楊金波，于忠娜，李莉，王釗，于雷*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東 萊陽 265200；2.河北工程大學 生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056021)

雛沙門氏菌又稱雞白痢沙門氏菌，主要侵害20日齡以內(nèi)幼雛，引起急性敗血癥，破殼一周內(nèi)的患病雛雞基本上都會死亡；三周以上的患病雞會出現(xiàn)呼吸道癥狀，其死亡率下降；日齡較大的雛雞可表現(xiàn)為白痢[1-2]，發(fā)病率、致死率較高;成年雞則主要侵害生殖器官[3]。近年來，由于大量和不合理地使用抗生素，使得雛沙門氏菌耐藥性逐年增加，導致致病菌和體內(nèi)共生菌產(chǎn)生耐藥性[4-5]，況且人類居于食物鏈頂端，動植物體內(nèi)殘留的抗生素會對人類身體健康有害。所以，尋找高效且無污染的耐藥抑制劑受到了廣泛關(guān)注。中草藥是我國的瑰寶，在抑制細菌產(chǎn)生耐藥性方面表現(xiàn)出特殊的效果[6]。中草藥有著許多抗生素所不具備的優(yōu)點，如不易出現(xiàn)殘留、抗藥性及毒副作用等。所以，尋找具有良好耐藥消除作用、無毒副作用或低毒副作用的中草藥抑制劑替代抗生素意義重大。本文選取10種中草藥，采用3種不同方法測定比較中草藥對雛沙門氏菌的抑制效果，篩選出抑菌效果強的中草藥，為臨床用藥提供參考，同時為后續(xù)研制中草藥制劑和中草藥飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

雛沙門氏菌菌種由青島農(nóng)業(yè)大學海都學院預防獸醫(yī)學實驗室提供。

1.1.2 試驗藥物

雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、五味子、烏梅、艾葉、黃連、丹參均購自山東省萊陽市棗行藥店。

1.1.3 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基購自青島市高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司(批號:20180813)。

1.1.4 主要儀器

離心機(H1650-M)購自長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50A)購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)購自浙江托普儀器有限公司；鼓風干燥箱(BPG-9040A)購自濟南炫彩醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1中藥藥敏片制備

參照文獻[7]，在藥敏片吸收藥物量上略有改動。每個有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入中藥藥液1 mL(中藥藥液濃度為1 g/mL，以每片吸收0.02 mL計算藥敏片含藥量)，其余步驟與文獻處理相同。

1.2.2 中藥水提取液的制備

參照文獻[8]，分別稱取15 g單味中草藥，用紗布包裹好放在燒杯中，添加150 mL蒸餾水室溫下浸泡2 h，煮沸后用文火煎煮30 min，然后用8層紗布過濾收取藥液，在藥渣中加入150 mL蒸餾水，重復2次。集中3次煮出的藥液用蒸發(fā)濃縮至15 mL，使其終濃度為1 g/mL，使用離心機1000 r/min離心10 min，收集上清液。然后121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存，備用。

1.2.3 試驗菌的制備

參照文獻[9]把所獲取的菌種接種在SS培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)16～18 h；挑取典型菌落，革蘭染色后顯微鏡1000倍觀察確定菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水稀釋，制成菌液，置4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 體外抑菌試驗

1.3.1 瓊脂平板打孔法

參照文獻[9]，重復3次該試驗，為每種藥液的抑菌圈測量直徑，求出3個平皿抑菌圈直徑的平均值。結(jié)果判定標準：抑菌圈直徑小于10 mm為不敏感，10～15 mm為中度敏感，15 mm以上為高度敏感[10]。

1.3.2 牛津杯法

參照文獻[9-10],加入藥液量時，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上放5個牛津杯，注入中草藥藥液0.2 mL，其余步驟與文獻保持一致。重復3次,觀察結(jié)果求出平均值。結(jié)果判定標準同1.3.1。

1.3.3 藥敏片法

在超凈工作臺中，按照操作規(guī)范取制作好的中藥藥敏片10片(保證與前二者試驗所加入藥量等同)貼到已涂布好菌液的平皿培養(yǎng)基表面，將平皿培養(yǎng)基置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物敏感性測定結(jié)果

2.1.1 瓊脂平板打孔法結(jié)果

由圖1可見，6號五味子、7號烏梅、9號黃連出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物抑菌圈均不明顯。表1可見，各種中藥對雛沙門氏菌的敏感性不同，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、丹參對雛沙門氏菌基本無抑菌效果；烏梅抑菌圈直徑是13.56 mm，黃連的抑菌圈直徑是12.47 mm，二者對雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感；五味子對雛沙門氏菌的抑菌效果最強，抑菌圈直徑達到16.24 mm，呈高度敏感。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖1 瓊脂平板打孔法試驗結(jié)果Fig. 1 Experimental results of the agar plate-drilling method

表1 10種中草藥瓊脂平板打孔法測定結(jié)果

2.1.2 牛津杯法結(jié)果

由圖2可見，瓊脂平板打孔法與牛津杯法結(jié)果略有不同，6號五味子、7號烏梅出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物并無抑菌圈。表2可見，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、黃連、丹參對雛沙門氏菌均無抑菌效果；五味子、烏梅對雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，其中五味子的抑菌圈直徑達到25.63 mm，對雛沙門氏菌的抑菌效果最好，烏梅抑菌圈直徑為18.77 mm,效果不如五味子。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖2 牛津杯法試驗結(jié)果Fig. 2 Results of oxford cup

表2 10種中草藥牛津杯法測定的結(jié)果

2.1.3 藥敏片法結(jié)果

由圖3可見，6號五味子、7號烏梅出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物并無抑菌圈。表3可見，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、黃連對雛沙門氏菌均無抑菌效果；烏梅對雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感，抑菌圈直徑為14.53 mm；五味子對雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，抑菌圈達到21.42 mm；丹參在3次藥敏片試驗中差距較大，平均值為3.25 mm,分析結(jié)果顯示丹參對雛沙氏門菌抑菌效果一般。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖3 藥敏片試驗結(jié)果Fig. 3 Results of drug-sensitive tablets

表3 10種中草藥藥敏片法測定的結(jié)果

3 討論

3.1 藥物的選取

由于雛沙門氏菌會造成家禽機體敗血癥、下痢，所以本試驗中選取的10味中草藥針對這兩種癥狀選取。其中地骨皮、白頭翁屬于清熱涼血藥，對治療出血癥和血痢有療效；黃連屬于清熱燥濕藥，主治濕熱瀉痢[11]；艾葉屬于溫里藥，但也有止血功能；烏梅與五味子均屬于收澀藥，對久泄久痢療效顯著，具有澀腸澀精的療效[11]；雞矢藤、蒲公英和大青葉屬于清熱解毒藥，現(xiàn)有研究表明三者中某些成分對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用[8，11-13]，其中雞矢藤對胃腸道疾病也有一定效果[14]；丹參也有著很好的抑菌作用[15]。

3.2 中藥體外抑菌試驗方法的選擇

關(guān)于體外抑菌試驗方法測定有很多種，本試驗采取瓊脂平板打孔法、牛津杯法、藥敏片法，這3種方法在試驗中表現(xiàn)結(jié)果各有不同。瓊脂平板打孔法優(yōu)點在于每種藥液相互之間不會接觸污染，但由于細菌生長在瓊脂表面，所以同等量的藥液相對于牛津杯法，抑菌效果較差。牛津杯法優(yōu)點在于藥液在細菌上，對細菌的作用更直接，可以更直觀地反映中草藥對雛沙門氏菌的抑制效果，但牛津杯需要輕放在瓊脂上，按壓過度會使瓊脂破損，每種藥液相互擴散導致試驗失敗；放置過輕會導致牛津杯不穩(wěn)容易灑出藥液，致試驗失敗。中藥藥敏片法藥片吸收的藥量與前二者相同，但試驗結(jié)果表明其藥效較差，分析原因可能藥敏片過薄，吸收藥量有限。通過3種方法的測定比較，我們直觀地發(fā)現(xiàn)烏梅與五味子對雛沙門氏菌抑制效果良好。

4 結(jié)論

目前防治沙門氏菌病主要依靠抗生素，但臨床上沙門氏菌已經(jīng)產(chǎn)生了比較嚴重的耐藥性，在治療過程中常常會選擇多種高敏抗生素對癥治療[16]。但是抗生素的過度使用會破壞腸道免疫屏障，引起菌群失調(diào)，形成耐藥菌株，導致疾病的非典型性和混合性感染，從而增加了防治的難度?？股卦谑秤脛游矬w內(nèi)殘留會增加其耐藥性，直接或間接危害人體健康。同時向環(huán)境排放過量的抗生素會刺激環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生，同時也嚴重破壞了環(huán)境的生態(tài)平衡，成為一種新型的環(huán)境污染。我國中草藥不但種類豐富易獲取，而且成本低。與抗生素相比較，中草藥自身就含有多種有效成分，不容易使細菌產(chǎn)生耐藥性。在預防和抗菌的同時，還能促進動物體生長，提高免疫力，增強動物體對抗疾病的能力。因此，在解決細菌抗藥性和動物體內(nèi)藥物殘留等方面，中草藥的應(yīng)用將會取代抗生素，因而成為人們關(guān)注的焦點。本試驗通過對10種中草藥對雛沙門氏菌的體外抑菌作用的研究，可以看出五味子和烏梅對雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，黃連對雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感，丹參對雛沙門氏菌的抑菌效果為低度敏感，另外6種中草藥都不敏感，表明五味子和烏梅等可以對雛沙門氏菌起到抗菌效果。后續(xù)將繼續(xù)選取不同中草藥進行體外抑菌試驗，并且會對抑菌效果好的中草藥進行體外最小抑菌濃度的測定，以期能篩選出具有最佳抑菌效果的藥物。