于 洋， 馬成瑤， 黃 東， 張彥龍， 曾偉民

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引 言

黑木耳又稱膠耳或樹(shù)耳，是擔(dān)子菌中非常珍貴的一種膠體真菌［1］，是中國(guó)以及一些亞洲國(guó)家最歡迎的食用菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［2］。黑木耳中含有很多如多糖、黑色素和腺苷等豐富的活性成分，對(duì)于黑木耳中含有的大多數(shù)活性成分的特性已有很多報(bào)道［3-4］，但對(duì)黑木耳凝集素以及相關(guān)特性卻很少有報(bào)道。食用菌凝集素是一類普遍存在于真菌中的非免疫來(lái)源的糖蛋白或者蛋白質(zhì)［5］。食用菌凝集素能夠通過(guò)促進(jìn)脾臟細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)人和動(dòng)物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，從而提高機(jī)體的免疫力以達(dá)到抗腫瘤和抗癌的效果［6］。迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)動(dòng)植物凝集素的免疫作用已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究［7］，而對(duì)于食用菌凝集素的免疫調(diào)節(jié)作用的研究還處于發(fā)展階段。研究表明，從靈芝菌絲體中分離的凝集素不僅對(duì)人的淋巴具有免疫抑制作用，還可以抑制幼雌鼠的自身免疫糖尿病，延長(zhǎng)鼠類移植皮膚以及脾臟細(xì)胞的存活期［7］。草菇凝集素對(duì)乳腺瘤細(xì)胞815有一定的抑制作用，并且可以延長(zhǎng)患病小鼠的壽命，是一種很好的免疫增強(qiáng)劑［8］。雞腿菇凝集素可以增加T細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，提高機(jī)體抗腫瘤能力［9］。口蘑中分離的凝集素能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖和抑制白血病細(xì)胞的增殖等［10］。

巨噬細(xì)胞是一種來(lái)源于單核細(xì)胞的位于組織內(nèi)的白血球，它是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分［11-12］，經(jīng)常以不同形式存在于不同組織的免疫效應(yīng)細(xì)胞中［13］。巨噬細(xì)胞既參與特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)又參與非特異性免疫反應(yīng)，并且還是兩者之間的橋梁。巨噬細(xì)胞可以分泌很多不同種類的細(xì)胞因子，能夠有效地吞噬癌細(xì)胞和許多病原微生物［14］。巨噬細(xì)胞還具有遞呈抗原的作用，可以將抗原進(jìn)行加工處理并遞呈給抗原特性T細(xì)胞和B細(xì)胞［15］。因此，本文選用RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討黑木耳凝集素對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的影響，以期為黑木耳凝集素在免疫方面的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳由勃利縣食用菌研究所提供，-20℃保存。黑木耳凝集素由黑龍江大學(xué)生化藥物分析實(shí)驗(yàn)室利用硫酸銨沉淀法粗提后，通過(guò)親和層析法純化得到，命名為L(zhǎng)AA。RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞委托哈爾濱海基生物公司購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit-8購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所；脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；中性紅溶液購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所；吖啶橙購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Imark型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；熒光酶標(biāo)儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；Coulter Z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bechman Coulter公司）；DP10型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BCM-1000型生物凈化工作臺(tái)（上海玻璃儀器廠）；Biofuge 22R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus-Sepatech公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理

選用胎牛血清濃度為10%的RPMI 1460培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，于CO2濃度為5%、溫度為37℃的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，加入1 mL 0.25%的胰酶處理3 min后，添加RPMI 1460培養(yǎng)基終止消化。重復(fù)輕柔吹打后，收集細(xì)胞，用PBS清洗3次，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度進(jìn)行鋪板，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞的形態(tài)觀察

當(dāng)RAW264.7細(xì)胞鋪滿瓶底面積約80%時(shí)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/孔，接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。黑木耳凝集素濃度分別設(shè)置為0、1、5、10、15、25、50、100μg·mL-1，陽(yáng)性對(duì)照孔為1μg·mL-1的LPS，培養(yǎng)24 h。吸盡培養(yǎng)液，倒置顯微鏡鏡檢，拍照。

1.3.3 細(xì)胞毒性的檢測(cè)

采用乳酸脫氫酶試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的毒性，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/孔后，接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。向試驗(yàn)孔及對(duì)照孔中加入不同濃度的黑木耳凝集素，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。到達(dá)預(yù)定時(shí)間的前1 h，在對(duì)照孔中加入LDH釋放液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，在96孔板內(nèi)分別加入120μL待測(cè)培養(yǎng)液。加入LDH檢測(cè)液60μL，避光30 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞毒性（%）。

1.3.4 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)

選擇CCK-8法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性［16］，試驗(yàn)設(shè)置調(diào)零孔只加培養(yǎng)基，96孔板的四周加無(wú)菌水。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。向試驗(yàn)孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，向?qū)φ湛准尤?μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。分別加入CCK-8溶液10μL，孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 細(xì)胞核酸變化的檢測(cè)

采用吖啶橙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞的核酸變化［17］，當(dāng)RAW264.7細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/孔后，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。試驗(yàn)孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，對(duì)照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后，除去含藥培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS清洗2～3次。每個(gè)處理孔內(nèi)加入無(wú)菌4%多聚甲醛，處理15～20 min。除去4%多聚甲醛，用PBS清洗2～3次，每次6 min。每個(gè)處理孔內(nèi)加入預(yù)先配制好的無(wú)菌0.01%吖啶橙溶液，處理10 min后，用PBS清洗2～3次，每次6 min。核酸熒光強(qiáng)度用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次。

1.3.6 細(xì)胞吞噬能力的檢測(cè)

采用中性紅檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的吞噬能力，試驗(yàn)設(shè)置調(diào)零孔只加培養(yǎng)基，96孔板的四周加無(wú)菌水。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/孔后，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。向試驗(yàn)孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，對(duì)照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔分別加入100μL無(wú)菌中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，用無(wú)菌PBS清洗2～3次。每孔加入200μL細(xì)胞裂解液，37℃溫育3 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，按公式（3）計(jì)算中性紅吞噬率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），各組間采用LSD法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化

圖1為在倒置顯微鏡放大200倍的狀態(tài)下觀察的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，圖1（a）未加藥處理組（陰性對(duì)照）的細(xì)胞形態(tài)為圓形、光亮。加入1μg·mL-1LPS（脂多糖）的處理組（陽(yáng)性對(duì)照）細(xì)胞出現(xiàn)了典型的活化后特征，即細(xì)胞體積增大，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎噙呅位蜷L(zhǎng)梭形，如圖1（b）所示。用不同濃度黑木耳凝集素LAA處理RAW264.7細(xì)胞，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)了活化特征，如圖1（c）～1（i）所示。說(shuō)明LAA可以活化RAW264.7巨噬細(xì)胞。

圖1 RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of RAW264.7 cells

2.2 LAA對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞壞死引起的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)性破壞，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶（LDH）釋放出來(lái)。所以通過(guò)檢測(cè)LDH的含量，可以確定LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響。根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。可以看出，隨著LAA濃度的增加，LDH分泌量也逐漸增多，但是與空白對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性差異，表明LAA在100μg·mL-1內(nèi)對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞無(wú)毒性影響。

圖2 不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性檢測(cè)Fig.2 Toxicity test of RAW264.7 cells by LAA with different mass concentrations

2.3 LAA對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響

圖3為不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞活性明顯地增強(qiáng)（P＜0.01），LAA為1μg·mL-1時(shí)，可以促進(jìn)凝集素的增殖。LAA為5～10μg·mL-1，以濃度依賴性極顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性。當(dāng)LAA質(zhì)量濃度為10～100μg·mL-1時(shí)，雖然增加的存活率開(kāi)始下降，但與對(duì)照組相比仍有顯著性增加。結(jié)果顯示，LAA可以增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞活性（P＜0.01）。

圖3 不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of LAA with different mass concentrations on cell proliferationt of RAW264.7

2.4 LAA對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞核酸代謝活性的影響

圖4為不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞核酸代謝活性的影響。可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組LPS可以明顯增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞核酸熒光強(qiáng)度的相對(duì)比例。相對(duì)于空白對(duì)照組來(lái)說(shuō)，通過(guò)LAA處理的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的核酸熒光強(qiáng)度相對(duì)比例都有顯著性增強(qiáng)（P＜0.01）。LAA質(zhì)量濃度為1～10μg·mL-1時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，核酸熒光強(qiáng)度相對(duì)比例呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)（P＜0.01），甚至最高可以達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組的效果。LAA質(zhì)量濃度為15～100μg·mL-1時(shí)，核酸熒光強(qiáng)度相對(duì)比例增強(qiáng)的顯著性（P＜0.05）效果降低，但相對(duì)于空白對(duì)照組仍有增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，LAA可以增強(qiáng)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞核酸熒光強(qiáng)度的相對(duì)比例。

圖4 不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞核酸代謝的影響Fig.4 Effect of LAA with different mass concentrations on nucleic acid metabolism of RAW264.7 cells

2.5 LAA對(duì)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

LPS（脂多糖）能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化成熟，是巨噬細(xì)胞的活化劑。中性紅吞噬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，可以看出，LPS刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞后，其吞噬能力（P＜0.05）明顯提高。LAA刺激RAW264.7細(xì)胞后，與空白組相比，LAA質(zhì)量濃度為1μg·mL-1時(shí)，可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。LAA質(zhì)量濃度為5～10μg·mL-1時(shí)，以濃度依賴性極顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力（P＜0.01）。LAA質(zhì)量濃度為15～100μg·mL-1時(shí)，提高吞噬能力效果逐漸開(kāi)始下降，但與對(duì)照組相比也有顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。表明LAA可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

圖5 不同質(zhì)量濃度的LAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用影響Fig.5 Effect of LAA with different mass concentrations on phagocytosis of RAW264.7 cells

3 討 論

食用菌不僅有食用價(jià)值，而且具有很珍貴的藥用價(jià)值。它不僅富含黑色素、氨基酸和許多微量元素，還含有多糖以及凝集素等藥用成分。近年來(lái)，隨著對(duì)真菌藥理學(xué)研究的深入，食用菌凝集素逐漸成為了研究的熱點(diǎn)［18］。而黑木耳作為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的食用菌，有關(guān)黑木耳凝集素的研究卻很少［19］。本文選用免疫學(xué)最常用的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)黑木耳凝集素的免疫作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)以LPS作為陽(yáng)性對(duì)照組，LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示，加入LPS的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)為圓形、光亮，LPS可以活化巨噬細(xì)胞，加入不同濃度的凝集素后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，出現(xiàn)了活化特征。說(shuō)明黑木耳凝集素LAA可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定了基礎(chǔ)。

LAA可以活化RAW264.7巨噬細(xì)胞。一些真菌活性物質(zhì)在一些免疫學(xué)研究中會(huì)引起毒性的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度LAA處理的RAW264.7進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明LAA處理的RAW264.7無(wú)毒性增長(zhǎng)。巨噬細(xì)胞的活性增強(qiáng)有利于機(jī)體的特異性免疫，改善機(jī)體的免疫功能［20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑木耳凝集素LAA可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定基礎(chǔ)。核酸是一類生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的組成物質(zhì)，核酸代謝活性的增強(qiáng)可以加強(qiáng)免疫［21］。通過(guò)吖啶橙熒光染色法檢測(cè)到加入不同濃度的LAA時(shí)，核酸熒光強(qiáng)度相對(duì)比例有明顯的增強(qiáng)，說(shuō)明LAA可以通過(guò)促進(jìn)核酸代謝活性來(lái)加強(qiáng)免疫能力。巨噬細(xì)胞是抵抗病原菌的重要防線，當(dāng)病原微生物侵入時(shí)，會(huì)識(shí)別抗原的受體，使自身活化，進(jìn)而增強(qiáng)吞噬能力并且清除病原體［22］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAA能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原體的能力。

此外，活化的巨噬細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子。細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的GTP酶和其他蛋白酶作用可以激活MAPKKK，而MAPKK可以被MAPKKK激活，激活后的MAPKK可以激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。胞漿內(nèi)存在大量未被激活的ERK，當(dāng)ERK激活后會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化，從而促進(jìn)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生，IL-1β、IL-6、TNF-α都是由活化的巨噬細(xì)胞分泌的重要的促炎癥因子。黑木耳凝集素可以活化巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以直接殺死病原微生物，清除凋亡細(xì)胞和突變細(xì)胞，并可能通過(guò)分泌免疫活性分子參與并調(diào)控特異性免疫應(yīng)答和天然免疫防御。

4 結(jié) 論

LAA可以刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，使其出現(xiàn)活化特征，并且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響。它可以增加RAW264.7的存活率和核酸代謝活性，能夠顯著增強(qiáng)RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，對(duì)巨噬細(xì)胞的活化有一定的影響。本結(jié)果為L(zhǎng)AA在免疫學(xué)方面的研究提供了重要依據(jù)，并且拓展了黑木耳活性物質(zhì)的合理利用范圍。