陳 志，李偉鵬，胡豐曉，黃 健，陳啟春，魏成陳，連晨陽

（1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州350001；3.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福州350002）

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum），也稱雜色蛤，南方一般俗稱“花蛤”，其他不同地區(qū)也有稱作沙蜆子、沙蛤、蛤蜊等，其隸屬于瓣鰓綱真瓣鰓目簾蛤科蛤仔屬，廣泛分布于中國山東、福建、廣東等沿海，在日本、朝鮮、菲律賓等海區(qū)也多有分布［1］。菲律賓蛤仔肉質(zhì)細(xì)嫩，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，是中國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一［2］，沿海灘涂養(yǎng)殖廣泛，在進行蛤仔人工育苗、養(yǎng)殖過程中，各類消毒劑的使用必不可少。因此，本試驗選用了4種市售常見的消毒劑，以菲律賓蛤仔成貝為試驗對象，進行急性毒性試驗，得出半數(shù)致死濃度和安全濃度等，探究菲律賓蛤仔在4種消毒劑不同濃度下的耐受能力，為菲律賓蛤仔人工育苗和養(yǎng)殖過程中消毒劑的選擇與使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

菲律賓蛤仔選購自福州市倉山區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，測量其平均殼長（3.13±0.22）cm，平均殼寬（2.09±0.15）cm，平均殼高（1.41±0.08）cm，平均重量（6.32±1.07）g，移至實驗室后用海水暫養(yǎng)2 h，期間投喂適量叉邊金藻，并及時剔除死亡個體。

1.2 試驗藥劑

選用了4種常見消毒劑，具體見表1，在試驗前先配制成適宜濃度的母液，試驗過程中可根據(jù)不同濃度梯度取相應(yīng)量的母液進行稀釋，配成所需的試驗暴露濃度，試劑均現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 4種常用消毒劑

1.3 試驗方法

通過預(yù)試驗確定試驗濃度范圍，再在此濃度范圍內(nèi)按照等對數(shù)間距設(shè)置5個濃度梯度，然后將母液稀釋配成4種消毒劑各自對應(yīng)選取的各組濃度，試驗開始時設(shè)置1個空白對照組，每組濃度設(shè)有3個平行試驗組，高錳酸鉀試驗濃度設(shè)置為0.79、2.00、5.00、12.60和31.60 mg/L；聚維酮碘試驗濃度設(shè)置為75.00、120.00、194.00、311.00和500.00 mg/L；二氧化氯試驗濃度設(shè)置為1.73、5.00、14.00、40.00和114.00 mg/L；甲醛試驗濃度設(shè)置為1.00、17.80、31.60、56.00和100.00 mg/L。

試驗方法為靜態(tài)急性毒性試驗法，在白色塑料箱（34 cm×22 cm×21 cm）中進行，每個箱內(nèi)加入已充分曝氣的海水5 L和受試的菲律賓蛤仔10只；試驗期間測得水溫為25.0～25.9℃，pH為7.75～8.05，鹽度為28.0，溶氧量為4～6 mg/L。整個試驗過程不換水、不充氣，持續(xù)96 h，每隔12 h觀察一次，并將死亡個體挑出，防止進一步惡化水體，在24、48、72和96 h時分別對菲律賓蛤仔死亡數(shù)進行統(tǒng)計并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)取試驗組與重復(fù)組的平均值，再利用SPSS19.0軟件Probit回歸分析測算4種消毒劑在各個時間段的95%置信區(qū)間，再通過寇氏法計算出對應(yīng)的半數(shù)致死濃度（LC50），然后由這些數(shù)據(jù)計算出各安全濃度值。其計算公式為：安全濃度（SC）=LC50（96 h）×0.1［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種消毒劑對菲律賓蛤仔的急性毒性結(jié)果

4種消毒劑的半數(shù)致死濃度和安全濃度結(jié)果如表2所示。隨著受試時間的延長，菲律賓蛤仔對4種消毒劑的半數(shù)致死濃度均呈明顯下降趨勢，且各安全濃度從大到小依次為聚維酮碘（11.04 mg/L）＞甲醛（1.87 mg/L）＞二氧化氯（0.68 mg/L）＞高錳酸鉀（0.24 mg/L）。

表2 4種消毒劑對菲律賓蛤仔的半致死濃度和安全濃度

2.2 菲律賓蛤仔中毒表現(xiàn)以及死亡率與濃度關(guān)系分析

2.2.1 高錳酸鉀對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試驗開始后2 h內(nèi)，高錳酸鉀低濃度試驗組（0.79 mg/L）和對照組菲律賓蛤仔活動即恢復(fù)正常，殼口微開，水管已正常伸出過濾水體，部分個體斧足伸出，對比兩試驗組，受試個體狀態(tài)并無明顯差異；24 h時，低濃度組（0.79、2.00 mg/L）與對照組均表現(xiàn)正常，菲律賓蛤仔能正常進行水體交換，水管白凈未泛黃；48 h時，低濃度組（0.79、2.00 mg/L）開始出現(xiàn)死亡個體；96 h時，共有半數(shù)死亡，剩余存活個體活動顯著緩慢，對刺激的反應(yīng)也較遲鈍，水管微微露出，殼口張開呈細(xì)縫狀。高錳酸鉀高濃度試驗組（12.60、31.60 mg/L）中，菲律賓蛤仔一直緊閉雙殼，未見明顯活動，且由于高錳酸鉀呈紫黑色，使菲律賓蛤仔的雙殼表面呈現(xiàn)出深紫色，殼口邊緣有臟物，撈出的死蛤殼口均張開，內(nèi)臟腐爛呈流體狀。各濃度梯度中死亡情率如圖1所示。由圖1可以看出，菲律賓蛤仔對高錳酸鉀較為敏感。隨著高錳酸鉀濃度的增加，死亡率逐漸增加，24 h最高濃度組（31.60 mg/L）死亡率低于40%；48 h各試驗組死亡率均明顯提高，且隨濃度升高而遞增；72 h最低濃度組死亡率也已經(jīng)高達46.7%；96 h最高濃度組（31.60 mg/L）死亡率達100%。從表2可知，高錳酸鉀對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時半數(shù)致死濃度分別為28.61、14.48、6.49、2.41 mg/L，96 h的安全濃度為0.24 mg/L。

圖1 不同濃度高錳酸鉀對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

2.2.2 聚維酮碘對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試

驗開始24 h時，聚維酮碘低濃度組（75.00、120.00 mg/L）和對照組的菲律賓蛤仔活動均恢復(fù)正常，水管伸出，部分個體斧足伸出。聚維酮碘高濃度試驗組（194.00、311.00、500.00 mg/L）個體外殼開始緊閉，1 h后少數(shù)外殼微張、水管微露，6 h后水管較對照組變軟，且明顯發(fā)黑，加以刺激收縮緩慢，24 h內(nèi)均出現(xiàn)死亡個體，存活個體中部分雙殼微張，部分雙殼閉合，但水管露出在外，且無法縮回，同時發(fā)現(xiàn)部分菲律賓蛤仔在死亡時殼雖閉合，但內(nèi)部已腐爛。菲律賓蛤仔死亡率隨各濃度梯度變化如圖2所示。由圖2可以看出，24 h內(nèi)各試驗組死亡率均較低，最高濃度組（500.00 mg/L）死亡率低于30%；48 h后，隨聚維酮碘濃度的升高，菲律賓蛤仔死亡率增加趨勢明顯，且在72 h最高濃度組（500.00 mg/L）死亡率達到100%。從表2可知，聚維酮碘對菲律賓蛤仔 在24、48、72、96 h時 的半數(shù)致死濃 度分別為472.88、317.20、176.26、110.36 mg/L，96 h的安全濃度為11.04 mg/L。

圖2 不同濃度聚維酮碘對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

2.2.3 二氧化氯對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試

驗開始24 h內(nèi)，二氧化氯低濃度試驗組（1.73、5.00 mg/L）和對照組的菲律賓蛤仔活動逐漸恢復(fù)正常，觀察到外殼緩慢張開且水管伸出；48 h時，低濃度組（1.73、5.00 mg/L）與空白對照組均表現(xiàn)正常，出現(xiàn)死亡個體；72 h時，二氧化氯低濃度試驗組（1.73、5.00 mg/L）死亡數(shù)逐漸增多。二氧化氯高濃度試驗組（14.00、40.00、114.00 mg/L）中，菲律賓蛤仔表現(xiàn)為外殼緊閉，在外殼表面能觀察到許多細(xì)小致密的氣泡，且濃度越高，氣泡數(shù)明顯越多，死亡個體外殼張開，內(nèi)部腐爛程度不一，由于二氧化氯具有漂白性，死蛤殼面略微發(fā)白。菲律賓蛤仔死亡率隨各濃度梯度變化如圖3所示。

圖3 不同濃度二氧化氯對菲律賓蛤仔急性中毒死亡率的影響

由圖3可以看出，48 h內(nèi)，菲律賓蛤仔的死亡率隨著二氧化氯濃度的增加而緩慢升高，最高濃度組（114.00 mg/L）在48 h的死亡率未達到50%；96 h時，死亡率隨濃度上升較快，在最高濃度組（114.00 mg/L）中個體全部死亡。從表2可知，二氧化氯對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時的半數(shù)致死濃度分別為116.31、90.21、49.57、6.78 mg/L，96 h的安全濃度為0.68 mg/L。

2.2.4 甲醛對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗試驗開

始24 h內(nèi)，甲醛低濃度試驗組（1.00 mg/L）中的菲律賓蛤仔均正常存活，所有個體外殼微張開并伸出水管，水管彎曲向上，部分水管長度超過體長，活力較好；48 h內(nèi)，甲醛試驗組（17.80 mg/L）開始出現(xiàn)死亡個體。高濃度組（31.60、56.00、100.00 mg/L）中，多數(shù)菲律賓蛤仔緊閉外殼，少數(shù)微張，48 h后，死亡個體急劇增加，且死亡個體內(nèi)部腐爛物流出，剩余空殼，水體表面浮有些許黏稠狀不溶于水的物質(zhì)，試驗水體也變得有些渾濁。

圖4 不同濃度甲醛對菲律賓蛤仔的急性中毒死亡率的影響

由圖4可以看出，24 h內(nèi)各試驗組死亡率均較低，在最高濃度組（100.00 mg/L）中達到33.4%；48 h后，死亡率隨濃度提高迅速攀升，最高濃度組（100.00 mg/L）死亡率高達90%。從表2可知，甲醛對菲律賓蛤仔在24、48、72、96 h時的半數(shù)致死濃度分別為92.00、48.79、24.43、18.67 mg/L，96 h的安全濃度為1.87 mg/L。

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，水產(chǎn)消毒劑的品類也紛繁多樣，但在殺菌過程中除了考慮消毒劑的性質(zhì)外，還必須結(jié)合待消毒物品或生物的自身特點。盡管目前市面上已有許多高效用消毒劑，但仍難以達到徹底將病原微生物殺滅的程度，且某些消毒劑在使用過程對原有生態(tài)環(huán)境可能會產(chǎn)生一定的影響［4］。菲律賓蛤仔大規(guī)模人工育苗過程中，為減少育苗水體環(huán)境中病原微生物，通常要對外殼進行全面消毒，在外界藥物刺激下，活力好的菲律賓蛤仔緊閉外殼，通常除了達到消毒效果，可進一步淘汰活力差的個體，剔除死亡個體。故在選用適合于菲律賓蛤仔的消毒劑上，首先需要考慮消毒劑對菲律賓蛤仔的安全性，再根據(jù)具體情況，在保證能達到殺菌目的的前提下，優(yōu)先使用安全性較高的消毒劑［5］，繼而選出最適合菲律賓蛤仔催產(chǎn)、養(yǎng)殖用的消毒劑。

高錳酸鉀是一種性質(zhì)不穩(wěn)定的強氧化劑，溶于水后含有的結(jié)合態(tài)氧能與有機物接觸釋放出新生態(tài)氧，從而快速氧化蛋白，使其活性基因失活，進而殺滅細(xì)菌［6］。其使用后副作用小，且又具有無污染無殘留等優(yōu)點，被廣泛使用于水產(chǎn)生產(chǎn)中。本試驗中菲律賓蛤仔對高錳酸鉀的安全濃度為0.24 mg/L，而在生產(chǎn)上用于防治魚類病菌常用的潑灑劑量一般是2～5 mg/L，且高錳酸鉀對方斑東方螺面盤幼蟲和雜色鮑幼鮑等貝類毒性較大［7］，故在菲律賓蛤仔的育苗和養(yǎng)殖中需十分注意對高錳酸鉀的使用，濃度和時間必須要控制好；而從高錳酸鉀對菲律賓蛤仔的12、48、36和96 h的LC50來看，幾乎呈現(xiàn)出遂次減半，說明高錳酸鉀在使用過程中會被還原成二氧化錳，并在菲律賓蛤仔呼吸時不斷沉積于鰓部，進而影響其正常呼吸，這與劉銀華等［8］和柯浩等［9］使用高錳酸鉀對各自受試對象試驗所做出的結(jié)論一致。

聚維酮碘是聚乙烯吡咯烷酮與分子碘結(jié)合形成的高分子絡(luò)合物，表面活性劑PVP提供對菌膜的親和力，將其載有的碘與細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)等失活，從而殺滅細(xì)菌［10］。其具有高效、低毒、作用對象廣等優(yōu)點，較早便被投入到各類水產(chǎn)品種養(yǎng)殖中進行使用。本試驗中菲律賓蛤仔對聚維酮碘的安全濃度為11.04 mg/L，遠(yuǎn)高于聚維酮碘在魚蝦類（0.2～0.5 mg/L）、鱉蛙類（0.3～0.7 mg/L）等的養(yǎng)殖生產(chǎn)中的常用潑灑劑量，表現(xiàn)出了較強的耐受能力。

二氧化氯是一種有刺激性氯臭味的強氧化劑，屬于第四代消毒藥劑，具有廣譜、安全、高效等特點，對病菌具有很強的殺滅作用［11］。當(dāng)其溶解在水中，會迅速吸附聚集在病毒的顆粒表面，破壞病毒衣殼上的蛋白質(zhì)，抑制其特異性吸附，阻止對宿主細(xì)胞的感染［12，13］。二氧化氯具有很強的殺菌能力，藥性的持續(xù)時間也較長，有試驗表明，當(dāng)用2.0 mg/L的劑量作用30 min時就能殺死幾乎100%的病原微生物［14］。本試驗中菲律賓蛤仔對二氧化氯的安全濃度為0.68 mg/L，相較于已有報道的一些魚蝦類養(yǎng)殖品種，菲律賓蛤仔對二氧化氯的表現(xiàn)較為敏感，但仍高于生產(chǎn)上二氧化氯在水體潑灑的常用量（0.1～0.3 mg/L）［15］，故綜合考慮二氧化氯的諸多方面，就菲律賓蛤仔病害防治來說是較為理想的消毒劑。

水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用甲醛溶液濃度通常在40%左右，也被稱為福爾馬林，歸屬于醛類消毒劑，具強烈刺激性氣味，通過阻止細(xì)菌核蛋白的合成或是抑制細(xì)菌蛋氨酸的合成影響細(xì)胞或細(xì)菌的正常生理代謝功能最終致死，達到殺菌殺蟲的目的［16］。本試驗中甲醛表現(xiàn)出較強的毒性，隨著藥物在體內(nèi)積累，48 h致死率較高，菲律賓蛤仔對甲醛溶液的安全濃度為1.87 mg/L，遠(yuǎn)低于一些養(yǎng)殖魚類的安全濃度劑量，但高于方斑東風(fēng)螺面盤幼體的安全濃度（0.28 mg/L）［17］，這說明菲律賓蛤仔對甲醛較為敏感，但是否由其生物特性所致，還需進一步加以驗證。雖然甲醛價廉，水體消毒效果也較好，但長期頻繁使用也會影響到養(yǎng)殖生物的健康，且藥物在生物體內(nèi)殘留時間不確定，故一般不推薦優(yōu)先使用甲醛作為菲律賓蛤仔的消毒劑。

4 結(jié)論

本試驗采用靜態(tài)水試驗法，期間不換水不喂藻，以期試驗結(jié)果更加接近真實值，但在試驗中存在某些不可控因素，如難以做到試驗環(huán)境條件完全不變，加之深夜死亡的菲律賓蛤仔未能及時挑出，加劇了試驗水質(zhì)的惡化，對存活的菲律賓蛤仔造成一定程度的影響。結(jié)果表明，4種消毒劑對菲律賓蛤仔的毒性大小為高錳酸鉀＞二氧化氯＞甲醛＞聚維酮碘。綜合4種消毒劑的各方面效能，在菲律賓蛤仔的催產(chǎn)育苗過程中宜選用聚維酮碘進行消毒，最適使用濃度還有待繼續(xù)探究；在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，消毒藥劑對菲律賓蛤仔的毒性還會受到養(yǎng)殖水體溶氧、pH、水溫、自身狀態(tài)等系列因素影響，故在使用消毒劑時要密切觀察菲律賓蛤仔的活動情況，視具體情況調(diào)整消毒劑的使用濃度和消毒時間以確保安全。