng)情況。在首劑免疫前和免疫后7、14、42 d 采集全血標(biāo)本，分離血清，采用WHO 推薦的快速免疫熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）檢測(cè)血清中和抗體，計(jì)算抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率及幾何平均滴度（GMT）。結(jié)果表明，所有受試者接種疫苗后反應(yīng)輕微，均在72 h 內(nèi)恢復(fù)，未發(fā)生Ⅲ級(jí)及Ⅲ級(jí)以上不良反應(yīng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組局部反應(yīng)總發(fā)生率分別為7.67%和6.83%，全身反應(yīng)總發(fā)生率均為5.00%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。試驗(yàn)組和對(duì)照組首劑免疫后 7、14、42 d 的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為28.77%、100.00%、100.00%和28.72%、98.96%、100.00%，兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；血清中和抗體 GMT 分別為 0.274 8、19.744 3、37.575 0 IU ／ mL 和 0.247 4、17.327 4、37.723 0 IU ／ mL，兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明國(guó)產(chǎn)凍干人用狂犬病疫苗（HDC）具有良好的安全性及免疫原性。

MAO 等［23］采用 KMB17 細(xì)胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗，該疫苗是將狂犬病固定毒CTN-1V5 株連續(xù)在KMB17 細(xì)胞中傳代，以終末稀釋法篩選出滴度較高的病毒，從而篩選高適應(yīng)性，且具有良好免疫原性和傳代穩(wěn)定性的狂犬病病毒株，培育出可在KMB17 細(xì)胞中高效增殖的狂犬病疫苗毒種（CTN-DK 株）。

CHEN 等［24］為確定狂犬病病毒 PM 株在 2BS 細(xì)胞中增殖的最適MOI，將狂犬病病毒PM 株按MOI =0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 接種至 2BS 細(xì)胞中，顯微鏡觀察接種病毒后細(xì)胞的形態(tài)變化；培養(yǎng)3 ~ 5 d 后，第1 次收獲病毒液；更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 ~ 4 d 后，進(jìn)行第2 次收獲。采用小鼠腦內(nèi)滴定法測(cè)定狂犬病病毒滴度，人用狂犬病疫苗效價(jià)測(cè)定法（National Institutes of Health，NIH）測(cè)定滅活病毒液的效價(jià)。結(jié)果顯示，當(dāng)MOI 為0.05 ~ 0.10 時(shí)，細(xì)胞圓縮30% ~ 40%，細(xì)胞能維持較好的生長(zhǎng)形態(tài)，收獲液的病毒滴度較高（> 5.0 lgLD50／ mL），滅活后病毒液的效價(jià)較高（> 4.0 IU ／ mL）。

有研究采用狂犬病病毒固定毒CTN-1V 株經(jīng)昆明小鼠鼠腦回傳后，接種至Walvax-2 細(xì)胞，連續(xù)傳代，檢測(cè)各代次病毒的滴度及免疫原性。結(jié)果顯示，CTN-1V 株能較好地適應(yīng)Walvax-2 細(xì)胞，連續(xù)傳代至第 7 代，病毒滴度可達(dá) 6.78 lgLD50／ mL，并在第10 ~ 15 代內(nèi)滴度維持在 7.0 lgLD50／ mL 以上，15 ~30 代滴度約穩(wěn)定在 7.0 lgLD50／ mL。以第 15 代適應(yīng)毒株CTN-1V-HDC P15 制備疫苗原液，各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》三部（2010 版）［25］的要求，疫苗效力達(dá)6.0 IU ／ 劑以上。接毒時(shí)，采用人二倍體細(xì)胞量 ≥ 2 億，37 ℃懸浮混合吸附 30 min，MOI 為 0.05；接毒后，采用DMEM + 0.3%人血白蛋白作為病毒維持液（pH 7.8 ~ 8.0），培養(yǎng) 3 d 開(kāi)始收獲病毒液，更換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)5 及7 d，收獲病毒液，通過(guò)動(dòng)物法和細(xì)胞法測(cè)定收獲液的病毒滴度，3 次收獲液的病毒滴度均> 7.0 lg LD50／ mL。上述研究建立了穩(wěn)定的狂犬病病毒株CTN-1V 在Walvax-2 細(xì)胞株上的病毒收獲液制備工藝。所獲Walvax-2 株傳代適應(yīng)狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC，可用于人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)［26-28］。

另外，北京一家生物科技公司與法國(guó)賽諾菲巴斯德公司合作的凍干人用狂犬病疫苗（HDC）技術(shù)轉(zhuǎn)讓項(xiàng)目已落實(shí)，此項(xiàng)目受科技部2011 年度國(guó)際科技合作與交流專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)支持［29］。

3 小 結(jié)

HDC 不存在致瘤的潛在危險(xiǎn)性，且與人的抗原性一致，避免了疫苗中宿主蛋白和外源DNA 殘留的問(wèn)題，這是人用狂犬病疫苗的兩個(gè)重要質(zhì)量控制指標(biāo)［30］，排除后理論上可將疫苗引起過(guò)敏反應(yīng)的可能性降到最低，從而提高疫苗的安全性。目前，人二倍體細(xì)胞株已被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等方面的研究和實(shí)踐，特別是在病毒性疫苗的制備上，這類細(xì)胞株作為一種比較理想的細(xì)胞基質(zhì)開(kāi)始受到重視。但從人體胎兒組織中獲得合格的人二倍體細(xì)胞株是極困難的，其原因?yàn)椋簢?yán)格的倫理審查的要求；環(huán)境退化的可能性和食品安全危害均可能導(dǎo)致染色體畸變，如核型的非整倍體和多倍體的存在［31］。最重要的是，對(duì)于通過(guò)流產(chǎn)獲得合適的組織以獲得HDC 的方法要求嚴(yán)格，使獲得適當(dāng)?shù)募?xì)胞來(lái)源更困難，即使成功獲得1 株新的HDC，由于其不能維持多次傳代，可能也不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，如 IMR-9 細(xì)胞系［32-33］。由于 WI-38 細(xì)胞供應(yīng)減少，MRC-5 已成為生產(chǎn)HDCV 應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞株。但我國(guó)應(yīng)用MRC-5 細(xì)胞主要依賴于國(guó)外供應(yīng)，因此細(xì)胞進(jìn)口國(guó)家的政策將影響疫苗生產(chǎn)；另外，進(jìn)口的MRC-5 細(xì)胞通常高于20 代，其生長(zhǎng)活力的降低也將限制大規(guī)模生產(chǎn)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)多家公司也在進(jìn)行HDC 的研究，逐步建立擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人二倍體細(xì)胞株，包括北京科興中維生物技術(shù)有限公司建立的SV-1 株、北京民海生物科技有限公司建立的MHL-3 株和云南沃森生物技術(shù)股份有限公司建立的Walvax-2 株。其中，北京科興中維生物技術(shù)有限公司自建的SV-1株已通過(guò)專家認(rèn)證，用此細(xì)胞基質(zhì)研發(fā)的水痘減毒活疫苗現(xiàn)已完成臨床評(píng)價(jià)。北京民海生物科技有限公司自建的MHL-3 細(xì)胞株也已完成自檢，并通過(guò)中國(guó)食品藥品檢定研究院的復(fù)合檢定［34］。

近年，人用狂犬病疫苗產(chǎn)品質(zhì)量得到了有效提升和發(fā)展，國(guó)產(chǎn)HDCV 將帶動(dòng)國(guó)內(nèi)狂犬病疫苗產(chǎn)品升級(jí)更新，后續(xù)應(yīng)對(duì)國(guó)產(chǎn)HDCV 暴露前和暴露后免疫的安全性、免疫原性及接種程序的臨床應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。