嚴夢迪 高蓉蓉 王俊杰 王勤美 黃錦海

作者單位：溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院 325027

角膜是眼球光學系統的重要結構，其屈光力占眼球光學系統總屈光力的2/3以上。探索角膜的生物力學性質在角膜形狀與透明度的維持、圓錐角膜的診治、屈光手術的設計以及人工角膜的研發(fā)等方面有重要參考意義[1]。目前，角膜生物力學研究的離體實驗包括單軸拉伸實驗[2-4]、全眼球膨脹實驗[5]等，在體測量的儀器較少，主要有眼反應分析儀（Ocular response analyzer，ORA）和可視化角膜生物力學分析儀（Corneal visualization Scheimpflug technology，Corvis ST）。Brillouin顯微鏡可以實現在體角膜生物力學特性的無接觸測量，提供微觀的三維分布，有望成為臨床角膜生物力學測量的新技術[6]。本綜述將闡述Brillouin顯微鏡的測量原理、安全性以及與其他設備的比較，并總結其臨床應用進展。

1 Brillouin顯微鏡的測量原理和結構

Brillouin光譜長期應用于材料表征和環(huán)境傳感[7]，并在20世紀80年代早期開始用于生物組織[8]。分子的熱波動產生以聲速傳播的壓力波動，即聲波。聲速與組織的縱向模量（M'）成比例。Brillouin光散射是由光和組織中的內在聲波相互作用產生的。光從組織反射時產生的多普勒頻移與焦點處組織的聲速成比例，可間接反映該處組織的縱向模量。Brillouin頻移與組織的縱向模量之間存在著如下關系[9]：其中νB是Brillouin頻移，n是組織的折射率，λ是入射光的波長，M'是縱向模量，ρ是組織的密度，θ是入射光與散射光的夾角。角膜組織的折射率和密度之間遵循Gladstone-Dale關系[10]，ρ/n2的比率在角膜中的變化很小[11]，故通過測得的頻移可計算出角膜組織的縱向模量?？v向模量是指復合材料在沿正軸縱向單軸拉伸或壓縮載荷作用下，在線性變化的范圍內產生單位長度的線應變所需要的應力大小。楊氏模量（E'）也是用于表示組織抵抗形變能力的物理量，代表各向同性的彈性組織的剛度，定義為在遵循胡克定律的情況下，單軸應力和單軸應變之間的比值。經驗證明，Brillouin測量的縱向模量和楊氏模量是對數線性關系：log（M'）=alog（E'）+b，其中a和b是組織依賴性系數，如豬眼的a=0.093、b=9.29，牛眼的a=0.034、b=9.50[12]。

Brillouin顯微鏡由激光掃描共聚焦顯微鏡和雙重虛擬成像陣列（Virtually imaginary phased array，VIPA）光譜儀組成[13]，將低功率窄帶近紅外激光束聚焦到角膜組織中，通過高分辨共聚焦光譜儀分析來自焦點處的Brillouin頻移[14]，求得縱向模量。激光束在不同部位的掃描，可反映出組織每個部位的縱向模量[6]。

2 Brillouin顯微鏡的安全性

眼部最大允許暴露量（Maximum permissible exposure，MPE）定義為激光在不引起生物危害的情況下進入人眼的最高功率或能量密度，相當于有50%概率會造成傷害的劑量的十分之一[15]。根據國際非電離輻射防護委員會（International Commission on Non-ionizing Radiation Protection，ICNIRP）的標準，對于波長范圍為400～1 050 nm的連續(xù)波光源，照射時間在10 s以內，角膜的暴露極限為4 W/cm2，即直徑為1 mm的圓形區(qū)域（面積為0.79 mm2）的MPE為32 mW。對于直徑為7 mm的圓形區(qū)域視網膜，照射1 s和60 s的MPE分別為265 mW和95 mW[16]。Brillouin顯微鏡使用的是低功率激光，并且采集時間相對較短，不會對人眼造成危害。目前各個研究所采用的激光功率和采集時間具有較大差異，但均處于以上安全范圍之內，例如Scarcelli和Yun[17]使用0.7 mW的780 nm激光，采集時間為0.4 s；Webb等[18]使用10 mW的532 nm激光，采集時間為0.2 s；Seiler等[19]使用5 mW的780 nm激光，采集時間為0.7 s。

3 Brillouin顯微鏡與其他設備的比較

臨床現有的角膜生物力學特性的在體測量設備包括ORA和Corvis ST，二者都基于測量角膜對空氣脈沖的動態(tài)形變反應。ORA是第一個應用于臨床，評估活體角膜生物力學性能的儀器，利用空氣脈沖使角膜壓陷，產生1個雙向壓平的動態(tài)過程，電子光學分析系統監(jiān)測角膜形變的過程，記錄2個壓平壓力測量值，通過計算得到角膜滯后量（Corneal hysteresis，CH）及角膜阻力因子，可診斷圓錐角膜等角膜疾病[20-22]。但由于CH受角膜厚度、硬度、眼內壓以及角膜水合作用的影響，并不能真實反映角膜生物力學特性。Corvis ST利用Scheimpflug高速攝像實時動態(tài)記錄中央8 mm直徑范圍的角膜受壓后橫截面的完整形變過程，同時可分析記錄最大變形幅度、最高凹陷時間、峰峰距離、中央角膜厚度、DAratio、SPA1和角膜生物力學指數（Corneal biomechanical index，CBI）等，其中CBI已被證明可提高圓錐角膜檢測敏感度[23]。ORA基于動態(tài)雙向壓平的原理，Corvis ST采用氣沖印壓技術，二者在測量過程中都需要產生1個空氣脈沖使角膜凹陷，通過形變過程中的各個參數來間接分析角膜生物力學特性，對患者造成不適感。此外，ORA和Corvis ST均將角膜視為一個各向同性的組織，該均一化假設違背了角膜各向異性的特點，不能反映角膜各部分的生物力學差異，故診斷敏感性有待進一步提高。二者用于角膜交聯術后角膜硬度改變的評估，不同研究之間結果存在差異。此外，目前二者提供的角膜形變參數尚無法求出角膜本構參量。Brillouin顯微鏡在測量過程中無需對角膜施加外力，具有更高的測量舒適性，可以直接讀出組織的局部特征，提供微觀的角膜生物力學特性三維分布圖[24]。Brillouin顯微鏡提供的縱向模量可以直接代表材料的本構屬性。

4 Brillouin顯微鏡在角膜疾病方面的應用

4.1 正常角膜的基線數據

目前Brillouin顯微鏡的主要波長為780 nm。關于正常人角膜的Brillouin頻移參考值范圍尚無統一觀點，Yun和Chernyak[6]測得780 nm波長下正常人角膜的頻移在5.69～5.76 GHz之間的狹窄范圍內；Scarcelli和Yun[17]觀察到頻移在角膜前部的100～400 μm處從5.6 GHz緩慢下降至5.5 GHz，而在角膜后部200 μm處從5.5 GHz急劇下降至5.2 GHz，Brillouin頻移的這一急劇下降可能在生物力學上反映了角膜結構的改變。其他研究者也報道了相似的結果[8，25]。Scarcelli等[24]研究中的測量值與上述值存在差異，其測得角膜上皮的頻移為6.5～6.6 GHz，角膜基質為6.5 GHz。

由于聲速隨組織中的水含量而變化[26]，Brillouin測量對角膜水合作用較敏感，或許是上述角膜頻移有偏差的原因。近期有研究顯示，志愿者醒來后1 h角膜厚度逐漸減小，而Brillouin頻移增加[27]。Seiler等[19]使用不同濃度的右旋糖酐對兔角膜脫水后進行Brillouin測量和角膜條帶拉伸試驗后顯示，高濃度（20%）的右旋糖酐處理后的角膜縱向模量和彈性模量分別是低濃度（5%）處理后的1.2倍和4.4倍，且隨著角膜脫水程度的變化，縱向模量與角膜厚度呈負相關，并首次證明了縱向模量不隨應力的變化而改變，即Brillouin測量無法描述角膜組織的非線性特征。有研究通過對離體牛角膜進行水化處理令角膜明顯膨脹，26 h后角膜厚度幾乎加倍[28]，此時水合作用明顯超過正常水平[29]，且測得角膜所有深度的Brillouin頻移減小，表明腫脹的角膜變得更柔軟。0.5 h時，角膜前部的頻移為6.3～6.5 GHz，后部為6.2～6.5 GHz，26 h后減小為6.0～6.3 GHz[28]。此外，腫脹的角膜中測量的頻移變化表明組織內的結構完整性喪失，符合角膜過度水合和水腫的常見變化[30，31]。Brillouin測量對水合作用的敏感性可能與膠原纖維和細胞外基質的可壓縮性有關，也可能反映了組織的結構和分子變化。

人眼角膜緣的Brillouin頻移值低于中央角膜，特別是在角膜的最前部區(qū)域[28，32]，上皮下存在10～15 μm厚的Brillouin頻移最高的組織，推測為前彈力層[32]。目前采用Brillouin顯微鏡對角膜組織進行的研究較少，其角膜各部分的正常參考值范圍有待進一步大樣本量、多中心的研究。

4.2 角膜疾病的診療和篩查

4.2.1 Brillouin顯微鏡與圓錐角膜的診斷 圓錐角膜是一種退行性眼病，其特征在于生物力學減弱的角膜局部在眼內壓的作用下進行性變薄和前凸。目前對該疾病的診斷多依賴于角膜地形圖和Corvis ST，但早期的診斷和鑒別較困難。開發(fā)一種測量角膜力學性能的儀器十分有必要，有助于圓錐角膜發(fā)展機制的探索，圓錐角膜的早期診斷和早期干預，還有助于LASIK術后角膜膨隆的篩查。較多研究比較了圓錐角膜和正常角膜的Brillouin測量值，認為二者之間存在明顯差異。Scarcelli等[33]對比了8個健康角膜供體和10個晚期圓錐角膜，在取下角膜后2 h內，使用波長為532 nm的Brillouin顯微鏡測量，得到圓錐角膜前200 μm的平均頻移為（7.99±0.10）GHz，明顯低于健康角膜的（8.17±0.06）GHz，且差異有統計學意義（P＜0.001）。此外，該研究中，在圓錐角膜內，遠離錐頂區(qū)的頻移顯著高于錐形區(qū)。最近，Seiler等[34]比較了47例健康眼與36例圓錐角膜眼，同樣證明了圓錐角膜錐體中央區(qū)的頻移均低于健康眼。Shao等[35]比較了正常角膜與不同階段圓錐角膜患者的Brillouin測量結果，顯示正常角膜測量值在中央與周邊無明顯差異，且左右眼具有較高的對稱性，隨著圓錐角膜的進展，其生物力學的不均勻性以及左右眼間的不對稱性均增加。此外，I、II期的圓錐角膜與正常角膜差異無統計學意義，I期錐體內兩眼的差異約24 MHz，但晚期患者Brillouin頻移測量值明顯降低，為100～200 MHz。

4.2.2 Brillouin顯微鏡與角膜膠原交聯術（Corneal collagen cross-linking，CXL）的療效 CXL出現于20世紀90年代，在2003年開始用于治療進展期圓錐角膜，能顯著增強角膜的生物力學性能。同時，CXL也能治療角膜炎[36]、角膜溶解[37]、角膜基質水腫[38]等病變。Randleman等[9]評估了11只豬眼的基線狀態(tài)、制作LASIK皮瓣造模后以及快速CXL術后的角膜不同深度的Brillouin頻移，結果顯示，制作皮瓣后，前部和中部區(qū)域角膜的頻移較基線顯著下降，而后部的降幅較少；再行快速CXL術后的頻移比制作皮瓣后略微增高，但術后角膜任何深度的頻移增高與制作皮瓣后的頻移相比差異都無統計學意義。Scarcelli等[39]對新鮮豬眼進行CXL后，其縱向模量明顯增加，且前基質層的增加幅度大于后基質層。Webb等[18]采用不同強度但總能量相同的紫外線進行豬眼CXL，觀察到術后縱向模量和彈性模量較未處理組均有增加，且2種模量的增加具有一致性，增幅隨照射強度的增大而減小，CXL的效果局限于角膜前中部。以上研究反映出Brillouin顯微鏡可以評估CXL后角膜組織不同深度的生物力學變化，但該變化與交聯方案之間的具體關系有待進一步探索。

5 展望

Brillouin顯微鏡為角膜生物力學特性（縱向模量）的測量提供了一種安全、非接觸和三維的方法，其發(fā)展有望將生物力學本構參量測量引入臨床，在許多角膜疾病的診斷和治療上具有廣闊的前景。目前對Brillouin顯微鏡測量角膜縱向模量的算法和模型有待進一步優(yōu)化。此外，目前Brillouin顯微鏡在眼科其他疾病中的應用較少，未來還可以通過更多的研究來擴展其應用價值。然而，要將Brillouin顯微鏡廣泛應用于臨床上，仍需要進一步大量的研究數據。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明嚴夢迪：收集文獻資料并歸納分析，撰寫論文，根據修改意見進行論文修改。黃錦海、高蓉蓉：參與選題設計，指導資料的分析和解釋，參與論文的修改。王俊杰、王勤美：對論文的知識性內容作批評性審閱