周 怡，李婷婷，郭映純，賈 磊，何姝婧，方 叢

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510655）

在體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）治療中，獲得具有受精和胚胎發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)卵子對妊娠結(jié)局至關(guān)重要。良好的卵泡微環(huán)境是保障卵子獲得充分發(fā)育潛能的必要條件。神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophins，NTs）家族是一類分泌性多肽類生長因子，最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠調(diào)控神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長、分化和凋亡等［1］。近年來眾多研究表明NTs 在卵子發(fā)育和卵泡微環(huán)境中同樣發(fā)揮著重要作用［2］。神經(jīng)營養(yǎng)因子4（neurotrophin-4，NT-4）是NTs家族的成員之一，在多種哺乳動物和人的卵巢中均有表達(dá)，并且參與卵泡募集、卵泡發(fā)育和卵子成熟的過程［3］。小鼠卵巢中NT-4 的水平隨著卵泡募集的進(jìn)程而增加，NT-4基因敲除小鼠的初級和次級卵泡發(fā)育明顯受阻［4］。在體外培養(yǎng)的人胎兒卵巢組織中，NT-4 能夠促進(jìn)卵泡募集［5］。Seifer等［6］發(fā)現(xiàn)NT-4能提高小鼠體外成熟卵子的成熟率。除了對卵子的作用外，NT-4還能上調(diào)小鼠顆粒細(xì)胞中FSHR 基因表達(dá)和促進(jìn)cyclin D2 的合成，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖［7］。NTs主要通過與兩類受體結(jié)合發(fā)揮作用，分別是特異性的高親和力酪氨酸相關(guān)激酶（tropomyosin-related kinase，Trk）受體和非特異性的低親和力p75 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）。Trk 受體家族包括TrkA，TrkB 和TrkC三種受體，其中TrkB 受體是NT-4 的特異性受體。TrkB 敲除小鼠原始卵泡和次級卵泡數(shù)量減少［4，7］，顆粒細(xì)胞的增殖抑制［8］。TrkB 受體主要有全長型（full-length TrkB receptor，TrkB-fl）和截短型（truncated TrkB receptor，TrkB-t1）兩種不同亞型［9］，它們在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異。在小鼠和人類卵巢中均發(fā)現(xiàn)了TrkB-fl 和TrkB-t1 的表達(dá)［10-11］。NT-4及其受體TrkB 在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，然而既往研究主要針對NT-4 在早期卵泡發(fā)育中的作用，僅Seifer 等［6］的動物實驗發(fā)現(xiàn)NT-4 能夠促進(jìn)卵子成熟。NT-4是否會影響人卵子成熟和發(fā)育潛能，及不同亞型TrkB 受體在其中是否發(fā)揮不同作用，目前尚無相關(guān)研究。因此本研究擬探索人卵泡液中NT-4 水平及卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-fl 和TrkB-t1 表達(dá)量與卵子發(fā)育潛能的關(guān)系，為進(jìn)一步了解影響卵子發(fā)育的機(jī)制，及探索其在IVF/ICSI 治療中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

納入2020 年5 月至2020 年11 月期間，在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受ICSI 治療的患者共63 例。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡＜40 歲；因男方因素行ICSI治療；獲卵數(shù)≥5個且抗苗勒氏管激素（anti-müllerian hormone，AMH）≥1.1 ng/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)為：鈣激活周期；卵子經(jīng)體外成熟（in vitro maturation，IVM）；胚胎移植前遺傳學(xué)篩查/移植前基因診斷（preimplantation genetic screening/preimplantation genetic diagnosis，PGS/PGD）周期；多囊卵巢綜合征，子宮內(nèi)膜異位癥和子宮因素相關(guān)的不孕。本研究通過中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院倫理委員會審查（批件編號：2020ZSLYEC-277），并獲得所有研究對象知情同意。

1.2 控制性卵巢刺激和ICSI受精

根據(jù)患者具體情況選擇長方案或拮抗劑方案促排卵。長方案于黃體中期注射促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a；醋酸曲普瑞林，達(dá)菲林，輝凌制藥）進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)。14 d 后行陰道B 超及性激素檢查，如達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)：雌激素（estrogen，E2）＜50 pg/mL、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）≤5 U/L、子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm，予促性腺激素（gonadotropin，Gn）啟動促排卵。拮抗劑方案于月經(jīng)周期第2 天予Gn啟動促排卵，當(dāng)優(yōu)勢卵泡平均直徑達(dá)12～14 mm時，每天皮下注射GnRH 拮抗劑（加尼瑞克，默沙東）0.25 mg 直到扳機(jī)日。每2～4 d 通過陰道B 超及血激素水平監(jiān)測卵泡，根據(jù)卵巢反應(yīng)調(diào)整Gn 劑量。當(dāng)至少1個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm，肌注5 000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素（hCG，珠海麗珠醫(yī)藥）或皮下注射重組人絨促性素（艾澤，默克雪蘭諾）250 μg 扳機(jī)。36～38 h 后在超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。

將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs）于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h，80 U/mL 透明質(zhì)酸酶（vitrolife，瑞典）脫去卵丘顆粒細(xì)胞，于倒置顯微鏡下挑選出M Ⅱ期卵子置于IVF 液（vitrolife，瑞典）中，按照ICSI 標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行受精。

1.3 胚胎培養(yǎng)和移植

ICSI后16～18 h評估卵子受精情況，出現(xiàn)兩個原核判斷為正常受精。正常受精卵子置于胚胎培養(yǎng)液（Sage，美國）中繼續(xù)培養(yǎng)。D3 胚胎按照Racowsky標(biāo)準(zhǔn)［12］進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分，可利用胚胎標(biāo)準(zhǔn)為4細(xì)胞1級或5個及以上細(xì)胞1～2級胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為卵裂球6～9 的1～2 級胚胎。根據(jù)胚胎情況和患者意愿選擇1～2 個D3 優(yōu)質(zhì)胚胎新鮮移植或冷凍，其余胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)或冷凍。囊胚依據(jù)囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞，采用Gardner's評分系統(tǒng)［13］評價，D5 評分≥3BB 定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。取卵后第3或5天新鮮胚胎移植，移植后予常規(guī)黃體支持。胚胎移植14 d后查血清β-hCG，35～42 d后B超下觀察到宮內(nèi)孕囊及胎心搏動確定為臨床妊娠.

1.4 卵泡液收集和NT-4檢測

取卵過程中收集患者第一管無血污染的卵泡液，每管卵泡液以2 000 r/min，4 ℃離心10 min（r=18 cm）去除細(xì)胞沉淀和雜質(zhì)，取上清保存于-80 ℃。使用人NT-4 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（Human NT-4 ELISA Kit，伊萊瑞特，E-EL-H6094）檢測卵泡液中NT-4濃度，檢測范圍為31.25～2 000 pg/mL，靈敏度為18.75 pg/mL，板間及板內(nèi)變異系數(shù)＜10%。

1.5 卵丘顆粒細(xì)胞總RNA提取及實時熒光定量PCR

收集每個患者全部COCs拆卵后分離的卵丘顆粒細(xì)胞，1 500 r/min，4 ℃離心5min（r=6 cm），棄上清，用磷酸鹽緩沖液清洗2 次后保存于-80 ℃。使用Trizol（Invitrogen，15596026）提取卵丘顆粒細(xì)胞中總RNA，NanoDrop2000 測定RNA 濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit（Takara，RR047A）合成cDNA，按照SYBR Green qRCR Master Mix（Genstar，A311）說明書在Racho Lightcycler480 中進(jìn)行實時熒光定量PCR。PCR 擴(kuò)增引物序列為：TrkB-fl sense：5'-CCCCAGGAGGTGTATGA-3’和antisense：5’-CAGCCCGTCTGAGGAGTA-3’；TrkB-t1 sense：5’-TAGATGTGGGCGGTGTTT-3’和antisense：5’-ATGGGATTTCATTTCA GTTT-3’；GAPDH sense： 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’和antisense：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。以GAPDH 為內(nèi)參基因，確定本研究中一位患者的基因表達(dá)水平為對照，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用Student’s t檢驗。不符合正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，組間比較用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)進(jìn)行分析。多重線性回歸分析以優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為因變量，逐步法納入年齡、AMH、獲卵數(shù)等相關(guān)因素。雙側(cè)檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本資料和促排情況

患者的基本資料和促排情況見表1。本研究納入的患者63.49%（40/63）為原發(fā)性不孕，36.51%（23/63）為繼發(fā)性不孕。17.46%（11/63）的患者使用拮抗劑方案，82.54%（52/63）的患者使用長方案促排卵。其中52 例患者進(jìn)行了囊胚培養(yǎng)，45 例患者行新鮮胚胎移植，其中43 例移植D3 胚胎，2 例移植D5囊胚，臨床妊娠率為53.55%（24/45）。

2.2 卵泡液中NT-4水平與促排卵結(jié)局相關(guān)性分析

卵泡液中NT-4水平與促排卵結(jié)局的相關(guān)性分析如圖1 所示。卵泡液NT-4 與正常受精數(shù)（rs=0.250，P=0.048）、可利用胚胎數(shù)（rs=0.320，P=0.011）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（rs=0.327，P=0.009）和優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)（rs=0.303，P=0.029）正相關(guān)。獲卵數(shù)和成熟卵子數(shù)與卵泡液中NT-4水平無相關(guān)性。

表1 患者的基本資料和促排情況Table 1 Baseline and treatment characteristics of patients

2.3 不同卵子質(zhì)量間卵丘顆粒細(xì)胞TrkB 受體表達(dá)水平比較

不同卵子質(zhì)量間卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-fl 和TrkB-t1 表達(dá)水平比較結(jié)果如表2 和圖2、3 所示。TrkB-fl 和TrkB-t1 在不同卵子成熟率（≥75%和＜75%）、受精率（≥70%和＜70%）及優(yōu)質(zhì)胚胎率（≥50%和＜50%）組間表達(dá)無差異。TrkB-t1 在高囊胚形成率組（≥60%）中的表達(dá)顯著低于低囊胚形成率組（＜60%）［0.86（0.60，1.85）vs.2.29（1.09，3.44），P=0.008］，在高優(yōu)質(zhì)囊胚率組（≥50%）的表達(dá)低于低優(yōu)質(zhì)囊胚率組（＜50%）［0.84（0.64，1.45）vs.1.73（0.96，3.14），P=0.031］。TrkB-fl基因在不同囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率組間的表達(dá)無差異。

2.4 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)相關(guān)因素多重線性回歸分析

以優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為因變量，納入年齡、AMH、獲卵數(shù)、卵泡液NT-4 和卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1 表達(dá)水平，通過逐步法篩選自變量，進(jìn)行多重線性回歸分析，結(jié)果見表3。優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)受獲卵數(shù)（P=0.001）、卵泡液中NT-4 水平（P=0.005）和卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1表達(dá)水平影響（P=0.049）。

2.5 不同臨床妊娠結(jié)局間比較

不同臨床妊娠結(jié)局患者間的比較如表4 所示。臨床妊娠組年齡低于非妊娠組（30±3.8vs.33±3.4，P=0.015），不孕年限也明顯短于非妊娠組（3.3±1.8vs.5.2±3.1，P=0.017）。卵泡液中NT-4及卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-fl和TrkB-t1表達(dá)水平無顯著差異。

圖1 卵泡液中NT-4水平與促排卵結(jié)局相關(guān)性分析Fig.1 The corrlation between NT-4 level in follicular fluid and outcomes of ovary stimulation

表2 不同卵子質(zhì)量間卵丘顆粒細(xì)胞TrkB-fl和TrkB-t1表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of relative TrkB-fl and TrkB-t1 expression level in groups with different oocyte competence ［M（P25，P75）］

圖2 不同卵子質(zhì)量間卵丘顆粒細(xì)胞TrkB-fl表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of relative TrkB-fl expression level in groups with different oocyte competence

圖3 不同卵子質(zhì)量間卵丘顆粒細(xì)胞TrkB-t1表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of relative TrkB-t1 expression level in groups with different oocyte competence

表3 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)相關(guān)因素多重線性回歸分析Table 3 Multiple regression analysis of potential variables related to the number of top-quality embryos

3 討論

卵子的發(fā)育潛能受全身和局部多種因素影響，卵泡微環(huán)境中卵泡液和卵丘顆粒細(xì)胞與卵子間有著豐富的物質(zhì)信息交流，共同支持卵子在發(fā)育過程中獲得充分的發(fā)育潛能［14］。卵泡微環(huán)境中多種NTs 及其受體的水平已被發(fā)現(xiàn)與卵子質(zhì)量和卵巢功能相關(guān)。如多囊卵巢綜合征患者卵泡液中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）水平顯著升高，動物實驗也證實高濃度NGF 會抑制卵子成熟［15］。而卵泡液中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平與卵子成熟率及卵裂率正相關(guān)［16］。Buyuk 等［17］發(fā)現(xiàn)卵巢儲備下降患者卵丘顆粒細(xì)胞中TrkA 和p75NTR 表達(dá)降低。研究NTs 在卵泡微環(huán)境中的作用對于進(jìn)一步了解影響卵子發(fā)育的機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)人卵泡液中NT-4水平與卵子的受精能力和形成胚胎的質(zhì)量正相關(guān)，這提示NT-4 可能影響了卵子的發(fā)育潛能。BDNF 和NT-4 都是TrkB 受體的配體，在卵泡募集和生長發(fā)育中發(fā)揮著同樣重要作用，且在卵泡發(fā)育過程中能夠代償相互之間的作用［4］。雖然目前僅在小鼠中證實NT-4能促進(jìn)卵子成熟，但BDNF 已在多種哺乳動物及人中發(fā)現(xiàn)與卵子成熟和發(fā)育潛能相關(guān)。BDNF 能提高小鼠和豬卵子IVM 的成熟率，而且能夠促進(jìn)小鼠體外成熟的卵子形成具有植入潛能的胚胎［18］。在牛IVM 體系中添加BDNF 有利于卵子成熟和囊胚形成［19］。人卵泡液中BDNF 也被認(rèn)為在卵子成熟和形成胚胎過程中有重要作用［16］。因為和BDNF作用于相同的受體，以及它們之間的相互代償作用，因此我們認(rèn)為NT-4 同樣可能在人卵子成熟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。但本研究為觀察性研究，NT-4 影響人卵子發(fā)育潛能的具體作用機(jī)制，以及能否將其用于IVM 體系中改善胚胎質(zhì)量，還需要更多的動物及人體實驗證實。

表4 不同臨床妊娠結(jié)局間患者情況比較Table 4 Comparison of baseline and treatment characteristics of patients between different clinical pregnant outcomes ［M（P25～P75），（）］

表4 不同臨床妊娠結(jié)局間患者情況比較Table 4 Comparison of baseline and treatment characteristics of patients between different clinical pregnant outcomes ［M（P25～P75），（）］

FSH：follicle-stimulating hormone；AMH：anti-Müllerian hormone；Gn：gonadotrophin；MⅡ：metaphase Ⅱ；FF：follicular fluid；NT-4：Neurotrophin-4；TrkB-fl：full-length tropomyosin-related kinase B receptor.TrkB-t1：truncated tropomyosin-related kinase B receptor.1）P＜0.05.

TrkB-fl 是典型的酪氨酸激酶受體，與配體結(jié)合后磷酸化胞內(nèi)酪氨酸激酶，進(jìn)一步激活Ras/MAPK、PLCγ1 和PI3K/Akt-mTOR 等下游信號通路［20］。TrkB-t1 則缺乏胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，無法激活細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。但TrkB-t1 能夠與TrkB-fl 形 成 異 二 聚 體，抑 制TrkB-fl 的 活 性［9］。TrkB-fl 和TrkB-t1 在神經(jīng)系統(tǒng)不同的部位以及不同疾病狀態(tài)下表達(dá)不同［21］，同樣它們在卵巢中也表現(xiàn)出不同的分布模式。在小鼠早期卵泡發(fā)育過程中，TrkB-fl 在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中維持穩(wěn)定的低水平表達(dá)，而TrkB-t1選擇性表達(dá)于卵母細(xì)胞中，排卵前卵母細(xì)胞在促性腺激素的作用下TrkB-fl 表達(dá)迅速升高［8，22］。Anderson 等［23］發(fā)現(xiàn)人COCs 的卵子和卵丘顆粒細(xì)胞中均有TrkB-t1 的表達(dá)，而TrkB-fl 未檢測到。本研究在卵丘顆粒細(xì)胞中同時檢測到TrkB-fl 和TrkB-t1 的表達(dá)，TrkB-t1 的表達(dá)更為豐富。關(guān)于不同TrkB 亞型在卵子發(fā)育過程中的作用尚無研究報道，本研究結(jié)果顯示卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1的表達(dá)量與卵子發(fā)育成囊胚的能力負(fù)相關(guān)。在神經(jīng)細(xì)胞中TrkB-t1 的高表達(dá)會引起TrkB-fl/TrkB-t1 之間的失衡，從而加速神經(jīng)元退化［24］。因此卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1的高表達(dá)可能會抑制TrkB-fl 的激活，通過影響卵丘顆粒細(xì)胞的功能從而影響卵子的發(fā)育。但有研究發(fā)現(xiàn)TrkB-t1除了發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用外，還能通過不依賴于NT-4 或者BDNF 方式激活自身來發(fā)揮功能［9］。所以TrkB 受體的不同亞型在卵泡發(fā)育中作用仍然需要進(jìn)一步的實驗探索。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中NT-4和卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1 表達(dá)與胚胎質(zhì)量相關(guān)，但在不同臨床妊娠結(jié)局間無差異。這可能是因為納入本研究的患者基礎(chǔ)情況較好，大部分行胚胎移植的患者至少有一個優(yōu)質(zhì)胚胎，而我們只比較了新鮮移植周期的妊娠結(jié)局。卵泡液中NT-4 和卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1基因表達(dá)能否預(yù)測累計妊娠結(jié)局，有待進(jìn)一步探討。除此之外，在本研究中卵泡液和卵丘顆粒細(xì)胞并非對應(yīng)到單個卵子，因此NT-4 和不同TrkB 受體亞型對不孕癥患者卵子發(fā)育潛能的預(yù)測價值，還需要更多的研究探索。

綜上所述，ICSI 周期中卵泡液NT-4 水平與卵子受精和發(fā)育成胚胎的能力正相關(guān)，卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1基因表達(dá)與囊胚發(fā)育能力負(fù)相關(guān)。NT-4在卵子成熟發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要作用，而卵丘顆粒細(xì)胞中TrkB-t1的高表達(dá)與卵子發(fā)育潛能受損有關(guān)。這為我們未來在IVF/ICSI 中尋找預(yù)測卵子質(zhì)量的標(biāo)志物，和探索提高卵子發(fā)育潛能的可能措施提供了線索。