付銘，白巖森，郭歡

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，湖北 武漢 430030

環(huán)境污染對人類健康產(chǎn)生了極為深刻的影響，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，僅2012年全球約有1 260 萬人的死亡歸因于空氣、水和土壤污染以及氣候異常變化等環(huán)境因素，占全球死亡總數(shù)的23%［1］。研究表明，環(huán)境暴露可通過表觀遺傳機制影響人體健康［2］，其中DNA 甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）作為表觀遺傳修飾的重要指標，能夠響應(yīng)多種環(huán)境因素的改變，在預(yù)測環(huán)境污染所致的疾病進程中具有現(xiàn)實意義［3］。5mC 的氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）不僅是DNA 主動去甲基化的中間產(chǎn)物，也是一種穩(wěn)定的表觀遺傳標記［4］。正常的5hmC 水平對維持細胞穩(wěn)態(tài)和個體生長發(fā)育十分關(guān)鍵，現(xiàn)已在惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病等多種重大慢性疾病中發(fā)現(xiàn)了基因組5hmC 水平的異常變化。研究提示環(huán)境因素可能通過影響基因組5hmC 的模式參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展，并且5hmC 在指示某些外界環(huán)境因素暴露導(dǎo)致的健康效應(yīng)變化方面可能比5mC 更加敏感［5］。因此，本文以5hmC 為中心，整合目前環(huán)境因素引起5hmC 改變的證據(jù)，總結(jié)5hmC 與部分重大慢性病關(guān)聯(lián)的研究現(xiàn)狀，提出尚存在的科學(xué)問題，展望研究方向，以期為環(huán)境分子流行病學(xué)研究提供新思路。

1 5hmC背景簡述

1.1 5hmC的生成與DNA主動去甲基化

5hmC 是5mC 在TET（ten-eleven translocation）蛋白的氧化作用下生成的［6］。TET 蛋白是一類α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，有TET1、TET2 和TET3 三個成員［7］。TET 將5mC 氧化為5hmC 后，還可進一步作用于5hmC 將其連續(xù)氧化成5-醛基胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC）［8］。后二者可被胸腺嘧啶DNA 糖苷酶識別并切除，形成無堿基位點，然后啟動堿基切除修復(fù)將該位點修復(fù)成未修飾的胞嘧啶［9］，從而實現(xiàn)DNA主動去甲基化過程。

由于TET 蛋白存在底物偏好性［10］，5hmC 不易被進一步氧化，因此相比5fC 和5caC，5hmC 是最豐富、最穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物，具有重大的研究意義。近年來的研究認為，5hmC 除了作為DNA 主動去甲基化的中間產(chǎn)物，通過介導(dǎo)DNA 去甲基化減輕5mC 的沉默效應(yīng)，還可以調(diào)控基因的表達［11］。已有研究報道了一些能夠識別并結(jié)合5hmC 的蛋白，如MeCP2、RPL26、MHS6、UHRF、Wdr76、Thy28、Neil1 等［12-14］，但具體的生物學(xué)作用過程尚不清晰，仍然需要更多深入的功能性研究。

1.2 5hmC在組織和基因組中的分布

5hmC 廣泛分布于哺乳動物的組織和細胞中，與5mC 不同，各組織間5hmC 的含量具有明顯的差異。Globisch 等［15］通過對成年小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，5hmC 在大腦皮層的含量最高，約占脫氧鳥嘌呤的0.7%；在脾臟中的含量最低，約0.03%；而各組織間5mC 含量差別不大，為（4.22±0.22）%。值得注意的是，5hmC 的豐度遠低于5mC，人類基因組中約80%的CpG 發(fā)生了甲基化修飾，而成人5hmC 含量最豐富的大腦組織中也僅有約13%的CpG 發(fā)生了羥甲基化［16］，這對精確檢測5hmC提出了挑戰(zhàn)。在基因組的分布上，Cui等［17］通過繪制人體19 種組織的5hmC 修飾圖譜，發(fā)現(xiàn)不同組織中5hmC 在基因組分布上的一致性：在啟動子、外顯子和增強子上富集，在基因間區(qū)和在轉(zhuǎn)錄起始位點處相對缺失。

1.3 5hmC的檢測技術(shù)

研究人員基于色譜、質(zhì)譜、高通量測序等技術(shù)開發(fā)了多種對5hmC 定量或定位的檢測方法，根據(jù)不同的研究目的，可以從基因組的三個水平上檢測5hmC。

（1）基因組總體5hmC 水平：常用的方法有薄層色譜［6-7］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［15，18］、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［19］、免疫組化［18］等。這類方法成本較低、易于開展，然而只能提供基因組5hmC 的總體平均水平，無法開展后續(xù)基因通路、分子機制的研究。

（2）基因組特定區(qū)域5hmC 水平：主要是先通過各種富集方法，如抗體、葡糖基修飾、限制性內(nèi)切酶［20］等，將含有5hmC 的DNA 片段富集后，再聯(lián)合高通量測序或芯片技術(shù)測定基因組特定區(qū)域的5hmC 分布，如羥甲基化DNA 免疫共沉淀測序（hydroxymethylated DNA immunoprecipitation coupled with deep sequencing，hMeDIP-Seq）［18］等。這類方法可以識別一些差異羥甲基化區(qū)域（differentially 5-hydroxymethyated regions，DhMRs），但對5hmC 密度低的區(qū)域檢測靈敏度較低，并不能準確測定5hmC的總量，無法達到單堿基分辨率的水平。

（3）基因組單堿基5hmC 水平：甲基化的常用檢測技術(shù)如重亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencing，BSSeq）等，并不能區(qū)分5mC和5hmC，因此研究人員開發(fā)出基于BS-Seq的TET輔助重亞硫酸鹽測序（TET-assisted bisulfite sequencing，TAB-Seq）、氧化重亞硫酸鹽測序（oxidative bisulfite sequencing，OxBS-Seq）等方法［20］，先采用不同的化學(xué)修飾手段在測序前將5hmC 與5mC區(qū)別開，然后通過比對同一樣品在化學(xué)修飾前后BS-Seq 測定的序列，從而定位5hmC。但由于重亞硫酸鹽對DNA樣本具有較強的破壞性，在樣本量少時應(yīng)用有局限性，因而研究人員又開發(fā)了借助單分子實時測序［21］和納米孔測序［22］檢測5hmC 的第三代測序技術(shù)，以及載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽耦聯(lián)表觀遺傳測序［23］、TET 輔助吡啶硼烷測序［24］等不依賴重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的新技術(shù)。這類方法可以檢測全基因組單個CpG 位點的羥甲基化狀態(tài)，能夠提供更多的生物學(xué)信息，但目前由于價格昂貴，在大樣本人群研究中比較受限。

2 環(huán)境因素暴露對5hmC水平影響的研究現(xiàn)狀

DNA主動去甲基化增強了細胞和組織的可塑性，并且為環(huán)境分子流行病學(xué)研究提供了一個新的潛在的效應(yīng)生物標志物—5hmC。5hmC 是TET 的主要氧化產(chǎn)物，故TET 蛋白表達增加或者活性增強能夠升高5hmC 的水平。由于TET 的酶促反應(yīng)需以α-KG 和O2為底物，以Fe2+和維生素C 作為輔因子，所以各底物和輔因子的濃度能夠直接影響5mC 的氧化效率［25-28］，進而影響5hmC 的水平。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素可以通過體內(nèi)的代謝過程影響上述TET 的底物和輔因子的水平從而與5hmC 關(guān)聯(lián)，也可以通過對TET基因本身或轉(zhuǎn)錄后RNA、翻譯后蛋白質(zhì)的調(diào)控來影響基因組5hmC水平［29］。

2.1 金屬和類金屬

金屬和類金屬在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中應(yīng)用廣泛，人體長時間低劑量接觸可使其在某些器官或組織中蓄積，引起慢性毒性作用。目前已有研究報道了砷、鉛、汞、鎘、鉻、鎳、銻等金屬或類金屬與5hmC 水平的關(guān)聯(lián)［30-38］，5hmC 有望成為某些金屬或類金屬暴露的效應(yīng)生物標志物。

砷是確認的人類致癌物，職業(yè)暴露可引起肺癌、皮膚癌、膀胱癌等［31］。目前已有多篇研究報道了砷對5hmC水平的影響。Zhang等［32］通過給予雄性大鼠8周較低水平（0.5、2或10 ppm）的飲用水亞砷酸鈉暴露，觀察到5hmC 的整體水平在心、肺、脾中升高，在胰腺中下降，而大多數(shù)器官的5mC 整體水平并沒有出現(xiàn)明顯的改變；作者認為這可能是由于S-腺苷蛋氨酸在低水平砷暴露時仍保持穩(wěn)態(tài)，可以同時為砷甲基化和DNA 甲基化提供甲基供體，該研究提示5hmC 也許能比5mC 更加敏感地指示砷暴露。Niedzwiecki 等［31］基于孟加拉國的兩個隊列人群（分別為196 人和375 人）檢測外周血白細胞或單核細胞DNA 的5hmC 水平，發(fā)現(xiàn)飲用水中的砷以及人體尿砷、血砷濃度與5hmC 水平的關(guān)聯(lián)具有性別差異，在男性中呈正相關(guān)，在女性中呈負相關(guān)。Du 等［33］對剛斷乳的雄性大鼠用三氧化二砷飲水染毒6 個月，發(fā)現(xiàn)砷暴露可以降低大腦皮層和海馬組織中5mC 和5hmC 的水平，損害大鼠的認知能力，并且這種神經(jīng)毒性與氧化應(yīng)激和α-KG 的水平有關(guān)。

由于多種重金屬或其化合物能夠通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，因此孕期鉛、汞、鎘、砷等重金屬的暴露對子代表觀基因組的影響是目前的研究熱點之一［34］。Cardenas 等［35］基于美國的出生隊列首次評估孕期汞暴露和子代基因組5hmC 水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)306 位孕婦孕中期時紅細胞汞濃度與新生兒臍帶血中5hmC 水平呈負相關(guān)，并且這種關(guān)聯(lián)可持續(xù)到出生后5年。Sen等［36］運用改良的羥甲基化DNA 免疫共沉淀結(jié)合450K芯片的方法檢測基因組5hmC，研究產(chǎn)前鉛暴露影響新生兒臍帶血基因組5hmC 的模式，發(fā)現(xiàn)與鉛相關(guān)的DhMRs 可以進一步分為與性別有關(guān)和無關(guān)的兩種類型。

在金屬影響5hmC的機制研究方面，Yin等［37］利用尺寸排阻色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，Ni2+可與小鼠TET1蛋白的催化中心域結(jié)合，并且其親和力是輔因子Fe2+的7.5倍，因此能有效地替換掉Fe2+，抑制TET1的催化活性，降低5hmC的形成。此外，他們還發(fā)現(xiàn)Pb2+和Cd2+也有類似的作用，但其親和力比Ni2+弱。Liu等［38］發(fā)現(xiàn)亞砷酸鹽在體外可以直接結(jié)合到TET蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)上，抑制TET介導(dǎo)的5hmC生成。

2.2 醌類化合物

醌類化合物是一類廣泛存在于環(huán)境中的氧化還原活性物質(zhì)，能夠刺激活性氧的產(chǎn)生，具有一定的細胞毒性、免疫毒性和致癌性，同時也因其對癌細胞具有極強的殺傷力而被用作抗癌藥物［28］。Zhao等［28］研究發(fā)現(xiàn)殺蟲劑五氯苯酚的活性代謝物四氯苯醌和四氯氫醌可以提高細胞內(nèi)可利用Fe2+的水平，從而刺激TET蛋白的催化活性，促進多種人源細胞株5hmC的形成。Coulter等［39］也發(fā)現(xiàn)了苯的代謝產(chǎn)物氫醌可通過提高TET1的活性，升高HEK293T細胞中的5hmC水平。

2.3 雙酚類內(nèi)分泌干擾物

雙酚A 和雙酚S 廣泛應(yīng)用于食品包裝、飲料容器、醫(yī)療器械等塑料制品的生產(chǎn)，是常見的環(huán)境雌激素，研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、胚胎發(fā)育毒性和潛在的致癌性等［40］。Zheng 等［41］對30 位雙酚A 職業(yè)暴露的男性和25 例對照進行了精子樣本的全基因組5hmC 的檢測，發(fā)現(xiàn)職業(yè)暴露者的5hmC 整體水平升高。Li 等［42］通過對人乳腺癌細胞系的研究揭示雙酚A/S 可與雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）結(jié)合使其形成二聚體和發(fā)生磷酸化，激活的ERα 可促進DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）1 和DNMT3B 甲基化TET2基因的啟動子，從而抑制TET2的轉(zhuǎn)錄和表達，降低基因組5hmC 水平，最終促進乳腺癌細胞的增殖，并具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系和劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 大氣顆粒物

大氣顆粒物是化學(xué)組成較為復(fù)雜的環(huán)境污染物，可引發(fā)呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多種器官系統(tǒng)的疾病，增加死亡風(fēng)險。Sanchez-Guerra等［43］在北京招募60名卡車司機和60 名辦公室工作人員作為研究對象，每人佩戴采樣器以評估個體PM2.5的暴露水平，并根據(jù)環(huán)境監(jiān)測點的PM10數(shù)據(jù)綜合評估個人1、4、7和14 d 的PM10平均暴露水平，采用ELISA 檢測外周血DNA 5mC和5hmC 水平，觀察到PM10與5hmC 呈穩(wěn)定的正相關(guān)關(guān)系，但與5mC 關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義，認為這可能與暴露水平、檢測方法的精確程度以及5hmC、5mC 本身具有不同的生物學(xué)功能有關(guān)。比利時魯汶大學(xué)的學(xué)者De Nys 等［44］以26 名學(xué)生的口腔頰黏膜細胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)一周內(nèi)PM2.5和PM10的平均暴露水平與細胞5hmC整體水平呈負相關(guān)。

2.5 生活方式

目前已有一些研究關(guān)注了吸煙、飲酒、鍛煉、飲食習(xí)慣等多種生活方式與TET 蛋白及5hmC 水平的關(guān)聯(lián)［45-48］。Ringh 等［45］通過對20 名吸煙和29 名不吸煙健康志愿者的支氣管肺泡灌洗液細胞進行羥甲基化的芯片檢測，發(fā)現(xiàn)吸煙者的差異羥甲基化位點幾乎均呈高羥甲基化的狀態(tài)。Gatta 等［46］基于一項25 對慢性酗酒者和非酗酒者的病例對照研究，發(fā)現(xiàn)酗酒者的小腦組織中TET1mRNA 表達水平高于對照組，但5hmC平均水平升高無統(tǒng)計學(xué)意義。Jessop 等［47］發(fā)現(xiàn)老年小鼠的自主鍛煉情況與海馬體中TET1/2mRNA 的表達水平及miR-137基因啟動子區(qū)的5hmC 水平呈正向關(guān)聯(lián)。Spallota 等［48］通過對人群、小鼠和細胞的研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飲食暴露可能會造成心臟間充質(zhì)干細胞5mC 及其氧化產(chǎn)物5hmC、5fC 累積。Wu 等［18］研究發(fā)現(xiàn)較高的葡萄糖濃度能抑制人外周血單核細胞的5hmC水平，而5mC總體水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，多種環(huán)境因素的暴露均可引起基因組5hmC水平的改變，并常具有以下共同點：（1）在相同的環(huán)境刺激下，基因組5hmC 的整體水平出現(xiàn)了明顯變化時，5mC 的整體水平尚未發(fā)生明顯改變。這提示5hmC 可能是一個比5mC 更加敏感的效應(yīng)標志物，但具體的生物學(xué)機制尚不明確；（2）環(huán)境因素暴露引起的5hmC 變化具有組織器官、細胞類型的差異，因此，在不同的研究過程中要注意所選生物樣本對目標疾病的代表性；（3）環(huán)境因素暴露引起的5hmC 變化存在性別差異。然而，目前的大多數(shù)研究僅建立了環(huán)境因素與5hmC 總體水平的關(guān)聯(lián)，未采用單堿基分辨率的方法，所以無法選出對環(huán)境敏感的特異性靶基因或者CpG 位點，限制了進一步的分子機制的解析。環(huán)境因素通過5hmC 影響特定基因表達的機制將是未來環(huán)境與健康研究領(lǐng)域的熱點之一。

3 5hmC與疾病的研究現(xiàn)狀

5hmC 的異常改變可能是引起多種疾病發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)［49］，已有研究報道了5hmC 與多種重大慢性?。ò◥盒阅[瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等）的關(guān)聯(lián)。

3.1 5hmC與惡性腫瘤

5hmC整體水平的降低是惡性腫瘤的表現(xiàn)特征之一。研究人員在肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤樣本中均發(fā)現(xiàn)了5hmC總體水平的下降［50-51］。研究發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織中的5hmC 水平可低至正常肺組織的1/5，而腦腫瘤中可降低至1/30［51］?？赡艿脑蛴校海?）TET及相關(guān)基因如IDH、WT1的突變是多種腫瘤發(fā)生的共同早期事件［25，52］，由此造成的TET 的表達減少或功能異?？赡茉斐?hmC 生成減少；（2）TET 蛋白對α-KG、O2和Fe2+的依賴性使其催化活性受細胞代謝狀態(tài)的調(diào)控［25-28］，而腫瘤細胞異常的能量代謝和氧化狀態(tài)可能抑制TET 的功能，導(dǎo)致5hmC 表達水平降低；（3）腫瘤細胞增殖較快，在不斷的DNA復(fù)制過程中，由于DNMT1具有底物偏好性［53］，難以維持胞嘧啶的羥甲基化，因此逐漸稀釋了基因組中5hmC的密度。

研究發(fā)現(xiàn)，TET 蛋白與5hmC 參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Li 等［42］、Park 等［54］、Lian 等［55］多位研究者通過在人乳腺癌、胃癌、或黑色素瘤細胞系中敲減或敲除TET 蛋白，觀察到5hmC 水平降低和細胞增殖能力提高的現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)過表達TET 蛋白可重建5hmC的水平并抑制腫瘤的生長。在5hmC 對腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制方面，Kafer 等［56］研究發(fā)現(xiàn)5hmC 富集在癌細胞系中的內(nèi)源性DNA 損傷位點以及微輻射或阿非迪霉素誘導(dǎo)的外源性DNA 損傷位點，認為5hmC 在維護基因組的完整性方面發(fā)揮著重要作用。Uribe-Lewis 等［57］的研究發(fā)現(xiàn)正常組織中基因啟動子區(qū)的5hmC 高表達可以抑制與癌癥發(fā)生相關(guān)的基因啟動子區(qū)的甲基化。Jia等［58］研究發(fā)現(xiàn)5hmC及其結(jié)合蛋白淋巴特異性解旋酶表達水平的降低與腫瘤的轉(zhuǎn)移和基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。Sun 等［59］研究發(fā)現(xiàn)TET1 可以通過調(diào)控特定基因（HOXA）啟動子的去甲基化來抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

5hmC 在腫瘤的早期診斷、預(yù)后預(yù)測和液體活檢等方面的具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。Cai 等［60］利用5hmC-Seal 技術(shù)檢測早期肝癌患者和正常人外周血循環(huán)DNA（circulating free DNA，cfDNA）中的5hmC，尋找有明顯差異的5hmC位點，隨后利用彈性網(wǎng)絡(luò)分析和十倍交叉驗證的方法對差異位點進一步篩選，利用得到的32 個位點建立肝癌的早期診斷模型，該模型在獨立樣本中驗證ROC 曲線下的面積可達88.4%。Song等［61］采用改良的hMe-Seal技術(shù)檢測7種癌癥cfDNA的5hmC，發(fā)現(xiàn)肺癌、肝癌和胰腺癌的cfDNA中顯示出不同的5hmC模式，使用機器學(xué)習(xí)算法可以準確區(qū)分這三種癌癥類型；還發(fā)現(xiàn)5hmC水平隨著肺癌的進展呈階段性下降，且cfDNA的5hmC水平可用于肝癌患者的治療和復(fù)發(fā)情況的監(jiān)測。隨著研究的不斷深入，5hmC在腫瘤領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價值正在逐步被發(fā)掘。

3.2 5hmC與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

腦組織中存在豐富的5hmC，因此其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能引起了研究人員們的關(guān)注。研究表明，5hmC參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程，且與雷特綜合癥、孤獨癥等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病以及阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、亨廷頓病、帕金森等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)［62］。Coppieters 等［63］通過免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)與健康對照人群相比，AD 患者額葉中回以及顳中回的5mC 和5hmC 水平增加，且其增加的幅度與AD 的病理分子標志（β-淀粉樣蛋白、tau 蛋白和泛素蛋白）呈正相關(guān)。Fetahu 等［64］將AD 患者和健康對照來源的誘導(dǎo)性多能干細胞逐步誘導(dǎo)分化成皮層神經(jīng)元，然后通過OxBS-Seq 和甲基化酶輔助亞硫酸氫鹽測序法以單堿基分辨率繪制全基因組5mC、5hmC、5fC/5caC 的分布情況，得到了能夠在獨立的臨床隊列中印證的、與AD相關(guān)的27 個區(qū)域和39 個CpG 位點，證明5mC 及其氧化產(chǎn)物的改變發(fā)生于疾病進展前。由于高度分化的神經(jīng)元幾乎不會分裂，因此無法通過依賴細胞復(fù)制的被動去甲基化機制去甲基化，所有甲基的消除幾乎都需要主動去甲基化，5hmC 作為主動去甲基化的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，有可能成為AD 早期診斷的一大突破。

3.3 5hmC與心血管疾病

越來越多的研究在心血管疾病中發(fā)現(xiàn)TET 和5hmC 的異常改變。Jiang 等［65］研究發(fā)現(xiàn)113 位病人外周血單核細胞的5mC 和5hmC 水平與頸動脈斑塊的嚴重程度呈正相關(guān)；且校正混雜因素后，僅發(fā)現(xiàn)5hmC（而不是5mC）是冠狀動脈粥樣硬化的危險因素。Liu 等［66］研究發(fā)現(xiàn)TET2 和5hmC 在收縮型的血管平滑肌細胞中富集，而在去分化型的平滑肌細胞中缺失，且其缺失程度與小鼠的血管損傷程度和動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)；在體內(nèi)，局部過表達TET2 可恢復(fù)5hmC 的水平和收縮相關(guān)基因的表達，并減輕內(nèi)膜增生。此外，除了調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換，5hmC 還可能參與動脈粥樣硬化病變過程中血管內(nèi)皮細胞的程序性死亡、免疫細胞的分化等過程［67］。

近年來，DNA 羥甲基化與多種重大慢性病的研究取得了一定的進展，5hmC 的高度組織特異性和敏感性為闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機制，開發(fā)早期診斷技術(shù)和發(fā)現(xiàn)有效干預(yù)靶點提供了極具前景的表觀遺傳學(xué)新策略。然而，目前關(guān)于5hmC 的流行病學(xué)研究通常樣本量較小，今后還需要開展大規(guī)模、多中心的前瞻性研究來確定與重大慢性病相關(guān)的5hmC 位點，并在精細設(shè)計的體內(nèi)外實驗中探討其生物學(xué)機制。

4 5hmC在環(huán)境暴露與疾病間關(guān)聯(lián)的作用

5hmC 不僅受到環(huán)境因素的影響，也與多種慢性病的發(fā)生有關(guān)，因此5hmC 作為表觀遺傳學(xué)的重要指標，在連接環(huán)境暴露與疾病發(fā)生過程中可能發(fā)揮“橋梁”作用。Li 等［42］基于雙酚類內(nèi)分泌干擾物與乳腺癌的流行病學(xué)背景，研究發(fā)現(xiàn)雙酚A 和雙酚S 可通過激活ERα，上調(diào)DNMTs 的表達，進而提高TET2基因啟動子的甲基化水平，使TET2表達水平和基因組5hmC 水平降低，最終促進乳腺癌細胞的增殖，建立了環(huán)境污染物-TET2-5hmC-細胞增殖之間的關(guān)聯(lián)。Wu 等［18］在多種人源腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)可抑制腺苷酸活化蛋白激酶對TET2 蛋白的磷酸化作用，使TET2 蛋白不穩(wěn)定，5hmC 水平下降，細胞增殖能力增強；并結(jié)合hMeDIP-seq、基因表達譜芯片、RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)和驗證了高糖環(huán)境下與DhMR 相關(guān)的上調(diào)原癌基因和下調(diào)抑癌基因；該研究將細胞外葡萄糖濃度與5hmC 的動態(tài)調(diào)節(jié)、腫瘤細胞的增殖聯(lián)系起來，描述了一個從營養(yǎng)環(huán)境改變到出現(xiàn)健康效應(yīng)的表觀遺傳學(xué)機制。隨著環(huán)境分子流行病學(xué)研究的不斷深入，今后將會有更多關(guān)于5hmC 在環(huán)境暴露與疾病間關(guān)聯(lián)的研究報道。

5 總結(jié)和展望

DNA 羥甲基化作為新興的表觀遺傳學(xué)標志物，能夠敏感指示環(huán)境暴露的生物效應(yīng)，在環(huán)境分子流行病學(xué)中逐漸受到重視。盡管已有大量研究將5hmC 整體水平的變化與環(huán)境暴露或疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，但是5hmC 的生物學(xué)功能還沒有被完全認識，多種環(huán)境因素復(fù)合暴露如何誘導(dǎo)5hmC 譜的變化也尚不清楚。因此，在今后的體內(nèi)外功能研究中，發(fā)展準確靈敏且低成本的單細胞組學(xué)分析技術(shù)，并結(jié)合位點特異性的5hmC 修飾技術(shù)，實現(xiàn)單個位點的5hmC 的寫入或擦除，將有助于進一步揭示5hmC 的生物學(xué)功能；在大樣本前瞻性隊列研究中，將暴露組、表觀遺傳組、基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等多組學(xué)生物技術(shù)結(jié)合起來，有助于進一步明確與疾病有關(guān)聯(lián)的5hmC 位點，闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機制，探索有效的早期診斷標志物。