劉晨曦,侯黎明,周五朵,徐燕,尹彥鎮(zhèn),周天威,李平華*,黃瑞華*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院，江蘇 淮安 223005；3.江蘇省畜牧總站，江蘇 南京 210036)

中國太湖流域地方豬種包括二花臉豬(EHL)，梅山豬(MS)，楓涇豬(FJ)，米豬(MI)，嘉興黑豬(JXB)，沙烏頭豬(SWT)和紅燈籠豬(HDL)。其中，梅山豬根據(jù)體型大小分為中型梅山豬(MMS)和小型梅山豬(SMS)兩個亞群[1]。這些豬種均具有耐粗飼，優(yōu)秀的肉質(zhì)和出色的繁殖性能[2-4]，為商品豬的持續(xù)選育提供了寶貴的遺傳資源[2]。

太湖流域地方豬獨特的表型，意味其可能具備獨特的遺傳結(jié)構(gòu)。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群在聚類模式上可以相互區(qū)分，說明各個群體間的遺傳起源上獨立，結(jié)構(gòu)并不完全一致[5-7]。并且發(fā)現(xiàn)米豬和二花臉豬之間遺傳關(guān)系更為接近[6]。

研究人員利用太湖流域地方豬種鑒定到多個與體重體尺相關(guān)的候選基因(QTLs)，SUN等[8]在梅山豬兩個亞群中鑒定到SPDEF，PACSIN1等與體重相關(guān)的基因在這兩個亞群間受到不同方向的選擇，用皮特蘭和梅山豬雜交的F2代群體，鑒定到3號染色體影響日增重的QTL[9]，以及影響該F2代群體的生長性狀和胴體性狀的FTO基因[10]。已有研究對象沒有涵蓋該地區(qū)地方豬種現(xiàn)存的全部血統(tǒng)，并且關(guān)于太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群間體重體尺差異的遺傳機制的研究不充分，沒有利用其他遺傳結(jié)構(gòu)接近但體型差異顯著的豬種進行驗證分析。為了解決以上問題，本研究采集了440頭代表太湖流域地方豬最全面血統(tǒng)的豬群樣本，利用豬50 K芯片獲得每個樣本的基因分型數(shù)據(jù)，對基因分型數(shù)據(jù)集進行群體結(jié)構(gòu)分析和選擇位點鑒定。本研究結(jié)果全面解析了太湖流域地方豬群體結(jié)構(gòu)，并可為深入解析這些群體體重體尺性狀差異提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

采集440頭二花臉豬(EHL)，楓涇豬(FJ)，米豬(MI)，嘉興黑豬(JXB)，沙烏頭豬(SWT)，紅燈籠豬(HDL)，中型梅山豬(MMS)和小型梅山豬(SMS)的耳組織樣。二花臉豬(n=111)分別從常州市，常熟市和蘇州市的保種場采集，小型梅山豬(n=71)分別從太倉市和蘇州市的保種場采集，中型梅山豬(n=65)從昆山市保種場采集，楓涇豬(n=23)從蘇州市的保種場采集，米豬(n=59)從常州市的保種場采集，嘉興黑豬(n=40)從嘉興市的保種場采集，沙烏頭豬(n=41)從南通市的保種場采集，紅燈籠豬(n=30)從溧陽市的保種場采集。這440頭個體可以涵蓋江蘇省太湖流域地方豬保種群的全部血統(tǒng)。采樣的所有公豬和母豬在3代內(nèi)沒有共同血親。

1.2 個體基因組信息鑒定和收集

將440頭豬耳組織樣本用常規(guī)的苯酚/氯仿方法提取DNA，并稀釋至最終濃度50 ng/μL，然后采用北京康普森公司研發(fā)的豬50 K基因型芯片(測序平臺為美國Illumina公司提供)進行基因分型，芯片總計含有51 315個SNP位點?；蛐洼斎胛募D(zhuǎn)換為PLINK v1.07格式文件[11]用于后續(xù)分析。

對PLINK格式文件進行SNP位點質(zhì)控，具體條件為：單個個體SNP位點檢出率大于90%，每個SNP檢出率大于90%，微小等位基因頻率大于5%。所有未知位置信息和性染色體上的SNP位點都剔除。經(jīng)過質(zhì)控，獲得總計29 754個滿足條件的SNP位點。此外，采用上述SNP位點質(zhì)控原則，在65頭中型梅山豬和71頭小型梅山豬群體內(nèi)部進行質(zhì)控，經(jīng)過質(zhì)控得到總計21 850個有效SNP位點；在111頭二花臉和59頭米豬個體進行質(zhì)控并得到29 754個有效SNP位點。

1.3 群體間遺傳距離(1-Dst)計算

為了估計個體間的遺傳距離，使用PLINK v1.07軟件計算了等位基因共享比例(Dst)[11]。所有個體之間的遺傳距離計算公式為(1-Dst)[12]?；?1-Dst)矩陣，使用MEGA v6.0軟件[13]計算兩兩群體之間平均遺傳距離的大小。使用群體間遺傳距離(1-Dst)矩陣構(gòu)建聚類樹熱圖，通過內(nèi)部R腳本進行可視化。

1.4 群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)計算

使用Wright’s F-derived統(tǒng)計法來計算品種間遺傳分化系數(shù)Fst[14]，使用GENEPOP v4.2軟件[15]進行相關(guān)計算。不同的Fst值代表的意義為：Fst在0～0.05表示較低的遺傳分化，F(xiàn)st在0.05～0.15表示中等的遺傳分化，F(xiàn)st在0.15～0.25表示較高的遺傳分化，F(xiàn)st高于0.25表示高度遺傳分化[16-17]。使用群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)矩陣構(gòu)建了聚類樹熱圖，并通過內(nèi)部R腳本進行可視化。

1.5 群體結(jié)構(gòu)分析

基于SNP基因型數(shù)據(jù)，使用ADMIXTURE v1.23軟件[18]推斷出最可能的祖先血統(tǒng)組成(K)，即假定有K個祖先存在的前提下，每個群體內(nèi)含有的各祖先血統(tǒng)的比例，根據(jù)最小交叉驗證誤差(CV-error)的原則確定最大K值。對于太湖流域地方豬，使用內(nèi)部R腳本將K=2～8的結(jié)果進行可視化。為了增加ADMIXTURE分析的準(zhǔn)確性，并避免由這些群體的不同樣本量引起的潛在偏差，我們從每個群體中隨機選擇了23頭個體進行ADMIXTURE分析。

1.6 受選擇SNP位點鑒定

使用GENEPOP v4.2軟件[16]進行中型梅山豬和小型梅山豬群體間Fst分析，每個SNP位點計算得到相應(yīng)遺傳分化(Fst)值。對于所有SNP位點的Fst值，采用Z檢驗，鑒定極顯著(P<0.01)偏離整體Fst均值的SNP位點[19]，并將這些SNP位點作為在梅山豬亞群間受選擇的候選SNP位點。采用相同計算原理鑒定二花臉和米豬群體間受選擇的候選SNP位點。最終，將梅山豬亞群間候選SNP位點與二花臉和米豬群體間候選SNP位點取交集，作為更有可能的受選擇位點。

1.7 候選基因注釋

對SNP位點上下游各50 kb[20]的區(qū)域內(nèi)進行基因注釋，使用豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)，注釋網(wǎng)站為ensemble官網(wǎng)(http://www.ensembl.org)。

1.8 受選擇SNP位點間連鎖不平衡分析

在人為或自然選擇的壓力下，優(yōu)勢等位基因型頻率會不斷上升，并且由于“搭車效應(yīng)”形成選擇性清除區(qū)域，選擇性清除區(qū)域附近的SNP位點連鎖不平衡程度加深[21]。為了進一步確定候選SNP位點受選擇的可能性，我們使用PLINK v1.07軟件[13]來檢測位于同一染色體且位置距離接近的多個受選擇SNP位點間的連鎖不平衡情況(r2)。執(zhí)行命令“Plink-file-r2”，通過SNP位點間的相關(guān)系數(shù)r2值來估算連鎖不平衡(LD)程度，并以r2值0.3作為閾值來衡量位點間是否存在連鎖不平衡[12,22]。

1.9 受選擇SNP位點與豬體重體尺等性狀QTLs注釋

對于1、3和6號染色體受到選擇的SNP位點形成的受選擇區(qū)域(相應(yīng)染色體彼此位置距離接近且強連鎖的多個受選擇SNP位點，以位置距離最小的SNP位點作為起點，位置距離最大的SNP位點作為終點，形成的受選擇區(qū)域)進行豬體重體尺等相關(guān)性狀QTLs注釋，注釋網(wǎng)站為PigQTLdb官網(wǎng)(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)。

2 結(jié)果與分析

2.1 太湖流域地方豬群體內(nèi)部結(jié)構(gòu)

2.1.1 太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群間遺傳關(guān)系

由表1可知，在太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群間的遺傳距離(1-Dst)分析中，群體間遺傳距離最為接近的是二花臉和米豬，群體間遺傳距離為0.100，其次較為接近的是中型梅山豬與小型梅山豬，群體間遺傳距離為0.153。二花臉和米豬間的遺傳距離比梅山豬兩個亞群更為接近。

表1 太湖流域8個地方豬群體間遺傳距離(1-Dst)

8個地方豬在群體間遺傳分化方面的分析結(jié)果如表2所示。中型梅山豬與小型梅山豬群體間的遺傳分化程度最小，遺傳分化系數(shù)為0.264，其次為楓涇和嘉興黑間的遺傳分化系數(shù)，數(shù)值為0.278，排在第三的是二花臉和米豬間的遺傳分化系數(shù)，數(shù)值為0.282。所有群體間的遺傳分化系數(shù)都超過0.250。

表2 太湖流域8個地方豬群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)

2.1.2 太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群間ADMIXTURE分析

為了判定太湖流域地方豬各品種及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群間的進化路線，進行了ADMIXTURE分析，結(jié)果如圖1所示。圖1展示了K值為2～8的結(jié)果，在K值為8時，ADMIXTURE分析擁有最小的交叉檢驗誤差(CV-error)，梅山豬兩個亞群的K值為2～5，這兩個群體都保持著一致的祖先血統(tǒng)組成，K值為6時，分化成兩個不同的群體。二花臉和米豬的K值為2～7時，這兩個群體都保持著一致的祖先血統(tǒng)組成，直到K為8時才最終分化成兩個群體。二花臉和米豬擁有最為一致的進化路線，這與二花臉和米豬間遺傳距離最小的結(jié)果一致。此外，楓涇和嘉興黑間的祖先血統(tǒng)組成在K值為2～5時保持一致。在K值為8(最小CV-error值)時，這8個群體都可以區(qū)分成不同的群體。

注：EHL代表二花臉豬；MMS代表中型梅山豬；SMS代表小型梅山豬；FJ代表楓涇豬；HDL代表紅燈籠豬；JXB代表嘉興黑豬；MI代表米豬；SWT代表沙烏頭豬；每種顏色代表一個祖先群，群體間均以虛線分隔圖1 太湖流域地方豬8個群體的祖先血統(tǒng)組成

2.2 太湖流域地方豬受選擇SNP位點鑒定

2.2.1 梅山豬亞群間以及二花臉豬和米豬群體間共同分化SNP位點鑒定及基因注釋結(jié)果

對梅山豬亞群間、以及二花臉和米豬群體間進行兩組Fst分析，鑒定這兩組共同分化的SNP位點，并作為太湖流域地方豬受選擇的候選SNP位點。將閾值線以上的點作為群體間顯著分化的SNP位點(Z檢驗，P<0.01)，結(jié)果如圖2所示。一共發(fā)現(xiàn)24個SNP位點在這兩組Fst分析中都顯著分化，其中，有7個位于1號染色體，6個位于3號染色體，6個位于6號染色體，彼此間距離接近，其余分布在2、4、5和16號染色體。

對這24個候選SNP位點進行基因注釋，得到20個可以編碼蛋白的基因，其中有8個基因與體重體尺性狀相關(guān)，具體信息見表3。這些基因主要有如下功能：體重體尺(DENND1A、LHX2、NR6A1、FANCL、KCNK3、CDH11、CDH5和AGBL4)，繁殖性狀(STRBP、FANCL、MRGPRF和PSME4)，神經(jīng)發(fā)育(MVB12B、ARHGAP39、CNTN1、PLCG2和CTNND2)，抗病力(NEK6和SCAI)，嗅覺(NR2C1)，運動能力(VPS13D)。

表3 受選擇SNP位點基因注釋結(jié)果

2.2.2 受選擇SNP位點間連鎖不平衡分析

針對1、3和6號染色體中受選擇候選SNP位點，多數(shù)位置距離彼此接近，因此我們對這3條染色體上的位置距離彼此接近的候選SNP位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果見表4。上述3條染色體內(nèi)的候選SNP位點都存在較強的連鎖不平衡，r2值遠(yuǎn)大于0.3，其中1號染色體多個SNP位點達到完全連鎖，r2值為1。并且1號染色體彼此位置距離接近的7個SNP位點，分別在中型梅山豬和二花臉群體中形成了一種主要的單倍型“TCCGAAA”和“TCCGAAA”，同時在小型梅山豬和米豬群體內(nèi)變異較低；對于3號染色體彼此位置距離接近的5個SNP位點，分別在中型梅山豬，小型梅山豬，二花臉和米豬群體中形成了一種主要的單倍型“GGCAG”，“AATGA”，“GGCAG”和“AATGA”；對于6號染色體彼此位置距離接近的3個SNP位點，分別在中型梅山豬和米豬群體中形成了一種主要的單倍型“GTG”和“ACA”?？梢?、3和6號染色體在群體間經(jīng)歷了不同方向的選擇，導(dǎo)致群體間分化增大，并使得群體內(nèi)變異程度減少，逐漸形成單一的單倍型。

a.中型梅山和小型梅山群體間Fst分析；b.米豬和二花臉群體間Fst分析；x軸為18條染色體，y軸為每個位點Fst值；不同的染色體用不同顏色標(biāo)注，紅色實線為閾值線，閾值(Z檢驗，P<0.01)上的點代表受選擇位點，候選基因用紅色圓框標(biāo)注，與體重體尺相關(guān)的候選基因用紅色字體標(biāo)注圖2 梅山豬亞群間以及二花臉豬和米豬群體間共同分化SNP位點鑒定

表4 豬1號、3號和6號染色體受選擇SNP位點間的連鎖不平衡分析(r2)

2.2.3 受選擇SNP位點與豬體重體尺性狀相關(guān)QTLs注釋

對SNP位點所形成的選擇區(qū)域進行豬體重體尺等相關(guān)性狀QTLs注釋，結(jié)果見表5。1、3和6號染色體相應(yīng)區(qū)域注釋到大量的QTLs與豬的體重體尺性狀相關(guān)，其中主要包括豬日增重性狀，體重性狀，椎骨數(shù)性狀，料重比性狀和采食量性狀，表明這些區(qū)域很可能對于豬的體重體尺等表型的形成起到巨大作用。

表5 受選擇SNP位點所在區(qū)域QTLs注釋結(jié)果

3 討論

3.1 太湖流域地方豬種內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究

通過對太湖流域地方豬各品種，以及梅山豬品種內(nèi)兩個亞群進行多種群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，梅山豬亞群間遺傳距離接近，遺傳分化程度最低，進化路線相對一致，而二花臉與米豬間也有著最近的遺傳距離，較低的分化程度以及最一致的進化路線，這與他人的研究結(jié)果一致[6,24]。試驗發(fā)現(xiàn)，二花臉豬與米豬之間的遺傳距離小于梅山豬兩個亞群間的遺傳距離，并且擁有最為一致的祖先血統(tǒng)組成，表明二花臉豬與米豬之間的遺傳關(guān)系最為接近，其接近程度甚至超過了梅山豬的兩個亞群間的遺傳關(guān)系，該結(jié)果與Wang等[6]研究一致。此外還發(fā)現(xiàn)，所有太湖流域地方豬群體間的遺傳分化都超過0.25，達到高度分化水平[18-19]，并在ADMIXTURE分析中，K值為8時(最小的CV-error)，各自形成了不同的祖先血統(tǒng)組成情況，可見包括梅山豬兩個亞群在內(nèi)的8個群體彼此間都存在一定的分化，因此在保種時應(yīng)分開保種。

3.2 太湖流域地方豬種體重體尺性狀差異的候選SNP位點鑒定

對于梅山豬亞群、二花臉和米豬這兩個群體組合分別進行遺傳分化Fst的分析，并尋找在兩組分析中共同分化的SNP位點作為候選SNP位點。采用這種遺傳結(jié)構(gòu)十分接近、但體重體尺性狀差異顯著的群體進行比對分析，可以減少由于群體間其他性狀差異或者本身遺傳結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致SNP位點顯著分化的可能性。為了減少顯著分化SNP位點是假陽性的概率，通過取兩個分析結(jié)果交集的方法來進一步縮小差異SNP位點的范圍。本試驗共發(fā)現(xiàn)24個候選SNP位點，它們在這兩組分析中都顯著分化，這些候選SNP位點分布集中，主要分布在1、3、6號染色體區(qū)域內(nèi)，表明1、3、6號染色體在這4個群體中更可能受到強的選擇。

將受選擇SNP位點進行基因注釋，注釋到20個可以編碼蛋白的基因，8個基因被報道與體重體尺等性狀相關(guān)。DENND1A基因的rs10818854位點與人的肥胖顯著相關(guān)[25]；LHX2基因通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞中的RANKL信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)小鼠的骨重塑[26]；NR6A1基因作為豬肋骨數(shù)的主效基因，被運用于多個豬種的分子標(biāo)記輔助選育改良過程中[27-28]；FANCL基因可能是導(dǎo)致人肥胖的候選基因[29]；KCNK3基因可以調(diào)節(jié)脂肪生熱和肥胖[30]；CDH11基因是調(diào)節(jié)小鼠骨骼結(jié)構(gòu)和股骨形態(tài)的主要候選基因[31]；髖臼唇細(xì)胞中的CDH5可能參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制[32]；AGBL4基因被發(fā)現(xiàn)與牛的生長等數(shù)量性狀顯著相關(guān)[33]。

對上述3個染色體的候選SNP位點進行連鎖不平衡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每條染色體上候選SNP間的r2值都遠(yuǎn)大于0.3，達到強連鎖水平[12,22]，并且這些SNP在各個群體中都展現(xiàn)出較低多態(tài)性，形成了主要的單倍型。在人為或自然選擇的壓力下，優(yōu)勢等位基因型頻率會不斷上升，并且由于連鎖不平衡，使得優(yōu)勢基因型附近形成大片段的純合單倍型[19]，而1、3、6號染色體內(nèi)候選SNP位點間有很強的連鎖不平衡，并且候選SNP位點多態(tài)性降低，表明這些候選SNP位點所在的區(qū)域受到較強的選擇。

將受選擇SNP位點與豬QTLs數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果注釋到大量與體重體尺性狀相關(guān)的QTLs。Christine等[9]利用梅山豬和皮特蘭雜交產(chǎn)生的F2代群體鑒定到1號染色體226 764～265 324 kp處存在影響日增重的QTL；HUANG等[33]利用杜洛克和二花臉雜交產(chǎn)生的F2代群體鑒定到1號染色體266 307～287 364 kp處存在影響胸椎數(shù)的QTL；Guo等[34]利用大白豬和梅山豬雜交產(chǎn)生的F2代群體鑒定到3號染色體4 657～140 466 kp處存在一個大的QTL影響豬體重性狀；利用皮特蘭和梅山豬雜交產(chǎn)生的F2代群體鑒定到6號染色體24 513～24 582 kp處存在一個影響料重比的QTL[10]。這些結(jié)果都與本試驗發(fā)現(xiàn)的候選SNP所在區(qū)域重合。以上證據(jù)表明，在兩個Fst分析中共同受選擇，且基因注釋結(jié)果與體重和體尺性狀相關(guān)的區(qū)域，可能與太湖流域地方豬種群體間體重體尺性狀差異有關(guān)，這些區(qū)域?qū)⒆鳛楹蜻x區(qū)域進行進一步研究。

致謝：常州市焦溪二花臉豬專業(yè)合作社及其工作人員顧岳清、黃媛和李順等，常熟市牧工商有限公司、國家級二花臉豬保種中心及其工作人員陸志強等，蘇州蘇太企業(yè)有限公司及其工作人員黃雪根等，浙江青蓮食品股份有限公司及其工作人員趙善林等，江蘇省溧陽市乾豐養(yǎng)殖有限公司及其工作人員程躍強等，昆山市梅山豬保種有限公司及其工作人員沈永杰、時建新、周騰冰等，太倉市種豬場及其工作人員石曉峰、施擎天等，江蘇興旺農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司、國家級沙烏頭豬保種場及其工作人員唐慧娟等，常州市金壇米豬原種場及其工作人員田國興等，對于豬樣本采集工作予以支持和幫助，在此一并感謝。