馬小鵬 綜述 張華楸 審校

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）具有較高的發(fā)病率和病死率，是青壯年最常見的死亡和殘疾原因。全球每年約有5 000 萬例TBI，年經濟損失約4 000 億美元，占世界生產總值的0.5%[1]。TBI 后神經組織的損傷和修復是一個復雜的病理生理過程，多種細胞參與其中，其中外泌體介導的細胞間信號傳導和相互調控具有重要意義。

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）來源于骨髓和外周血管壁，是血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）的前體細胞[2]。當組織缺血或血管內皮損傷時，EPCs被組織釋放的損傷信號動員后進行遷移，前往內皮損傷部位參與修復[3]。EPCs分為早期和晚期EPCs，活化的早期EPCs 表達豐富的炎性細胞因子和旁分泌血管生成因子，以旁分泌外泌體的方式招募更多的EPCs 和ECs 形成微血管[4]，是損傷后的快速反應結果。早期EPCs 的來源是外周血管壁，外周血EPCs 含量極少，只占外周細胞的0.01%。晚期EPCs通過增殖、遷移、定位到受損內皮處，分化成血管ECs 并整合到血管網絡中[5，6]。晚期EPCs的來源是骨髓中的EPCs。早期EPCs和晚期EPCs 的作用方式具有差異，提示EPCs 可能具有不同的治療作用。已有研究發(fā)現(xiàn)TBI 后EPCs 分泌的外泌體對腦微血管修復和改善預后具有有益影響[7]。

外泌體是介導細胞間通訊的小囊泡，有類似細胞膜的磷脂雙分子層，為內部的小分子物質提供了較穩(wěn)定的環(huán)境。外泌體是一種理想的載體，可將mRNA、miRNA或蛋白質運送到受體細胞中，而不會在循環(huán)中被酶消化。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，EPCs外泌體的外觀結構呈橢圓形膜性囊泡，較多的EPCs外泌體聚集在一起呈葡萄狀排列，大小不等，納米顆粒跟蹤分析顯示平均直徑為120 nm。近期的研究發(fā)現(xiàn)囊泡因內容物不同呈現(xiàn)出不同透亮度，其主要成分為mRNA 和蛋白分子[6]。對早期EPCs外泌體進行免疫印跡試驗分析，發(fā)現(xiàn)其能高強度表達CD9、CD63 和熱休克蛋白70[7]。

EPCs 作為TBI 后外泌體來源的主要途徑之一，其作用和意義逐步為人們所認識。本文就EPCs 外泌體在TBI中的作用研究進展進行綜述。

1 EPCs分泌的外泌體在TBI中的作用

1.1 修復損傷的血腦屏障TBI常伴隨血腦屏障的破壞。血腦屏障由多種細胞和神經元構成，其中毛細血管壁的ECs 具有細胞間緊密連接蛋白，構成血腦屏障的主要結構基礎。在生理條件下，血腦屏障為腦組織選擇性通透營養(yǎng)物質，同時保護腦組織不受有毒物質侵害，確保中樞神經系統(tǒng)功能正常執(zhí)行。

內皮集落形成細胞（endothelial colony forming cell，ECFC）是從人臍帶靜脈血中分離得到的早期特異性EPCs。Gao 等[7]從ECFC 條件培養(yǎng)基中分離出ECFC 外泌體并用細胞膜染劑PKH67 標記后，靜脈輸入TBI小鼠體內，12 h后觀察到ECFC外泌體被大鼠微血管ECs 高效攝??；傷后24 h，ECs 向創(chuàng)面的遷移量顯著升高；不同含量ECFC 外泌體預處理ECs后，顯著增加緊密連接蛋白的表達。這說明ECFC可能通過旁分泌的方式刺激ECs的增殖和遷移。有研究報道等[8，9]從人臍血中分離單核細胞培養(yǎng)擴增為ECFC，靜脈注射到TBI 小鼠體內24 h 后，熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)在受傷的大腦中檢測到標記的ECFC，明顯減輕腦水腫程度，增加緊密連接蛋白的表達；小鼠運動能力、空間獲取和參考記憶能力顯著改善。這表明ECFC在TBI后可以直接定位到損傷部位，參與新血管形成并改善神經功能。因此，TBI后ECFC兼有早期EPCs 和晚期EPCs 的特征。ECFC 既通過外泌體的方式促進受損血管內皮的修復，其本身又可定位至受損部位，分化成ECs整合到血管網絡中。

1.2 促進血管內皮的修復TBI 導致ECs 損傷，使血管平滑肌細胞增殖，常會導致微血管狹窄。Kong 等[10]發(fā)現(xiàn)在大鼠頸動脈球囊損傷模型中，EPCs 外泌體能抑制新生內膜的過度增生，對ECs 修復起到保護作用。Li等[11]在大鼠頸動脈內皮損傷模型中用熒光染料標記EPCs并收獲其釋放的外泌體，標記的外泌體與ECs 共培養(yǎng)后，外泌體被捕獲并轉移到ECs 的核周區(qū)域，顯著增強ECs 的增殖。Hu 等[12]進行RNA測序發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在EPCs外泌體中高度富集，并特異性抑制受體ECs中血管生成抑制因子血栓反應蛋白-1的表達。

1.3 抵抗缺氧 李羅成等[6]發(fā)現(xiàn)低氧可引起ECs損傷，體外缺氧環(huán)境處理的人臍靜脈ECs 增殖、遷移能力下降，凋亡細胞比例上升；EPCs 外泌體顯著改善缺氧條件下ECs 增殖、遷移能力。Wang 等[13]用小鼠骨髓中分離的單核細胞，在體外饑餓應激培養(yǎng)基中培養(yǎng)EPCs并提取饑餓應激EPCs外泌體明顯提高血管ECs 一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和NO 水平，保護血管ECs 免受缺氧誘導的活性氧族的影響；同時，PI3K 抑制劑可以消除饑餓應激EPCs 外泌體的這些保護作用。這提示饑餓應激EPCs外泌體通過PI3K/eNOS/NO通路發(fā)揮作用。

2 調控EPCs外泌體分泌的因素

2.1 血糖水平 研究發(fā)現(xiàn)高血糖抑制EPCs 外泌體的釋放和相關基因的表達[14，15]，使TBI病人血液中EPCs數(shù)量減少。當暴露于高葡萄糖時，人臍帶ECs 的活力和成管能力顯著降低，而衰老細胞的比例則明顯增高。Hassanpour等[14]將人骨髓來源的EPCs分別與糖尿病和健康人的血清共培養(yǎng)后，糖尿病組EPCs外泌體數(shù)量較對照組顯著減少，與外泌體分泌和運輸?shù)南嚓P基因表達下調。這提示糖尿病對EPCs 分泌外泌體的效率產生不利影響。

2.2 孕激素Li等[16]制備小鼠TBI模型后腹膜內給予孕激素，發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs水平增加，受傷腦組織CD34和CD31 陽性細胞的數(shù)量和血管密度增加。這表明TBI后孕激素可顯著改善神經功能并促進血管重塑。

2.3 運動鍛煉Ma等[17]分別從久坐和低、中度運動組小鼠中分離血漿EPCs外泌體，用高糖和缺氧誘導的ECs損傷模型與三組EPCs外泌體共培養(yǎng)研究ECs的保護因素，結果發(fā)現(xiàn)EPCs 水平和EPCs 外泌體在中度運動小鼠體內的釋放率明顯增高；運動組EPCs含量及其釋放的外泌體miR-126的表達明顯增高。這提示運動可能通過增加EPCs 外泌體的釋放和外泌體中miR-126的含量增強對ECs的保護作用。

綜上所述，TBI 后腦血管內皮組織損傷、缺血釋放多種細胞因子，活化的早期EPCs通過旁分泌外泌體作用于ECs，并招募更多的EPCs 促進組織修復。當骨髓中的EPCs 受各種因素的刺激后開始動員向外周血遷移形成晚期EPCs，增加外周血中EPCs 的數(shù)量并分化成血管ECs 修復損傷。EPCs 外泌體的保護作用表現(xiàn)為修復損傷的血腦屏障、促進血管內皮的修復和幫助ECs 抵抗缺氧損傷。EPCs 作為干細胞移植的替代治療方案，具有促進血管再生作用[18]。由于免疫排異等問題，EPCs 的臨床應用十分有限[19]。EPCs外泌體具有與EPCs相似的作用，但其主要成分是不具有免疫原性的小分子核酸，因此，EPCs 外泌體有望成為改善TBI 預后的治療手段[20]。近年來，EPCs被發(fā)現(xiàn)對神經修復和腦血管再生具有重要意義[21～23]，但EPCs 外泌體是否具有其父本EPCs的這一重要作用尚待更多研究證實。