黃紅麗，王慧豐，胡艷玲

（廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，南寧 530021）

糖尿?。╠iabetes mellitus）是一種由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，發(fā)病原因主要有機(jī)體胰島素分泌受損或胰島素作用受損[1]。此病會(huì)引起如神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變、心血管疾病等多種并發(fā)癥[2]，嚴(yán)重威脅人類的健康。研究顯示，2019年全球約有4.63 億人患糖尿病，到2045年將會(huì)增長(zhǎng)到6.29～7億人[3-4]，形勢(shì)非常嚴(yán)峻。對(duì)于這些人群而言，生活方式和工作方式的改變比較困難，故藥物成為治療糖尿病最好的選擇[5]。

中醫(yī)藥是利用辯證和整體的思維模式、方法來(lái)治療疾病[6]，體現(xiàn)整體性和多靶點(diǎn)相互作用。六味地黃凡最早記載于宋代錢乙《小兒藥證直訣·卷下諸方》中，由熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉和牡丹皮六味中藥經(jīng)過(guò)加工制成，平補(bǔ)肝腎脾三陰，而以填補(bǔ)腎精為主，對(duì)多種疾病均有不同程度的效果[7-8]。六味地黃丸治療糖尿病相關(guān)的疾病已有研究，但疾病的病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未闡明，不利于六味地黃丸這一名藥的開發(fā)和利用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)圍繞系統(tǒng)生物學(xué)、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析、連接性、冗余性和多效性等，將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行藥物機(jī)制、有效性、毒性、代謝特性的揭示[9]。分子對(duì)接技術(shù)運(yùn)用生物信息和計(jì)算機(jī)等手段，通過(guò)模擬化合物小分子和疾病靶點(diǎn)之間相互作用情況，篩選結(jié)合效能較好的藥物和靶點(diǎn)，為新藥的開發(fā)和疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。因此，本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)著重闡明六味中藥通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路治療糖尿病的作用機(jī)制，為疾病的研究和用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疾病靶點(diǎn)相關(guān)基因查詢 以“diabetes mellitus”作為關(guān)鍵詞，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DisGenet v6[10]（https://www.disgenet.org/）、T-HOD[11]（http://bws.iis.sinica.edu.tw/THOD/）和TTD[12]（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索獲得糖尿病相關(guān)基因。

1.2 中藥成分及靶點(diǎn)蛋白篩選 分別以中藥名“熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata）”，“山茱萸（Cornus Officinalis Sieb.Et Zucc.）”，“茯苓[Poria Cocos（Schw.）Wolf.]”，“牡丹皮（Cortex Moutan）”，“山藥（Rhizoma Dioscoreae）”，“澤 瀉[Alisma Orientale（Sam.）Juz.]”作為關(guān)鍵詞，輸入TCMSP[13]（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索六味中藥的有效成分。根據(jù)ADME 算法，篩選有效成分的口服利用度（OB）≥30%，分子相似性（DL）≥0.18 的化合物并下載SMILE結(jié)構(gòu)和2D結(jié)構(gòu)。利用在線網(wǎng)站SwissTargetPrediction[14]（http://www.swisstargetprediction.ch/）上傳化合物的SMILE結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選可能性大于0 的靶點(diǎn)。沒(méi)有預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)的化合物通過(guò)SEA[15]（http://sea.bkslab.org/）進(jìn)行補(bǔ)充分析，篩選FIT值大于6的靶點(diǎn)。對(duì)于沒(méi)有SMILE結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)PharmMapper[16]（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）上傳2D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，篩選得分大于6的靶點(diǎn)。

1.3 藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾瓣P(guān)鍵靶標(biāo)篩選

將藥物成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1 進(jìn)行藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑯?gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Venny2.1.0[17]（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得疾病和成分的靶點(diǎn)的交集，導(dǎo)入Metascape[18]（https://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并且利用Cytoscape3.2.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，構(gòu)建六味中藥對(duì)治療糖尿病直接或間接靶點(diǎn)的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoHubba及MCODE插件篩選治療疾病的關(guān)鍵基因。使用CytoHubba插件的核心算法計(jì)算出基因的核心度，選取MCC 值前十的基因作為核心基因。再運(yùn)用MCODE 插件，將K-Core值設(shè)置為2，其他參數(shù)默認(rèn)，聚類得到7個(gè)核心模塊，取MCC值前十的基因和MCODE插件聚類得到的基因交集作為關(guān)鍵基因[19]。

1.4 GO功能富集分析以及KEGG通路分析 將交集基因輸入Metascape進(jìn)行基因通路和生物過(guò)程富集分析。Metascape 富集資源來(lái)自KEGG Pathway、GO Biological Processes、Reactome Gene Sets、Canonical Pathways、CORUM,TRRUST、DisGeNET 和PaGenBase。將P＜0.01，得分大于3，富集系數(shù)大于1.5的基因納入富集群。選取富集的前20個(gè)結(jié)果進(jìn)行條形圖可視化。運(yùn)用DAVID[20]（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG 通路分析，利用在線繪圖工具Omicshare（https://www.omicshare.com）對(duì)基因數(shù)大于18 的通路進(jìn)行可視化分析。

1.5 六味地黃丸主要活性成分與糖尿病關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接 通過(guò)pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲得六味地黃凡主要活性成分的2D結(jié)構(gòu)，從Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中檢索獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白，將活性成分的2D結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白結(jié)構(gòu)上傳至在線分析平臺(tái)DockThor[21]（https://dockthor.lncc.br/v2/）。定義活性位點(diǎn)，選擇算法精確度，開始分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 六味中藥和疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)OB 和DL條件篩選獲得熟地黃化學(xué)成分2 種，山茱萸化學(xué)成分15種，茯苓化學(xué)成分15種，澤瀉化學(xué)成分9種，山藥化學(xué)成分14 種，牡丹皮化學(xué)成分9 種。刪除7 個(gè)重復(fù)的化學(xué)成分，共得到57個(gè)化合物有良好的口服利用度，經(jīng)過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)得到663 個(gè)化合物相關(guān)的靶點(diǎn)。其中，靶點(diǎn)數(shù)等于100 的化合物有16 個(gè)，靶點(diǎn)數(shù)大于100 的化合物有1 個(gè)，OB 值最大的為山蒟醇，64.01%；DL 值最大的為澤瀉醇C 醋酸酯，0.83，見表1。谷甾醇是熟地黃、山茱萸、澤瀉、牡丹皮4種中藥共有的，豆甾醇是熟地黃、山茱萸、山藥3 種中藥共有的。表1中僅列出了靶點(diǎn)大于等于100的化合物以及在多味藥中均含有的19個(gè)化合物。663個(gè)藥物靶點(diǎn)與1 331個(gè)糖尿病相關(guān)基因取交集共獲得交集基因204個(gè)。

2.2 化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果

通過(guò)Cytoscape 3.2.1構(gòu)建了化合物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1，中間方塊為化合物（紅），從里圈到外圈依次為熟地黃（橙）、澤瀉（黃）、山茱萸（綠）、山藥（青）、牡丹皮（藍(lán)）和茯苓（紫）。在線平臺(tái)Metascape得到交集基因的7個(gè)聚類模塊：MCODE1、MCODE2、MCODE3、MCODE4、MCODE5、MCODE6、MCODE7，各模塊通路的描述見表2。Cytoscape 3.2.1插件CytoHubba及MCODE篩選得到10個(gè)治療疾病的關(guān)鍵基因：CNR1、ADORA1、HRH3、APP、NPY2R、DRD2、DRD4、MCHR1、NPY1R、OPRM1。

2.3 生物過(guò)程及通路富集結(jié)果 對(duì)204 個(gè)中藥－疾病交集基因進(jìn)行Metascape 分析，見圖2a。結(jié)果顯示，六味地黃凡主要參與血液循環(huán)、細(xì)胞對(duì)氮化合物反應(yīng)、胰島素抵抗、對(duì)脂多糖反應(yīng)、信號(hào)介導(dǎo)白介素、鈣離子穩(wěn)態(tài)等過(guò)程。進(jìn)一步KEGG分析結(jié)果顯示，六味地黃丸治療糖尿病涉及的信號(hào)通路主要包括胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路、刺激神經(jīng)組織的中的交互、TNF 信號(hào)通路、前列腺癌、HIF-1 信號(hào)通路、在癌癥蛋白聚糖、癌癥通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路，主要涉及胰島素調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)、抗腫瘤等途徑，見圖2b。胰島素抵抗是肥胖相關(guān)組織暴露于飲食中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加的結(jié)果，導(dǎo)致有毒代謝副產(chǎn)品的累積[4]，Metascape 分析和KEGG 分析均富集到了胰島素抵抗相關(guān)的通路。

表1 六味中藥的19個(gè)主要有效成分

表2 7個(gè)聚類模塊對(duì)應(yīng)的通路描述

圖1 藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中藥主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果 選取六味地黃丸的兩種最主要化學(xué)成分谷甾醇和豆甾醇與10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。研究表明，配體與受體相結(jié)合時(shí)，所需結(jié)合能越低，結(jié)合就越穩(wěn)定，效果越好[22]。結(jié)果顯示兩種化合物與靶點(diǎn)MCHR1 總結(jié)合能最小，分別為-342.519 和-294.783 kcal/mol。與谷甾醇結(jié)合密切關(guān)系（Affinity）＜-7 kcal/mol 的蛋白結(jié)構(gòu)有CNR1、HRH3、MCHR1和OPRM1，與豆甾醇結(jié)合密切關(guān)系（Affinity）＜-7 kcal/mol 的蛋白結(jié)構(gòu)有CNR1、MCHR1 和OPRM1。見表3和圖3。

圖2 生物功能及KEGG通路富集結(jié)果

表3 六味地黃丸部分主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能 （kcal/mol）

圖3 主要化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合活性較好的分子對(duì)接結(jié)果圖

3 討論

本研究以六味地黃丸為主要藥物，研究其治療糖尿病的作用機(jī)制。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理方法分析六味中藥（山茱萸、熟地黃、牡丹皮、山藥、澤瀉、茯苓）的有效成分，構(gòu)建六味地黃丸活性成分－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析六味中藥中活性成分與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。其中，澤瀉醇C 醋酸酯、谷甾醇、豆甾醇、山蒟醇、槲皮素和山奈酚[8]等是六味地黃丸的主要活性成分。澤瀉，是一味歷史悠久的常用中藥，具有降低血脂，降低血清膽固醇及抗動(dòng)脈粥樣硬化的功效，澤瀉醇C 醋酸酯是澤瀉的一個(gè)三萜類活性成分。谷甾醇是熟地黃、山茱萸、澤瀉、牡丹皮4 種中藥的活性成分，具有降低血清膽固醇的作用，用于預(yù)防型高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化，豆甾醇是熟地黃、山茱萸、山藥的活性成分，具有抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗骨關(guān)節(jié)炎、抗氧化、降血糖和甲狀腺等多種藥理作用[23-24]。血小板的過(guò)度活化與凝血、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和過(guò)敏等生理疾病相關(guān)，而研究發(fā)現(xiàn)山蒟醇提取物具有顯著的抗血小板活性的功效[25]。此外，有研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖等方面的作用，山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物活性[8,26-27]，其他成分并未發(fā)現(xiàn)與糖尿病或降血糖直接相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸治療糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)CNR1、ADORA1、HRH3、APP、NPY2R、DRD2、DRD4、MCHR1、NPY1R、OPRM1，均與胰島素抵抗、PID IL2 通路、白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。除了HRH3暫時(shí)沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道與糖尿病的關(guān)系之外，其他基因均有明確的報(bào)道對(duì)糖尿病的分子調(diào)控作用。研究表明，多巴胺D2 受體基因（DRD2）/含錨蛋白重復(fù)和激酶域1TaqIA 基因（ANKK1 TaqIA）多態(tài)性會(huì)影響個(gè)體對(duì)高脂肪或高糖的食物的偏好，從而對(duì)健康產(chǎn)生影響[28]。實(shí)驗(yàn)顯示高脂飲食會(huì)導(dǎo)致cannabinoid receptor gene（CNR1）表達(dá)增加，敲除CNR1 可以改善胰島素抵抗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂質(zhì)積累，因此治療性抑制CNR1可以緩解糖尿病性心臟病的進(jìn)展[29]。Yip 等[30]發(fā)現(xiàn)adenosine A1 receptor（Adora1）表達(dá)的缺失可能導(dǎo)致胰高血糖素的分泌不受限制，導(dǎo)致Ⅰ型糖尿病的進(jìn)展和臨床表現(xiàn)。提示六味地黃丸可能通過(guò)多種成分作用于糖尿病的多個(gè)靶點(diǎn)。

為了說(shuō)明篩選出的主要靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了Metascape 生物過(guò)程和信號(hào)通路分析以及KEGG 通路富集分析。分析得出六味地黃丸主要通過(guò)調(diào)節(jié)血液循環(huán)、參與細(xì)胞對(duì)含N 化合物的反應(yīng)、參與脂多糖反應(yīng)、參與細(xì)胞外刺激反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程治療糖尿病。大多數(shù)基因可富集到胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體受體的相互作用、TNF 信號(hào)通路、前列腺癌、HIF-1 信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖等信號(hào)通路，可見，糖尿病的發(fā)生發(fā)展與多種疾病相關(guān)。研究顯示，糖尿病與腫瘤兩者之間存在獨(dú)立相關(guān)性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可顯著升高胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[31]。研究表明肥胖患者[體重指數(shù)（Ibm）＞25 kg/m2]前列腺癌的惡性程度高于非肥胖患者，相比于正常血糖患者，高血糖患者更易導(dǎo)致高級(jí)別的前列腺癌，同時(shí)對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高血糖誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中的miR-301a 表達(dá)，下調(diào)p21 和Smad4 的蛋白水平，導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)G1/S 周期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞增殖，但也有爭(zhēng)議提出，糖尿病患者前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低了14.0%[31-34]。從分子對(duì)接的結(jié)果可知，谷甾醇和豆甾醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)CNR1、MCHR1 和OPRM1 結(jié)合的密切關(guān)系均小于-7 kcal/mol，說(shuō)明這些關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)與主要化合物密切結(jié)合從而對(duì)糖尿病患者起作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步探討了六味地黃丸多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜機(jī)制過(guò)程。結(jié)果表明，六味地黃丸的多個(gè)成分均對(duì)糖尿病有直接作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)血液循環(huán)、參與脂多糖反應(yīng)、胰島素抵抗的過(guò)程和通路對(duì)糖尿病起作用。同時(shí)，糖尿病和癌癥的關(guān)系表明六味地黃丸可能通過(guò)預(yù)防癌癥降低糖尿病的發(fā)病。分子對(duì)接顯示，谷甾醇和豆甾醇與CNR1、MCHR1和OPRM1等關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。但六味中藥成分復(fù)雜，本研究?jī)H從微觀角度證實(shí)其參與血液循環(huán)、抗腫瘤等機(jī)制，后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上加以實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證，使其更有可信性和臨床意義。