李 洪，陸清平，陳 映，王妹妹，莫?；?，王會(huì)玉, 郝曉柯

1.瓊海市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南 瓊海 571400;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安 710032

γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assays，IGRAs)選用外周血作為樣本，并應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌特異抗原早期分泌抗原靶6與培養(yǎng)濾液蛋白10進(jìn)行檢測(cè)，不受卡介苗接種、非結(jié)核分枝桿菌感染的影響，提高了檢測(cè)的敏感度和特異性，可以用于結(jié)核病的輔助診斷與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測(cè)[1]。目前，國(guó)際上較成熟的IGRAs有酶聯(lián)免疫法檢測(cè)與酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)檢測(cè)。腫瘤壞死因子α是一類導(dǎo)致自身免疫性及抗菌性炎癥疾病的關(guān)鍵細(xì)胞因子[2-3]。糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克等作用，是風(fēng)濕性疾病、自身免疫病的最基本的治療藥物之一[4-5]。地塞米松是一類常用的長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素。IGRAs基于體外釋放試驗(yàn)，通過檢測(cè)釋放γ-干擾素的特異T細(xì)胞的數(shù)量或特異T細(xì)胞釋放的γ-干擾素的濃度輔助診斷，而免疫抑制劑的使用可能會(huì)影響T細(xì)胞活性，從而導(dǎo)致假陰性[6]。本研究旨在探討腫瘤壞死因子拮抗劑、糖皮質(zhì)激素、結(jié)節(jié)對(duì)IGRAs檢測(cè)結(jié)果的影響，以期為該類方法在綜合性醫(yī)院各科室結(jié)核感染的篩查提供實(shí)際的參考價(jià)值和應(yīng)用思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取瓊海市人民醫(yī)院2019年1—10月進(jìn)行IGRA檢測(cè)的221例患者為研究對(duì)象。其中陽性124例，陰性97例。在陽性患者中排除已知的免疫缺陷、接受過免疫抑制藥物治療或糖尿病患者后，隨機(jī)選取104例(男性55例，女性49例)作為藥物影響試驗(yàn)標(biāo)本。

1.2 研究方法 所有患者采集肝素抗凝血8 ml后，進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離與提取。將收集的細(xì)胞懸液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保每100 μl細(xì)胞懸液含25萬個(gè)細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置陰性對(duì)照N、陽性對(duì)照P及兩個(gè)刺激抗原管TA、TB，分別加入相應(yīng)抗原及細(xì)胞懸液后按說明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。將104例標(biāo)本隨機(jī)分為4組，每組各26例。對(duì)照組，PBMCs中均不添加任何藥物；地塞米松組，PBMCs中添加2.0 μg/ml地塞米松[7]；英夫利昔單抗組，PBMCs中添加5.0 μg/ml英夫利昔單抗[8]；依那西普組，PBMCs中添加1.5 μg/ml依那西普。根據(jù)不同年齡將221例患者分為年齡<15歲組(n=34)、16～30歲組(n=35)、31～45歲組(n=33)、46～60歲組(n=35)、61～75歲組(n=52)、年齡>75歲組(n=32)。根據(jù)不同科室將221例患者分為呼吸內(nèi)科組(n=83)、內(nèi)分泌風(fēng)濕免疫科組(n=32)、感染性疾病科組(n=33)、腫瘤-血液-普通內(nèi)科組(n=28)、兒科組(n=16)、消化內(nèi)科組(n=29)。分析并比較不同年齡、科室患者的ELISPOT陽性率。

1.3 結(jié)果判斷 陽性：陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6，且抗原A/抗原B檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，且抗原A/抗原B檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。陰性：不符合陽性判定結(jié)果，且陽性對(duì)照孔結(jié)果正常。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對(duì)ELISPOT的影響 地塞米松組、英夫利昔單抗組均有1例陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)為陰性，而對(duì)照組和依那西普組均為陽性。對(duì)照組、地塞米松組、英夫利昔單抗組、依那西普組平均斑點(diǎn)數(shù)分別為(61.5±10.4)個(gè)、(60.8±10.5)個(gè)、(57.5±9.8)個(gè)、(61.3±10.8)個(gè)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 不同年齡、科室患者ELISPOT陽性率比較 年齡<15歲組、16～30歲組、31～45歲組、46～60歲組、61～75歲組、年齡>75歲組患者ELISPOT陽性率分別為5.9%(2/34)、31.4%(11/35)、33.3%(11/33)、34.3%(12/35)、28.8%(15/52)、28.1%(9/32)。年齡<15歲組患者ELISPOT陽性率顯著低于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。呼吸內(nèi)科組、內(nèi)分泌風(fēng)濕免疫科組、感染性疾病科組、腫瘤-血液-普通內(nèi)科組、兒科組以及消化內(nèi)科組患者的ELISPOT陽性率分別為34.9%(29/83)、25.0%(8/32)、30.3%(10/33)、25.0%(7/28)、6.3%(1/16)、17.2%(5/29)。其中，呼吸內(nèi)科組的ELISPOT陽性率最高，兒科組的陽性率最低。呼吸內(nèi)科組的ELISPOT陽性率顯著高于兒科組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)步與免疫學(xué)的不斷發(fā)展，IGRAs的應(yīng)用為結(jié)核病診斷開辟了新途徑，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備要求低、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)[9]。有研究報(bào)道，地塞米松或英夫利昔單抗治療的患者進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)均有假陰性風(fēng)險(xiǎn)，但由于進(jìn)行IGRAs的方法不同，結(jié)果受藥物影響的程度有所不同[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),地塞米松組、英夫利昔單抗組均有1例陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)為陰性；對(duì)照組、地塞米松組、英夫利昔單抗組、依那西普組平均斑點(diǎn)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果表明，ELISPOT法更不易受糖皮質(zhì)激素類藥物及腫瘤壞死因子拮抗劑的影響，結(jié)果更可靠。

本研究結(jié)果顯示，年齡<15歲組患者ELISPOT陽性率顯著低于16～30歲組、31～45歲組、46～60歲組、61～75歲組、年齡>75歲組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；呼吸內(nèi)科的ELISPOT陽性率最高，兒科的陽性率最低，且呼吸內(nèi)科組的ELISPOT陽性率高于兒科組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，兒童群體的ELISPOT的假陰性發(fā)生的概率較大，這可能是由于兒童自身的免疫力低下，ELISPOT檢測(cè)在出現(xiàn)不確定結(jié)果的比例明顯升高，與卜范峰等[12]研究結(jié)果一致。因此，兒童肺結(jié)核患者臨床診斷過程中仍應(yīng)重視病史、臨床表現(xiàn)、胸部CT征象及變化，重視痰結(jié)核菌涂片及痰結(jié)核菌培養(yǎng)等基礎(chǔ)檢測(cè)手段，應(yīng)反復(fù)多次送檢，不能因其陽性率低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)而否定其重要性。本研究樣本量有限，仍需大樣本研究加以證實(shí)。

綜上所述，ELISPOT受糖皮質(zhì)激素與腫瘤壞死因子拮抗劑的影響不大，其檢測(cè)結(jié)果容易受年齡的影響，對(duì)于兒童患者ELISPOT陰性需謹(jǐn)慎對(duì)待。