許瑤函 綜述 韓偉 審校

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院眼科，杭州 310003

青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)進行性死亡及其軸突慢性退化為特征的神經(jīng)退行性疾病，是全球主要的致盲眼病之一[1]。原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是常見的青光眼類型，常伴有眼壓升高，小梁網(wǎng)功能障礙導致房水流出受阻是其致病因素之一[2]。病理性眼壓升高是青光眼發(fā)生視神經(jīng)損害的主要危險因素。眼壓升高通過直接壓迫視盤區(qū)域?qū)ζ湓斐蓹C械性損害，同時導致該區(qū)域血流灌注減少，發(fā)生氧化應激和能量供應障礙等。降低眼壓是目前臨床上延緩青光眼病程的有效治療手段[3]。然而現(xiàn)有的臨床資料表明，青光眼患者眼壓即使正?；蛲ㄟ^治療得到良好控制后，仍會發(fā)生持續(xù)性視神經(jīng)損傷，這說明青光眼不僅與眼壓升高有關(guān)，還可能包含獨立的神經(jīng)變性成分[3-5]。近年來自噬受到研究者的廣泛關(guān)注，其在青光眼相關(guān)領(lǐng)域的研究也逐漸增多[6-8]。本文對自噬在青光眼發(fā)病機制中的最新研究進展進行綜述。

1 自噬

1.1 自噬的定義及分類

自噬是在進化上高度保守的復雜生理過程，是一種細胞降解、回收機制。自噬可以降解異常的細胞器及長壽蛋白，并將氨基酸、脂肪酸等大分子成分回收利用作為新的能源供應，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)。在饑餓、缺氧等條件刺激下，自噬會被迅速激活[9]。過度自噬或自噬受損均可能導致細胞功能障礙，甚至死亡[10]。自噬在哺乳動物細胞中根據(jù)底物與溶酶體結(jié)合方式的不同分為經(jīng)典自噬(巨自噬)、微自噬、分子伴侶介導自噬(chaperon-assisted autophagy，CASA)和RNA自噬等。本文中所指自噬為巨自噬，以形成雙層膜自噬體為特征[11]。隨著對自噬研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)自噬對降解底物具有高度選擇性，除非選擇性自噬外，自噬可特異性作用于多種細胞器和細胞質(zhì)成分，如線粒體、核糖體及錯誤折疊的蛋白等[12]。

1.2 自噬的調(diào)控

自噬信號通路的精細調(diào)控在細胞應對不同的環(huán)境變化時起重要作用。自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，Atg)的編碼蛋白參與自噬誘導、起始、延伸、自噬體形成及與溶酶體融合的全部步驟[13]。此外，自噬的分子機制復雜，可與其他相關(guān)信號通路發(fā)生相互作用。例如當哺乳動物雷帕霉素受體(mammalian target of rapamycin，mTOR)被抑制時，其下游的ULK1(UNC51-like kinase，與酵母中的Atg1同源)可被激活，啟動自噬[14]。再如，beclin-1(Atg6)可接受多種信號調(diào)節(jié)自噬通路。生理條件下，抗凋亡蛋白bcl-2或bcl-XL與beclin-1的結(jié)合能力強，通過負調(diào)控Vps34/PI3K-beclin-1復合體的形成，抑制了依賴beclin-1的自噬通路[15]。當自噬被誘導時，beclin-1發(fā)生蛋白磷酸化，與bcl-2或bcl-XL解離，進而啟動自噬[16]。

自噬體膜的延長與閉合階段涉及2類泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)：(1)Atg12與Atg5通過E1、E2泛素樣酶形成共價結(jié)合，進而與Atg16發(fā)生相互作用形成Atg12-Atg5-Atg16復合體。同時該復合體也為微管相關(guān)蛋白的輕鏈3(LC3/Atg9)與磷脂酰乙醇胺的共價結(jié)合提供了平臺。(2)LC3蛋白被Atg4B切割后，產(chǎn)生定位于細胞質(zhì)的LC3Ⅰ，LC3Ⅰ被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾加工脂化，產(chǎn)生LC3Ⅱ，并定位在自噬體[6,17]。LC3Ⅱ被認為是自噬的特異性標志物，因此也被廣泛應用于自噬流水平的檢測[18]。p62(sequestosome 1，SQSTM1)是一種重要的自噬接頭蛋白，含有與LC3相互作用的結(jié)構(gòu)域，可將泛素化底物帶入自噬體內(nèi)，最終在溶酶體內(nèi)降解[19]。p62積累增多意味著自噬過程受到阻滯，所以p62蛋白水平常作為自噬流的檢測指標之一[19]。

2 自噬與小梁網(wǎng)細胞

小梁網(wǎng)是位于前房角的角膜和鞏膜之間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由內(nèi)皮樣細胞包繞的小梁彈性蛋白、膠原蛋白及小梁網(wǎng)細胞組成[20]。小梁網(wǎng)細胞分化成熟后增生能力較低，因此有效清除細胞內(nèi)的受損蛋白和錯誤折疊蛋白對小梁網(wǎng)細胞的生存非常關(guān)鍵[20]。小梁網(wǎng)細胞可通過誘導或抑制自噬應對不同壓力刺激，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)。

2.1 自噬在氧化應激過程中對小梁網(wǎng)細胞的作用

小梁網(wǎng)組織對自噬及氧化應激的敏感度隨著年齡的增加而升高。Pulliero等[27]收集了28例健康捐獻者的新鮮小梁網(wǎng)組織，通過檢測發(fā)現(xiàn)年齡大于60歲捐獻者的p62蛋白水平低于40～59歲捐獻者，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平及DNA氧化損傷水平增高，表明人小梁網(wǎng)組織中自噬與氧化應激水平均隨年齡的增加呈升高趨勢。此外，衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(senescence-associated-beta-galactosidase，SA-β-Gal)隨著年齡的增加在溶酶體中積累增多[28]。Porter等[23]發(fā)現(xiàn)在慢性氧化應激環(huán)境下，小梁網(wǎng)細胞中SA-β-Gal活化增多，而用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可減少SA-β-Gal的活化，說明自噬參與調(diào)控SA-β-Gal的活性。以上研究結(jié)果表明，氧化應激造成的自噬受損可能是導致小梁網(wǎng)細胞隨著年齡增長功能逐漸失調(diào)的因素之一，是重要的POAG發(fā)病機制。近來，Porter等[29]發(fā)現(xiàn)青光眼患者的小梁網(wǎng)細胞在慢性氧化應激環(huán)境下直接作用于mTOR磷酸化位點Thr389(pRPS6KB-T389)，其下游底物RPS6KB磷酸化水平顯著提高，并且LC3Ⅱ及p62蛋白表達水平下降，說明青光眼患者小梁網(wǎng)中自噬活動被抑制，甚至被破壞。以上實驗的結(jié)論雖然看似矛盾，實際可能互為補充性實驗結(jié)果，氧化應激誘導的自噬可能是正常小梁網(wǎng)細胞中的一種早期保護性機制。隨著長期的氧化應激反應，發(fā)生溶酶體堿化及自噬功能下降，最終導致小梁網(wǎng)細胞功能失調(diào)。

2.2 自噬在機械性刺激過程中對小梁網(wǎng)細胞的作用

小梁網(wǎng)細胞可以感知和適應眼壓波動帶來的機械性刺激，從而維護細胞功能及眼內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬在小梁網(wǎng)細胞被拉伸后30 min即被激活，說明自噬可能是小梁網(wǎng)細胞受到機械刺激后誘發(fā)的生理反應，而不是由于細胞形態(tài)變化后產(chǎn)生的繼發(fā)性反應[29]。機械拉伸小梁網(wǎng)細胞可激活mTOR通路，抑制自噬。由此推斷，小梁網(wǎng)細胞中還存在另一種非mTOR通路依賴的自噬途徑，可以抵消由于mTOR活化產(chǎn)生的抑制自噬作用[30]。Shim等[31]進一步研究發(fā)現(xiàn)初級纖毛可作為循環(huán)機械拉伸誘導自噬的機械感受器，主要通過AKT1及非經(jīng)典SMAD2/3信號通路相互作用參與調(diào)節(jié)自噬。CASA是一種選擇性自噬，其中CASA復合物由HSC7、HSPB8和BAG3組成。研究發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)雙軸拉伸不能激活CASA[30]，而在循環(huán)機械拉伸(伸長20%，1個循環(huán)/s)的環(huán)境中CASA被激活[32]。此外，BAG3參與了經(jīng)典自噬和非經(jīng)典自噬，這說明機械刺激誘導可能同時誘導發(fā)生了經(jīng)典和非經(jīng)典自噬[33]。

機械壓力誘導發(fā)生自噬在病理生理學方面的意義尚不清楚。自噬可能通過增加蛋白質(zhì)和細胞器通量，同時影響其他代謝過程，共同維持細胞和組織功能，幫助小梁網(wǎng)細胞及小梁組織應對機械壓力[33]。自噬通常被當作一種保護性機制，然而，當機械壓力超過正常眼壓波動范圍，造成病理性高眼壓環(huán)境，則會導致自噬功能失調(diào)，造成細胞凋亡，甚至發(fā)生自噬性細胞死亡[24]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CASA有補償性降壓功能，但持續(xù)激活CASA可能造成小梁網(wǎng)細胞硬度增加，影響房水回流[34-36]。

3 自噬與視神經(jīng)

RGCs是視網(wǎng)膜上唯一的投射神經(jīng)元，其軸突構(gòu)成視神經(jīng)，視網(wǎng)膜產(chǎn)生的視覺信息經(jīng)視神經(jīng)傳送至大腦。眼壓升高、視神經(jīng)區(qū)域血流灌注減少等病理變化均會導致RGCs凋亡及其軸突慢性退化，最終造成不可逆的視野缺損及視力下降。近年來，青光眼中自噬與RGCs胞體及其軸突的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注。

3.1 自噬在高眼壓環(huán)境下對RGCs的作用

缺血-再灌注動物模型可以模擬前房急性眼壓升高。Piras等[37]和Produit-Zengaffinen等[38]在缺血-再灌注動物模型中發(fā)現(xiàn)，抑制自噬對RGCs有保護作用。Russo等[39]在實驗中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜急性缺血-再灌注引起的自噬反應是雙相的。視網(wǎng)膜缺血損傷后可誘導自噬水平升高，這一現(xiàn)象可持續(xù)至再灌注后1 h，之后自噬水平逐漸下降。通過雷帕霉素增加自噬水平可減少RGCs死亡。Lee等[40]通過角膜緣縫線建立大鼠高眼壓模型，并在實驗中發(fā)現(xiàn)不同時間點自噬活性不同，早期自噬受損，1～4周自噬通量增加。同時，早期在玻璃體腔內(nèi)注射雷帕霉素可提高RGCs存活率。在慢性眼壓升高時，自噬在軸突和胞體內(nèi)扮演的角色不同。Park等[41]在大鼠中通過灼燒鞏膜上靜脈建立慢性高眼壓模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ及自噬體在造模后1～4周逐漸增多，并且RGCs軸突先于胞體出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。通過玻璃體腔內(nèi)注射3-MA可使RGCs凋亡顯著減少[42]。與之相反，Kitaoka等[43]在大鼠小梁區(qū)域行激光手術(shù)使眼壓慢性升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用雷帕霉素可以顯著減少眼壓升高所致的軸突變性，而3-MA則加重了軸突變性。由于二者所用實驗模型不同，上述結(jié)論還有待進一步研究證明。因此，自噬在RGCs死亡中的作用尚無統(tǒng)一的觀點。值得注意的是，青光眼的發(fā)生和發(fā)展不僅與眼壓升高相關(guān)，還與RGCs內(nèi)在分子水平的變化有關(guān)。

3.2 自噬在RGCs軸突損傷后對RGCs的作用

RGCs軸突損傷可導致其發(fā)生自噬和凋亡。Sternberg等[44]在切斷新生大鼠RGCs軸突后24 h觀察到RGCs自噬及凋亡。采用3-MA抑制自噬則進一步加重RGCs損傷，說明自噬可以延緩，甚至阻止細胞退化，是軸突損傷后RGCs的保護性反應。但由于該實驗為體外實驗，并不能完全反映自噬在體內(nèi)的真實作用。Kn?ferle等[45]構(gòu)建了視神經(jīng)夾持型急性青光眼大鼠模型，通過簡單的外科手術(shù)及特有的成像方法在活體大鼠中觀察到RGCs變性軸突中自噬體增多，鈣流增加。應用3-MA可將軸突開始變性的時間由原來的30 min延遲到90 min，其作用可持續(xù)至360 min，且該模型中自噬的發(fā)生是鈣依賴性的。然而，由于該實驗持續(xù)時間較短，所以未能觀察到RGCs胞體中的自噬情況。Kim等[46]研究發(fā)現(xiàn)，LC3Ⅱ蛋白表達量在軸突損傷后第3天達峰值，同時相關(guān)Atg蛋白表達水平升高，并且自噬水平上調(diào)時間先于凋亡。由此推測，軸突損傷后自噬增強，且對RGCs起保護作用。

3.3 自噬在RGCs中與凋亡的關(guān)系

細胞自噬與凋亡之間的關(guān)系非常復雜。盡管二者有各自標志性的形態(tài)學和生化特征，但其調(diào)控和執(zhí)行蛋白網(wǎng)絡之間存在重疊以及相互作用。凋亡是青光眼RGCs損傷的主要病理形式[47]。在青光眼大鼠模型中，受損的RGCs里可出現(xiàn)自噬標志物LC3及凋亡標志物TUNEL染色雙陽性的現(xiàn)象，即自噬與凋亡同時被激活[37,42]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬對凋亡有一定的調(diào)控作用，在青光眼中，自噬參與膠質(zhì)細胞活化、氧化應激等環(huán)節(jié)所誘導的細胞凋亡，起到促進或抑制的作用。

自噬參與膠質(zhì)細胞活化誘導的RGCs凋亡。視網(wǎng)膜包含3種類型的膠質(zhì)細胞，即星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和Müller細胞。小膠質(zhì)細胞活化會產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NO等神經(jīng)毒性介質(zhì)，造成線粒體損傷，從而誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡[48]。Su等[49]在慢性高眼壓小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，使用自噬誘導劑雷帕霉素可抑制小膠質(zhì)細胞活化，并減少TNF-α和NO的產(chǎn)生，提示自噬可能通過阻止視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化抑制外源性細胞凋亡。此外，視網(wǎng)膜上的Müller細胞活化可導致RGCs發(fā)生谷氨酸攝取障礙，從而刺激N-甲基-D-天冬氨酸受體大量釋放，使Ca2+內(nèi)流增加，誘發(fā)鈣依賴的細胞凋亡[50-51]。Piras等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性青光眼模型中3-MA可抑制Müller細胞活化，同時RGCs凋亡減少。上述研究結(jié)果提示自噬可能參與了膠質(zhì)細胞活化誘導的RGCs凋亡。

自噬參與氧化應激誘導的RGCs凋亡。ROS可造成RGCs線粒體損傷。線粒體損傷后，一方面，其外膜發(fā)生賴氨酸63位連接的泛素化，誘導線粒體自噬；另一方面，線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C，引發(fā)細胞凋亡[52]?，F(xiàn)有的研究認為線粒體自噬可能是自噬抑制凋亡的主要機制，其原因是線粒體損傷后更傾向于發(fā)生細胞凋亡，通過自噬清除功能受損的線粒體可降低凋亡的發(fā)生率[47]。Rodríguez-Muela等[53]切斷小鼠視神經(jīng)后觀察到線粒體受損且ROS產(chǎn)生增多。體外實驗中使用雷帕霉素誘導自噬，RGC-5線粒體跨膜電位保持不變，ROS產(chǎn)生減少，采用3-MA抑制自噬則效果相反。該研究表明自噬可能通過清除RGCs中的受損線粒體，減少細胞凋亡發(fā)生，從而對發(fā)生氧化應激的RGCs起到一定的保護作用。

3.4 自噬與遺傳性視神經(jīng)變性

由于基因突變導致青光眼發(fā)病的研究相對少見，現(xiàn)有的研究表明，該過程中常涉及自噬機制失調(diào)。常染色體顯性視神經(jīng)萎縮(autosomal dominant optic atrophy，ADOA)是常見的原發(fā)性遺傳性視神經(jīng)病變。視神經(jīng)萎縮基因1(optic atrophy 1，OPA1)突變可導致ADOA。OPA1突變的小鼠主要表現(xiàn)為RGCs數(shù)量減少，同時在RGCs及其軸突中出現(xiàn)大量自噬體。此外，自噬體增多的時間早于線粒體損傷和軸突退化，這說明在ADOA發(fā)病早期自噬具有重要作用[54]。Sarzi等[55]在OPA1delTTAG突變的小鼠模型中也觀察到了類似的現(xiàn)象。ADOA中自噬激活是否有利于RGCs及其機制均有待進一步研究。

OPTN基因編碼optineurin/OPTN蛋白，OPTN基因突變與正常眼壓性青光眼的發(fā)生有關(guān)。與野生型OPTN相比，突變型E50K和M98K可誘導更多的RGCs死亡。OPTN蛋白可作為受體直接與LC3結(jié)合參與自噬的調(diào)控[56]。目前對E50K-OPTN的研究較多，雷帕霉素可減少E50K突變導致的RGCs凋亡[57-58]。Liu等[59]通過生物信息學研究發(fā)現(xiàn)E50K-OPTN小鼠存在蛋白質(zhì)合成失調(diào)、自噬-溶酶體通路功能障礙等問題。與E50K-OPTN不同，在M98K-OPTN相關(guān)實驗中發(fā)現(xiàn)，敲除Atg5可減少RGCs凋亡[60]。二者導致RGCs凋亡的機制不同，這也反映了青光眼發(fā)病機制的復雜性。

4 自噬與青光眼的治療

4.1 基因調(diào)控自噬保護RGCs

有相關(guān)研究報道在細胞中可通過調(diào)控Atg保護RGCs。Chalasani等[57]通過突變LC3與E50K-OPTN的結(jié)合位點，使E50K-OPTN不能參與自噬過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RGC-5死亡減少。Sirohi等[60]發(fā)現(xiàn)在LC3與M98K-OPTN的結(jié)合位點突變后，得到了同樣的結(jié)論。同時，敲除RGC-5中的Atg5也可減少由M98K-OPTN誘導的RGC-5死亡。在動物實驗中也有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控Atg可減少RGCs死亡。Rodríguez-Muela等[53]在Atg4B-/-及特異性敲除RGCsAtg5的小鼠中切斷其視神經(jīng)，實驗組視神經(jīng)切斷小鼠較野生型視神經(jīng)切斷小鼠RGCs的存活率高。以上結(jié)果表明，干預Atg是一種保護RGCs的潛在治療手段。

4.2 藥物調(diào)控自噬保護RGCs

研究發(fā)現(xiàn)自噬誘導劑可延緩或減少RGCs損傷。(1)常用的自噬誘導劑雷帕霉素除能夠直接作用于哺乳動物mTOR位點誘導自噬外，還能影響Akt信號通路，增加其磷酸化蛋白，有利于RGCs存活[39,49]。有報道發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以清除積累的E50K突變蛋白，可能有助于治療E50K突變誘發(fā)的正常眼壓性青光眼[56]。(2)褪黑素可通過抑制mTOR通路誘導自噬，減少外傷性視神經(jīng)損傷中的RGCs凋亡，對神經(jīng)元有保護作用[61]。(3)β腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾是臨床一線抗青光眼降眼壓藥物。有研究顯示，普萘洛爾亦可誘導自噬并減少RGCs凋亡[62]。(4)在大鼠青光眼模型中，玻璃體腔內(nèi)注射別孕烷醇酮或雷帕霉素均可通過提高自噬水平減少RGCs凋亡[63]。

另一方面，抑制自噬在一定程度上也可以減少RGCs凋亡。自噬抑制劑3-MA是一種PI3K蛋白的選擇性抑制劑，PI3K蛋白與beclin-1結(jié)合召集自噬泡形成所需的吞噬泡膜。研究發(fā)現(xiàn)3-MA有阻斷凋亡信號通路的作用，因此推測3-MA可能通過阻止早期自噬來減少RGCs凋亡[64]。

綜上所述，自噬與青光眼的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。自噬在青光眼發(fā)病機制中的復雜作用與多種因素有關(guān)，仍不能得出系統(tǒng)性的結(jié)論。目前，自噬調(diào)控RGCs凋亡的具體分子機制、調(diào)控自噬是否會影響其他視網(wǎng)膜細胞存活、小分子自噬抑制劑或誘導劑的最佳治療時間等問題仍有待進一步研究闡明。因此，如何通過調(diào)控自噬減少青光眼視神經(jīng)損傷仍需進一步研究探索，加強對自噬在青光眼發(fā)病機制中的認識為臨床治療青光眼提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突