姚宗澤 楊肖艷 張艷明 段 忠 趙自仙

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2大理白族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院，云南 大理 671005；3云南省綠色食品發(fā)展中心，云南 昆明 650224)

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)也稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，由2～5 個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成，廣泛分布在整個真核生物基因組中。同一種植物中，在各個位點上重復(fù)單位的數(shù)量也不完全相同，從而形成了多態(tài)性，即SSR 分子標(biāo)記[1]。大量研究表明，除在個別作物中SSR 位點等位基因數(shù)目不多外，很多作物中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，一個SSR 位點等位基因數(shù)目最多可達幾十個[2-3]。不同作物品種的遺傳組成不同，使得基因組DNA 中SSR 的重復(fù)次數(shù)也存在差異，這種差異可先通過PCR 擴增，再借助瓊脂糖凝膠電泳或聚丙稀酸胺凝膠電泳等技術(shù)檢測到SSR[4]。

根據(jù)重復(fù)單位堿基數(shù)可將SSR 分為1～6 核苷酸重復(fù)類型[5]，所有類型的微衛(wèi)星中，單核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星在基因組中出現(xiàn)的頻率最高。同一重復(fù)類型中，不同的堿基重復(fù)多態(tài)性也不一致。大豆中大于15 個重復(fù)單位的(GA)n的多態(tài)性較低，而較多的(AT)n重復(fù)的SSR 具有較高的多態(tài)性信息量[6]。Weber[7]按照微衛(wèi)星核心序列結(jié)構(gòu)的不同將微衛(wèi)星標(biāo)記分為三種類型:完全型(perfect)、不完全型(imperfect)和復(fù)合型(compound)。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR 技術(shù)具有多態(tài)性高、呈共顯性、對DNA 數(shù)量及質(zhì)量要求不高、操作簡單、成本低等優(yōu)點[4]。

相關(guān)研究報道比較了DNA 指紋技術(shù)在植物新品種判定中的可行性，表明DNA 指紋技術(shù)的鑒定結(jié)果客觀可靠[8-12]。SSR 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、馬鈴薯、番茄、棉花和麥類等作物的遺傳作圖、遺傳標(biāo)記、DNA 指紋圖譜、品種鑒定、遺傳多樣性以及遺傳分化等方面的研究[13-16]。劉文彬等[17]篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、適用于自動化分型(熒光毛細管電泳)的9對SSR 引物。胡萍等[18]為構(gòu)建玉米種質(zhì)DNA 指紋庫，分別篩選出作貴州普通玉米和貴州糯玉米的SSR核心引物23 對和15 對。韓鳳龍[19]篩選得到6 個SSR標(biāo)記，適用于河南小麥品種特異性和一致性鑒定。SSR 標(biāo)記應(yīng)用于大豆(Glycine max)[20]、油菜(Brassica campestrisL.)[21]、玉米(Zea mays)[22-23]、番茄(Solanum lyooper)等[24]作物的特異性、一致性、穩(wěn)定性(distinetness，uniformity，stability，DUS)檢測在日益增加。在Maize database 網(wǎng)站上公布的SSR 引物已有1 800 多種，但真正具有利用價值的引物較少，只有那些多態(tài)性高、帶型清晰穩(wěn)定和重復(fù)性好的引物才能被有效應(yīng)用[25]。玉米品種SSR 標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程，推薦了40 對SSR 引物用于品種鑒定，本研究對這40 對引物進行進一步篩選，旨在選出可用于云南玉米雜交種特異性鑒定使用的核心引物，從而降低引物合成成本，加快鑒定程序。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗涉及的220 個雜交玉米品種材料見表1，其中113 個購自云南市場，23 個為云南種業(yè)集團聯(lián)合體提供的2017—2018年區(qū)試品種，33 個為未審定玉米新組配，51 個為未提供品種名稱的已通過云南省審定的雜交玉米品種，在本研究材料名稱中暫記為未知。研究選用的40 對SSR 引物，均為玉米SSR 標(biāo)記鑒定規(guī)程中推薦的引物[26]。

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 用發(fā)芽盒在光照培養(yǎng)箱中培育玉米幼苗，每個品種30 粒，以每天16 h 黑暗/25℃、8 h光照/30℃條件培養(yǎng)6 d，即可取樣提基因組DNA。每個材料剪取20 片相等葉面積的幼苗葉片，每株幼苗取1 片，剪碎充分混合，再取樣提取基因組DNA。

1.2.2 基因組DNA 提取 取約250 mg 葉片，基因組DNA 提取具體步驟參照Saghai-Maroof 等的[27]方法，以100 μL 超純水充分溶解基因組DNA。用瓊脂糖電泳對提取DNA 質(zhì)量進行檢測。

1.2.3 PCR 擴增及普通非變性PAGE PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括Green Taq Mix 12.0 μL、正反向引物合1.0 μL、DNA 1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，整個操作過程均在冰上完成。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min，1次循環(huán)；94℃變性40 s，57～61℃退火35 s，72℃延伸45 s，35 次循環(huán)；72℃，7 min。待PCR 擴增完成后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行檢測。

普通非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegegel gel electrophoresis，PAGE)參照玉米SSR 標(biāo)記鑒定規(guī)程中的要求進行[26]。

1.2.4 引物篩選 試驗先以表1中編號V001-V012雜交玉米品種為材料，從40 對標(biāo)準(zhǔn)SSR 引物中篩選出20 對多態(tài)性高、擴增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物，作為SSR 標(biāo)記分析核心引物。并以表1中的220 個雜交玉米為材料，對所篩選的20 個SSR 核心引物作進一步分析評價。

1.2.5 SSR 遺傳多樣性分析 采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)為指標(biāo)[28]，利用PopGen32 軟件分析不同SSR 標(biāo)記的多樣性大小。Shannon-Weaver 多樣性信息指數(shù)(H′)的計算公式為:

式中，Pi為某個SSR 標(biāo)記位點中第i個等位基因出現(xiàn)的頻率，i≤Na，Na 為SSR 標(biāo)記的等位變異數(shù)目。Ne 為有效等位變異數(shù)[29-30]，其計算公式如下:

1.2.6 聚類分析 根據(jù)220 個雜交玉米材料的基因類型，利用NTSYSpc2.10e 統(tǒng)計軟件中similarity 程序計算相似系數(shù)，以Clustering 程序中SHAN 進行UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，非加權(quán)組平均法)聚類分析[28]獲得品種間的相似系數(shù)。并用MEGA6 軟件中Phylogeny 繪制各玉米品種的遺傳聚類系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 檢測結(jié)果

用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA 樣品質(zhì)量進行檢測，如圖1所示，DNA 條帶明亮、清晰完整、拖尾不明顯。說明所提取的DNA 純度好、質(zhì)量高，雜質(zhì)含量較少，可用于后續(xù)試驗。

2.2 核心引物篩選結(jié)果

用12 個雜交玉米品種對40 個SSR 引物進行篩選，結(jié)果如表2所示，40 對引物中每對引物擴增出6～15 個等位變異位點，共檢測到412 個等位基因，平均每對引物檢測到10.30 個；具有多態(tài)性位點有4～15個，平均每對引物檢測到多態(tài)性位點9.40 個；多態(tài)性位點百分率為50.00%～100.00%，平均每對引物多態(tài)性位點百分率為90.53%。有7 對引物擴增條帶效果較好，16 對引物擴增效果為好，11 對引物擴增效果差，6 對引物擴增效果較差(圖2)。

綜合考慮引物多態(tài)性及擴增效果，篩選出20 對引物，引物編號分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P11、P12、P13、P15、P17、P19、P21、P22、P24、P25、P28、P33，推薦其作為核心引物，在SSR 標(biāo)記鑒定云南雜交玉米品種時優(yōu)先使用。通過分析，20 對核心引物在12 個雜交玉米品種中共檢測到216 個等位基因，20對核心引物檢測到的等位基因占總數(shù)的52.43%，平均每對引物檢測到10.80 個，變幅為7～15 個；具有多態(tài)性位點有4～14 個，平均每對引物檢測到多態(tài)性位點9.70 個；多態(tài)性位點百分率為50.00%～100.00%，平均每對引物多態(tài)性位點百分率為88.66%。

表2 40 對SSR 引物擴增結(jié)果Table 2 Amplification results for 40 pairs of SSR primer

2.3 雜交玉米材料SSR 遺傳多樣性分析

利用PopGen32 軟件分析220 個雜交玉米材料中20 個標(biāo)記的等位變異數(shù)(Na)、有效等位變異數(shù)(Ne)和Shannon-Weaver 多樣性信息指數(shù)(H′)。由表3可知，20 對SSR 核心引物在220 個雜交玉米材料中共檢測到236 個等位變異，平均每個引物檢測到11.80 個，變幅為7～17 個；平均有效等位變異為3.158 8，變幅為1.241 3～5.671 1；平均Shannon-Weaver 多樣性信息指數(shù)為3.028 2，變幅為1.426 2～4.813 9。

2.4 雜交玉米材料聚類分析

采用UPGMA 法對220 個雜交玉米材料進行聚類分析，結(jié)果表明220 個雜交玉米材料間的相似系數(shù)為0.62～0.95，聚類結(jié)果如圖3所示。以最低相似系數(shù)0.62 為閾值可將220 個雜交玉米材料劃分為兩大類群，其中第Ⅰ類群共有10 個雜交玉米材料，占4.5%；第Ⅱ類群共有210 個雜交玉米材料，占95.5%。第Ⅰ類群的10 個雜交玉米材料均為區(qū)試品種，表明該10個區(qū)試品種的親本較其他親本親緣關(guān)系更遠，具有一定的創(chuàng)新性。聚類結(jié)果顯示，良禾668(V198)與宣瑞4 號(V218)的相似系數(shù)最高，為0.95；V187 與勝玉607(V204)的相似系數(shù)最低，為0.62。220 個雜交玉米材料均為在云南各地區(qū)種植的品種和試驗示范的材料，從聚類圖可看出，220 個雜交玉米材料間最高相似系數(shù)達到0.95，但未出現(xiàn)同時有幾個材料聚集在一起的情況，說明本研究所選的材料來源廣泛，具有代表性，研究結(jié)果具有一定的科學(xué)依據(jù)和參考價值。

3 討論

3.1 SSR 核心引物篩選

篩選的20 對SSR 核心引物，在12 個雜交玉米品種中共檢測到216 個等位基因，平均每對引物檢測到10.80 個，變幅為7～15。在220 個雜交玉米材料中共檢測到236 個等位變異，平均每個引物檢測到11.80個，變幅為7～17；平均有效等位變異為3.15 88，變幅為1.241 3～5.671 1；平均Shannon-Weaver 多樣性信息指數(shù)為3.028 2，變幅為1.426 2～4.813 9。從兩組雜交玉米材料的鑒定分析結(jié)果可知，兩組數(shù)據(jù)比較接近，說明該20 對SSR 引物擴增結(jié)果比較穩(wěn)定、重復(fù)性好。20 對SSR 核心引物分布在9 條染色體上，覆蓋90%的玉米染色體組。20 對核心引物在玉米5 號染色體上未分布，在其他染色體上均有分布?？赡苁怯捎谠谟衩? 號染色體上SSR 較少或者多態(tài)性低，也有可能是玉米品種SSR 標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程中推薦的40對標(biāo)準(zhǔn)引物，并不適用于5 號染色體中SSR 的擴增。SSR 在個別作物中存在較少，但廣泛分布在玉米[31]、水稻[32]、大麥[33]等作物中。故推斷這20 對SSR 引物適合用于云南雜交玉米品種的特異性鑒定，推薦其作為核心引物，在云南玉米雜交種特異性鑒定時優(yōu)先使用。

核心引物的確定是SSR 標(biāo)記鑒定的重要組成部分，不僅大大降低了引物合成的成本，而且還可減少很多不必要的工作[34]。如果統(tǒng)一使用一套核心引物，可以比較與整合來自不同研究單位的不同材料的指紋結(jié)果，促進資源共享。Li 等[35]推薦了13 對多態(tài)性較高的核心SSR 引物，認(rèn)為13 對核心引物非常適合用于陸地棉、海島棉和亞洲棉的鑒定和DNA 指紋圖譜構(gòu)建，減少SSR 引物數(shù)量，降低成本。

表3 20 對SSR 標(biāo)記在220 個雜交玉米材料中的多樣性參數(shù)Table 3 Diversity parameters of 20 pairs of SSR markers in 220 maize hybrid materials

3.2 220 個雜交玉米材料多樣性分析

220 個雜交玉米材料間的相似系數(shù)為0.62～0.95，以0.62 為閾值可將材料分為兩大類群，第Ⅰ類群包括10 個玉米材料，第Ⅱ類群包含210 個玉米材料。第Ⅰ類群的10 個雜交玉米材料均為區(qū)試品種，表明該10 個區(qū)試品種的親本較其他親本親緣關(guān)系更遠。聚類結(jié)果顯示，良禾668(V198)與宣瑞4 號(V218)的相似系數(shù)最高，為0.95；V187 與勝玉607(V204)的相似系數(shù)最低，為0.62。盡管有一些雜交玉米材料與其他材料之間存在一定的遺傳差異，但整體差異不大。本研究的220 個雜交玉米材料中不僅包括一些正在區(qū)試的雜交玉米品種，還有已經(jīng)在市場上推廣的雜交玉米品種，說明當(dāng)前培育的雜交玉米品種，與其他作物存在同樣的問題，在基因型上存在同質(zhì)化趨勢，導(dǎo)致很多品種在表型上沒有區(qū)別[36]。導(dǎo)致品種同質(zhì)化的原因，可能是核心親本的集中使用，也有可能是核心親本之間親緣關(guān)系較近。突破這一瓶頸，勢必要加強基礎(chǔ)材料收集、研究與創(chuàng)新[37]。拓寬基礎(chǔ)材料，選擇來源和生態(tài)差異較大的材料，充分發(fā)揮現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)作物新品種培育過程中的作用[38-39]，將有可能培育出綜合性狀優(yōu)良，且超越當(dāng)前主推品種的新品種。

4 結(jié)論

本研究從玉米SSR 標(biāo)記鑒定規(guī)程推薦的40 對SSR 引物中篩選出多態(tài)性高、擴增效果好、穩(wěn)定性好的20 對引物，推薦其作為核心引物，在云南玉米雜交種特異性鑒定時優(yōu)先使用。