郝良玉，郭衍冰，呼延含蓉，程榮華，劉沂霖，李昱潔，姚新華，王改麗*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林長春 130062；2.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林長春 130062；3.吉林省畜牧業(yè)管理局，吉林長春 130000

羊痘是由羊痘病毒感染山羊、綿羊等動物的急性、接觸性傳染性疾病，包括山羊痘、綿羊痘和疙瘩皮膚病。羊痘病毒屬包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒和疙瘩皮膚病病毒。

在我國，羊痘又名羊“天花”，被列為一類重大傳染性動物疾病，其傳播快、發(fā)病高，不同品種、性別、年齡的羊均可感染，老年羊、哺乳期母羊、羔羊尤其新生羔羊更易感染，羊群的集中飼養(yǎng)不利于疫病防控，該病傳播至無病例地區(qū)則易造成大流行，羊痘的流行給附近養(yǎng)羊戶造成嚴重經(jīng)濟損失的同時也阻礙了養(yǎng)羊業(yè)和羊副產(chǎn)品貿(mào)易發(fā)展，故而在輸入輸出羊只時需加強檢測。

1 臨床表現(xiàn)

因羊痘病毒具有親上皮特性，病毒粒子主要存在于病羊皮膚和黏膜處，且血液和口鼻分泌物中也含有病毒。臨床上常以病羊無毛或少毛處皮膚和黏膜上出現(xiàn)典型痘疹為特征。病羊發(fā)病初期體溫升高至39.5～41.5 ℃，部分病羊呆立或臥地不起，主要癥狀有食欲削減甚至停止，精神萎靡不振，眼結(jié)膜出現(xiàn)潮紅，從鼻孔流出漿液性、黏液性或膿性分泌物，呼吸及脈搏加速；病羊皮膚出現(xiàn)豆粒大小的紅斑，形成凸出皮膚的硬實丘疹，逐漸發(fā)展為結(jié)節(jié)、水皰或膿瘡，浸潤成片的疹塊幾天后開始脫落，部分羊病變部位疹塊相互融合，病羊隨病程延長呼吸愈發(fā)困難，加速死亡[1]。

若體況不佳、飼養(yǎng)管理差或出現(xiàn)繼發(fā)感染可導(dǎo)致病羊死亡，懷孕母羊患病后流產(chǎn)概率極高，新生羔羊染病后易死亡，同時受感染羊群整體生產(chǎn)力大大下降，毛皮品質(zhì)隨之降低；若加強飼養(yǎng)管理，進行有效的對癥治療，可避免出現(xiàn)繼發(fā)感染，病羊痊愈后可產(chǎn)生永久免疫力，重復(fù)感染率為零。

2 分子生物學特性

山羊痘病毒和綿羊痘病毒基因組約有150 kb，二者十分相似，約有96%的核苷酸完全相同。同大多數(shù)痘病毒一致，羊痘病毒是線性、雙股DNA基因組[2]，分子質(zhì)量約為(130×103)～(240×106)ku,由中間編碼區(qū)和兩端相同的反向互補序列構(gòu)成，中心區(qū)包含所有保守序列的同源序列，內(nèi)含病毒復(fù)制基因編碼的必需因子，參與病毒轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、病毒DNA復(fù)制、病毒粒子的構(gòu)建和裝配等過程。雖然山羊痘病毒和綿羊痘病毒具有較強特異性，分別只感染山羊和綿羊，但在實際生產(chǎn)生活中兩者定義并不十分清晰，國內(nèi)已有山羊痘和綿羊痘混合感染案例報道，這也增加了防控及治療羊痘的難度。

3 P32蛋白特性

早期研究者對羊痘病毒結(jié)構(gòu)蛋白進行分析時，發(fā)現(xiàn)一種能與山羊痘陽性血清特異性結(jié)合的蛋白，因分子質(zhì)量為32 ku，故將其命名為 P32蛋白。進一步研究證實，SPPV和GTPV的P32蛋白與牛痘病毒晚期H3L基因編碼的P35蛋白具有同源性，晶體結(jié)構(gòu)相似，是目前分離鑒定羊痘病毒株中共有且特異性強的膜結(jié)構(gòu)蛋白。P32蛋白也是羊痘病毒特有的囊膜結(jié)構(gòu)蛋白，具有混合的α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)，全長較難表達純化[3]。作為典型的膜囊蛋白，P32蛋白在病毒感染早期即可刺激機體產(chǎn)生抗體，同時具有抗原特異性，由此引起研究者的廣泛關(guān)注。P32蛋白可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的細胞免疫，常作為靶標進行疫苗研究和診斷試劑開發(fā)。

K.Sumana等人對25次綿羊痘和山羊痘疫情中的28株分離毒株進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，通過多位點序列分析P32基因結(jié)果表明，LSDV與SPPV的親緣關(guān)系比GTPV更密切。SPPV和GTPV分離毒株中各基序具有穩(wěn)定的保守結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式，如糖胺聚糖(GAG)、趨化因子(CX3C)，以及病毒特異性標記殘基；另外，該研究團隊以P32受體蛋白為基礎(chǔ)，采用硫酸肝素和UDP-葡萄糖進行同源建模和對接，研究發(fā)現(xiàn)參與病毒附著的硫酸肝素具有保守的結(jié)合模式，并且糖基轉(zhuǎn)移酶與UDP-葡萄糖的折疊度不同，這個發(fā)現(xiàn)可能有助于開發(fā)針對其他痘病毒的疫苗及建立相應(yīng)診斷和治療方法。

以重組P32蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)被廣泛用于羊痘血清學診斷。成偉偉等人[4]將含有GST標簽的重組P32蛋白表達純化后免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生較強體液免疫及細胞免疫，表明P32蛋白具有良好的免疫原性，可作為診斷抗原對羊痘病毒血清抗體進行監(jiān)測，同時高效表達P32蛋白對研究該蛋白功能及羊痘疫苗研制具有重大意義。

4 常用診斷方法

PCR技術(shù)利用某段DNA為模板，通過變性、復(fù)性、延伸等步驟在聚合酶和核苷酸底物共同參與下對該段DNA序列進行大量擴增，是研究疾病感染過程發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的一種重要手段。多重PCR分析具備所需樣品量較少、消除移液等操作誤差、一個反應(yīng)可設(shè)內(nèi)部對照等優(yōu)勢。Ya等人建立了一種能夠同時檢測山羊、綿羊6種DNA和RNA病毒的多重PCR方法，包括口蹄疫病毒(FMDV)、藍舌病病毒(BTV)、小反芻動物害蟲病毒(PPRV)、綿羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊傳染性膿皰病毒(ORFV)。該方法對待檢樣品中一種或多種病毒均具有較高敏感性和特異性，通過一個PCR反應(yīng)程序從六種病毒混合物中檢測到至少100 pg病毒基因組DNA或RNA，可用于綿羊、山羊DNA和RNA病毒混合感染的臨床診斷，為同時診斷綿羊和山羊6種病毒性疾病提供了方法。

實時熒光定量PCR方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，每經(jīng)一輪循環(huán)便檢測并記錄熒光信號強度，進而達到實時監(jiān)測PCR進程的目的，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，具有靈敏度高、特異性強、高效簡便等優(yōu)點。理論上樣品中只要有一個病原體存在，該方法就可以檢測到，其檢測限度最低可達10拷貝，通常2～3 h即可得出結(jié)果。雜交探針、染料與實時定量PCR技術(shù)相結(jié)合，可提高檢測效率、增強檢測靈敏度和特異性，也可實現(xiàn)一個反應(yīng)同時檢測多個目標基因。G.Venkatesan等人建立了一種基于TaqMan的雙鏈探針實時熒光PCR檢測方法，使用兩對寡核苷酸引物和分別用Cy5/BHQ1和Hex/BHQ1標記的CaPV和ORFV雜交探針，其標準質(zhì)粒的檢測限度為20拷貝，CaPV和ORFV病毒基因組DNA的檢出限為35 fg，該方法僅對靶向病毒具有特異性，對其它的羊常見傳染病病毒無反應(yīng)，檢測結(jié)果組間差異極低、具有高度重復(fù)性。

G.Venkatesan等人以羊痘DNA聚合酶基因為靶點建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，該LAMP方法檢出率高于常規(guī)PCR方法，在檢測限度和準確度上能夠媲美熒光定量PCR，同時該方法不需要熱循環(huán)階段，極大地縮短了操作時間，可實現(xiàn)現(xiàn)場臨床病例的快速診斷和疫病監(jiān)測。

5 預(yù)防及疫苗免疫措施

目前，尚無針對羊痘的特效治療藥物，主要通過以下方法進行預(yù)防控制。

5.1 飼養(yǎng)管理

羊痘病毒對乙醚和氯仿敏感、耐熱性低，平時加強飼養(yǎng)管理，有針對性噴灑消毒劑，維持圈舍整潔衛(wèi)生。冬季防寒保暖，夏季防高溫滅蚊蠅，加強營養(yǎng)提高羊群抗病能力。

5.2 預(yù)防接種

30日齡后用羊痘活疫苗每頭份經(jīng)0.5 mL生理鹽水稀釋后，在尾巴根內(nèi)側(cè)或股內(nèi)側(cè)進行皮內(nèi)注射接種，定期強化免疫。

6 結(jié)語

羊養(yǎng)殖業(yè)是我國重要的畜牧產(chǎn)業(yè)之一，其低投入、周期短、效益高的特點使之成為廣受養(yǎng)殖戶喜愛的產(chǎn)業(yè)。而羊類疾病一旦出現(xiàn)病例則會快速在同群中傳播，只有盡早做好預(yù)防免疫，在疾病初期早發(fā)現(xiàn)才能減少損失，建立行之有效的快速檢測手段成為科研人員不懈努力的方向。