陳艷榮 朱 娟 沈興家

(1黃山學(xué)院，生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山 245041； 2江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018； 3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

滯育作為昆蟲特殊的復(fù)雜生理狀態(tài)，昆蟲滯育時體內(nèi)各類物質(zhì)的代謝變化，本質(zhì)上是基因的表達(dá)與變化。家蠶(Bombyxmori)是典型的卵滯育昆蟲，其滯育性的研究己有近百年的歷史，家蠶二化性品種是研究昆蟲卵滯育控制機(jī)制的理想模式系統(tǒng)[1]。母體在特定發(fā)育階段接受了不同外界環(huán)境信號的刺激，通過體內(nèi)激素的變化，誘導(dǎo)一系列代謝途徑的發(fā)生，引起卵內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)組成(卵黃成分、卵黃量、激素、mRNA積累量及酶系統(tǒng)等)發(fā)生變化，母體生理代謝差異造成了子代滯育特性的差異，這種差異以卵母細(xì)胞“捆綁午餐(binding lunch)”的形式將環(huán)境信息傳遞給子代，決定后代滯育的發(fā)生[2]。實(shí)際上是昆蟲體內(nèi)基因表達(dá)水平的變化決定了這些生理學(xué)的變化[3]。

滯育關(guān)聯(lián)基因主要包括滯育各階段相關(guān)的差異表達(dá)基因或滯育相關(guān)蛋白編碼基因，特別是滯育過程中能量、激素、呼吸等相關(guān)代謝通路中的特異表達(dá)基因[4-6]。滯育關(guān)聯(lián)基因涉及范圍較廣，有些基因即使沒有直接參與滯育進(jìn)程，也可能間接參與滯育發(fā)育調(diào)控，基因間相互作用極其復(fù)雜[7]；目前被證明參與了家蠶滯育的基因仍然較少。本文對家蠶滯育關(guān)聯(lián)基因的功能研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為家蠶滯育機(jī)制研究提供思路和參考。

1 家蠶滯育關(guān)聯(lián)基因的種類

按照基因功能可將家蠶滯育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的關(guān)聯(lián)基因分為三大類：生物鐘相關(guān)基因、內(nèi)分泌相關(guān)基因和滯育相關(guān)基因，三者間有復(fù)雜的交叉關(guān)系，可能涉及到多個基因的重疊。

1.1 生物鐘相關(guān)基因

生物鐘相關(guān)基因可分為核心鐘基因、鐘控基因和鐘相關(guān)基因[8]。黑腹果蠅是研究晝夜生物鐘的重要模式生物。目前己確認(rèn)的主要生物鐘基因有period(per)、timeless(tim)、clock(clk)及cycle(cyc)、cryptochrome(cry)和環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白編碼基因(cAMP response element binding protein，creb)等。

1.1.1per生物鐘相關(guān)基因中第1個被鑒定和克隆出的是per，長13 000 bp，CDS編碼1 218個氨基酸，有pers、per01和perL1等3個復(fù)等位基因。晝夜節(jié)律和超日節(jié)律都被per的表達(dá)所影響，翻譯產(chǎn)物為PER蛋白，它與另一種生物鐘蛋白TIM結(jié)合形成異源二聚體，作為負(fù)調(diào)節(jié)因子參與生物鐘的反饋環(huán)路[9]。徐麗等[10]認(rèn)為家蠶per表達(dá)水平與溫度和光照對滯育的誘導(dǎo)作用一致，該結(jié)果暗示在一個完整世代中，家蠶per的表達(dá)水平與誘導(dǎo)后代滯育變化的溫度及光照直接相關(guān)。

1.1.2tim第2個被確證的生物鐘相關(guān)基因是果蠅tim。per被發(fā)現(xiàn)10年之后，tim的第1個突變體tim0被鑒定，它使果蠅蛹期羽化和活動節(jié)律發(fā)生異常。BENNA在果蠅中發(fā)現(xiàn)2種類型的tim基因，彼此的序列保守性很低，相應(yīng)的編碼蛋白也高度可變[11]。PER蛋白與TIM蛋白結(jié)合生成異源二聚體，在生物鐘負(fù)反饋回路中起重要作用。宋艷[12]認(rèn)為家蠶誘導(dǎo)滯育的溫度和光照的變化，能夠直接影響per和tim的表達(dá)，她推測per和tim在家蠶滯育誘導(dǎo)影響的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有重要作用。

1.1.3clk與cycCLK最初是從小鼠中分離出來的生物鐘轉(zhuǎn)錄因子，由clk編碼。蛋白結(jié)構(gòu)含有PAS-bhlh(basic helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域，C-末端富含谷氨酰胺Q，該結(jié)構(gòu)域起轉(zhuǎn)錄激活作用[13]。果蠅的CLK與CYC通常結(jié)合生成異源二聚體，并與per和tim啟動子的E-box結(jié)合，這種結(jié)合能夠激活它們的表達(dá)，PER和TIM與隱色素(CRY)相互作用，引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[8]。

1.1.4cryCRY是一種黃素光感受體，對藍(lán)光高度敏感，由cry編碼，首先在擬南芥中分離鑒定。作為生物鐘的一部分，CRY參與調(diào)節(jié)動物的日常生理和行為節(jié)律，并作為光感受器調(diào)節(jié)生物鐘的指導(dǎo)過程[14]。研究表明，CRY受到光信號刺激后，發(fā)生光化學(xué)變化，直接與TIM在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中發(fā)生光依賴性結(jié)合，導(dǎo)致PER/TIM復(fù)合物失活，終止其在反饋環(huán)中的作用[15]；朱曉蘇等[16]克隆了家蠶2個同源基因Bm-cry1和Bm-cry2的完整開放閱讀框，對其蛋白質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和分子進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)Bm-cry1在不同物種中的保守區(qū)幾乎覆蓋了整個蛋白序列，Bm-cry2的N端保守性較高，C端保守性較低，具有DNA光解酶結(jié)合區(qū)2個保守的結(jié)構(gòu)域。

1.1.5creb家蠶creb包括至少11個外顯子，基因全長約為40 kb，編碼的CREB蛋白分子量大約為43 kD，是真核細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈家族中的一員，其分子結(jié)構(gòu)分2個區(qū)域，C端區(qū)為天冬氨酸，是與啟動子結(jié)合的部位；N端區(qū)為蛋氨酸，與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄有關(guān)，包含堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈模體，合稱為bZIP結(jié)構(gòu)[17]。不同細(xì)胞中胞外信號能通過多條信號通路，將信號傳遞給CREB蛋白，并通過蛋白激酶使CREB蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)[18]。

環(huán)境誘導(dǎo)家蠶滯育受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，關(guān)鍵期是家蠶胚胎發(fā)育的中后期，這些環(huán)境信號通過腦接收并記憶保持。有研究表明，家蠶creb在胚胎和蛹腦中的表達(dá)量環(huán)境誘導(dǎo)滯育性高于非滯育性[19]。張玉等[20]以二化性家蠶為研究對象，對家蠶CREB的表達(dá)與環(huán)境誘導(dǎo)滯育的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明家蠶胚胎發(fā)育的反轉(zhuǎn)期到催青期表達(dá)量逐漸增加，而高溫/光照比低溫/黑暗環(huán)境下表達(dá)量高，該結(jié)果暗示CREB可能參與環(huán)境信號的接收與記憶的調(diào)控。

1.2 內(nèi)分泌相關(guān)基因

1.2.1 促前胸腺激素基因(Prothoracicotropic hormone，ptth) PTTH是在家蠶腦外側(cè)神經(jīng)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的，經(jīng)腦—心側(cè)體—咽側(cè)體神經(jīng)軸索貯存在咽側(cè)體內(nèi)，然后釋放到血淋巴。血淋巴中的促前胸腺激素作用于前胸腺細(xì)胞，刺激蛻皮激素(molting hormone，MH)的分泌，調(diào)節(jié)昆蟲的發(fā)育。PTTH的釋放發(fā)生在特定時期，如4齡期最后一次蛻皮，一批調(diào)節(jié)因子被調(diào)動，化學(xué)信息被傳到腦部神經(jīng)細(xì)胞，激活PTTH的合成并釋放到咽側(cè)體[21]。1990年KAWAKAMI等[22]首次克隆到家蠶ptth的全長基因序列，其cDNA編碼的蛋白前體包括信號肽、中間肽和PTTH分子，通過切割蛋白水解位點(diǎn)，釋放出成熟的PTTH分子；家蠶ptth包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，其成熟肽由第3、4、5外顯子及第2外顯子的一部分組成。

1.2.2 羽化激素基因(Eclosion homone，eh) EH是一種神經(jīng)肽，包括62個氨基酸，最早從家蠶和煙草天蛾的頭部分離而來。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它可以觸發(fā)昆蟲成蟲蛻皮，所以稱為羽化激素[23]。家蠶eh在蛹腦中的二對腹中央v型神經(jīng)分泌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，為單拷貝編碼mRNA。家蠶的EH蛋白和煙草天蛾的EH蛋白有29%的異源性，每條肽鏈在其保守位點(diǎn)都含有6個半胱氨酸，并在分子中形成3個二硫鍵，二硫鍵對于維持EH蛋白的高級結(jié)構(gòu)和生物活性至關(guān)重要，如果它被打斷可能使EH完全失活。家蠶和煙草天蛾的EH已確定了這3個二硫鍵的位點(diǎn)；在肽鏈N端有1個疏水性的信號肽，用于將EH引導(dǎo)至分泌途徑[24]。

1.2.3 滯育激素-性信息素合成激活肽基因(Diapause hormone-pheromone biosynthesis activating neuropeptide，dh-pban) 鱗翅目昆蟲dh-pban編碼5個神經(jīng)肽，分別是滯育激素(DH)、性信息素合成激活肽(PBAN)、α-咽下神經(jīng)節(jié)肽(α-SGNP)、β-咽下神經(jīng)節(jié)肽(β-SGNP)、γ-咽下神經(jīng)節(jié)肽(γ-SGNP)；這5個神經(jīng)肽都有共同的苯丙氨酸-X-脯氨酸-精氨酸/賴氨酸-亮氨酸(X為甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸)[FXPR/KL(X=G，T，S)]酰胺化的C末端。dh-pban基因主要在咽下神經(jīng)節(jié)中表達(dá)，PBAN在鱗翅目昆蟲中起到促進(jìn)性信息素合成的作用[25]。昆蟲的大多數(shù)激素一個前體會產(chǎn)生一個終產(chǎn)物，而像家蠶dh-pban同時編碼并產(chǎn)生DH、PBAN和SGNP等5個產(chǎn)物的現(xiàn)象不多見。

1.2.4 垂體同源框激素基因(Pituitary homeobox，pitx) PITX屬于Bicoid家族的轉(zhuǎn)錄因子，包含同型盒結(jié)構(gòu)域和OAR (otpa ristaless and rax)結(jié)構(gòu)域，在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。家蠶各種組織中都有pitx的表達(dá)，比如咽下神經(jīng)節(jié)和滯育激素神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。一般作為同源異型轉(zhuǎn)錄因子，與相應(yīng)的調(diào)控元件結(jié)合并激活dh-pban的表達(dá)[26]。

1.3 滯育相關(guān)基因

滯育誘導(dǎo)后導(dǎo)致一些特異性基因在滯育準(zhǔn)備期表達(dá)，神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝過程出現(xiàn)變化，例如大量合成海藻糖、山梨醇在體液內(nèi)積累，這些物質(zhì)既是能源物質(zhì)，又是很好的抗凍劑，能降低過冷卻點(diǎn)，為啟動滯育做準(zhǔn)備。

1.3.1 滯育激素基因((Diapause hormone，dh) 家蠶DH是由dh-pban編碼，它同時還編碼PBAN和3個食道下神經(jīng)肽,這是在家蠶中首次發(fā)現(xiàn)1個基因可以編碼多個功能蛋白。SATO等[27]克隆了該編碼基因，全長6 kb，包含5個內(nèi)含子和6個外顯子；表達(dá)調(diào)控時，先轉(zhuǎn)錄形成1個0.8 kb的前體mRNA，再翻譯形成1個C末端包含F(xiàn)XPR/KL結(jié)構(gòu)的酰胺神經(jīng)多肽前體，經(jīng)蛋白水解酶作用釋放出DH及其它神經(jīng)肽；dh表達(dá)有溫度控制和發(fā)育時期依賴2種類型，家蠶dh的表達(dá)依賴于催青溫度的誘導(dǎo)，最終影響家蠶子代滯育性。

家蠶DH最特殊的功能就是調(diào)節(jié)卵是否滯育。DH能增強(qiáng)卵巢膜的通透性，促進(jìn)羥基犬尿氨酸從血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢中，導(dǎo)致卵巢內(nèi)積累大量的羥基犬尿氨酸，被轉(zhuǎn)運(yùn)至滯育卵內(nèi)在漿膜上形成眼色素，使卵色加深。家蠶DH還能增強(qiáng)體內(nèi)海藻糖酶的活性，促使卵巢中糖原的積累而消耗脂肪體中的糖原儲備[28]。家蠶中酯酶促進(jìn)卵黃細(xì)胞發(fā)生溶胞，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，而DH能夠抑制酯酶活性，進(jìn)而阻斷胚胎發(fā)育。另外，DH能夠?qū)е录倚Q卵巢中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)增加和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)減少[29]。

1.3.2 滯育激素受體基因(Diapause hormone receptor，dhr) 家蠶dhr編碼436個氨基酸，屬于一種G蛋白偶聯(lián)受體，含7個跨膜結(jié)構(gòu)域。低溫催青的二化性家蠶的dhr在蛹期大量表達(dá)。它特異性識別DH，能識別胞外的化學(xué)信號并通過與其偶聯(lián)的G蛋白將信號在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行傳遞，通過鈣離子和蛋白激酶C參與激活下游滯育信號[30-31]。王力剛[32]克隆了家蠶dhr的5種cDNA，證明它們由相同的mRNA轉(zhuǎn)錄本通過不同的剪接方式而來，該基因主要在卵巢和血液中表達(dá)。

1.3.3 海藻糖酶基因(Trehalase， treh)treh有treh1、treh2等2類，前者表達(dá)可溶性海藻糖酶，后者表達(dá)膜結(jié)合型海藻糖酶(有跨膜結(jié)構(gòu))；TREH1相對分子量為66.6 kD， TREH2為73.5 kD。2種蛋白都具有PGGRFREFYYWDSY和QWDYPNAWPP等2個“標(biāo)簽結(jié)構(gòu)”?？扇苄院Ｔ逄敲钢饕怯脕矸纸饧?xì)胞內(nèi)的海藻糖[33]；膜結(jié)合型海藻糖酶主要是水解食物中的海藻糖，為肌肉運(yùn)動和取食時的中腸運(yùn)動供給能量。TREH2的活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)滯育激素誘導(dǎo)卵巢產(chǎn)生滯育卵[34]。

二化性家蠶在滯育誘導(dǎo)階段將感受的環(huán)境信號轉(zhuǎn)換為體內(nèi)相應(yīng)信號，體內(nèi)信號再通過整個幼蟲期傳遞到蛹期，在蛹期此信號作用于咽下神經(jīng)節(jié)(SG)，促使其大量分泌DH。在滯育決定階段，通過血液將DH運(yùn)送到卵巢，與卵母細(xì)胞膜上的DHR結(jié)合，啟動一系列基因的表達(dá)，通過鳥苷酸環(huán)化酶使cGMP合成受阻，激活海藻糖酶基因表達(dá)，合成大量海藻糖酶，增強(qiáng)血液海藻糖的分解反應(yīng)，生成的大量葡萄糖穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞中合成糖原，導(dǎo)致滯育卵中糖原的大量積累[35]。

1.3.4 糖原磷酸化酶基因(Glycogen phosphorylase，gpase) GPASE是糖原降解中的關(guān)鍵酶，它的主要功能是催化糖原降解為葡萄糖-1-磷酸，繼而轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸，參與其他大分子的合成。gpase有3種，分別編碼M型、L型和B型3種不同的GPASE，彼此互為異構(gòu)體，可以形成異源二聚體，成熟的GPASE是由2個相同亞基組成的二聚體[36]；GPASE的每條多肽鏈都存在1個氨基末端結(jié)構(gòu)域和1個羧基末端結(jié)構(gòu)域，2個結(jié)構(gòu)域之間形成一條較深的裂縫，裂縫中具有GPASE的作用位點(diǎn)[37]。1938年Gerty發(fā)現(xiàn)GPASE有A型和B型2種類型，B型幾乎沒有催化活性，A型的Ser14被磷酸化而具有活性，脫磷酸化后成為B型(無活性)[38]。

滯育早期卵內(nèi)的糖原在GPASE的催化下分解，并逐步轉(zhuǎn)化成山梨醇、甘油等物質(zhì)。滯育啟動、維持和結(jié)束與糖原山梨醇間的相互轉(zhuǎn)化有著密切的關(guān)系，而糖原轉(zhuǎn)化為山梨醇的關(guān)鍵酶是GPASE；在滯育卵中，前3 d GPASE的表達(dá)很明顯。滯育卵和非滯育卵的糖原變化水平存在著明顯差異，GPASE的活性與糖原水平相關(guān)[39-40]。

1.3.5 谷氨酰半胱氨酸連接酶基因(Glutamate cysteine ligase，gcl)、谷胱甘肽合成酶基因(Glutathione synthetase，gs) 谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)重要的小分子抗氧化物質(zhì)，還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)與氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized，GSSG)的比值反映了細(xì)胞的氧化脅迫狀況。高GSH/GSSG說明細(xì)胞處于還原狀態(tài)，低GSH/GSSG說明細(xì)胞為過氧化狀態(tài)[41]。GSH是通過2個依賴ATP提供能量的反應(yīng)，由GCL和GS分2步依次催化合成；GCL是合成第一步酶促反應(yīng)的催化酶和限速酶，催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，GS則負(fù)責(zé)第二步在谷氨酰半胱氨酸端的羧基與甘氨酸的氨基之間形成肽鍵，最終得到谷胱甘肽；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可以催化GSH與親核物質(zhì)結(jié)合[42]。此外，硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin peroxidase，TPX)負(fù)責(zé)催化GSH被H2O2氧化為GSSG。滯育發(fā)動后，卵耗氧率急劇升高，同時大量糖原轉(zhuǎn)化為山梨醇并在卵內(nèi)積累，卵內(nèi)為還原性的環(huán)境，存在低水平的總谷胱甘肽含量和GSSG及高水平的GSH/GSSG比值，暗示gcl和gs在滯育發(fā)動期間的活性增強(qiáng)而gst和tpx則表達(dá)抑制[43]。

1.3.6 過氧化氫酶基因(Catalase，cat) 滯育發(fā)動期間H2O2的水平依賴于2個方面，一是滯育性蠶卵的呼吸作用，二是CAT對H2O2的清除情況。CAT活性在滯育發(fā)動期間迅速升高，有利于清除胚胎內(nèi)的H2O2，維持H2O2低水平[44]。韓武梅[45]研究了滯育起始時期的cat表達(dá)水平，結(jié)果表明，高溫明催青蠶卵中的catmRNA水平顯著高于低溫暗催青的catmRNA水平，且在胚胎發(fā)育的第21階段出現(xiàn)峰值，表明高溫明催青促進(jìn)了catmRNA的表達(dá)。

1.3.7 山梨醇脫氫酶基因(Sorbitol dehydrogenase，sdh) 在滯育維持期間，家蠶的呼吸量會顯著下降，每克卵每小時的耗氧量約10 μL，這是一種“假死”狀態(tài)。家蠶卵中大量積累的糖原幾乎都轉(zhuǎn)換為山梨醇并高濃度地積累。由于山梨醇具有良好的水溶性，因此胚胎細(xì)胞和卵黃細(xì)胞中的水與游離水結(jié)合，致使游離水缺乏，最終導(dǎo)致家蠶所有的活性功能停滯[46]。

SDH是調(diào)節(jié)山梨醇代謝的關(guān)鍵酶，催化山梨醇脫氫轉(zhuǎn)化為糖原。研究顯示，家蠶在滯育過程中sdh基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，糖原大量轉(zhuǎn)化為山梨醇，并在滯育卵中積累起來。此過程也與滯育卵中糖原磷酸化a酶活性迅速增加及糖原合酶激酶3β磷酸化水平急劇下降和甘油激酶基因不表達(dá)密切相關(guān)[47-48]。5 ℃低溫冷藏滯育卵(60 d以上)或者短期冷藏后浸酸，能夠打破這種抑制，使sdh基因表達(dá)，催化山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖，解除滯育維持[49]。

1.3.8 脂酶4基因(Esterase，ea4) 家蠶滯育生物鐘是一種倒計(jì)時型生物鐘，EA4是生物鐘蛋白質(zhì)，一種時間間隔測定酶(TIME-EA4)。ea4 cDNA全長605 bp，開放閱讀框(ORF)長519 bp，其中第1～48個堿基編碼信號肽，至少有4個外顯子和3個內(nèi)含子；促使蠶卵活化所需要的低溫時間或鹽酸刺激量是家蠶滯育生物鐘的計(jì)時內(nèi)容[50-51]。EA4是具有測定5 ℃低溫經(jīng)過時間，即具有測定蠶卵活化所需低溫時間(滯育發(fā)育時間)功能的酶蛋白，其酶活性峰的出現(xiàn)是依靠EA4蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)的改變感受低溫時間變化，出現(xiàn)瞬時ATPase活性，啟動家蠶滯育卵活化進(jìn)程。小分子多肽PIN是EA4活性的抑制物質(zhì)。PIN與EA4結(jié)合，EA4的生物計(jì)時作用停止，維持滯育；PIN從EA4脫落，TIME-EA4的生物測時作用啟動，進(jìn)行零點(diǎn)設(shè)定，滯育卵開始活化[52]。

家蠶滯育的發(fā)生，是生物鐘相關(guān)基因、內(nèi)分泌相關(guān)基因及滯育相關(guān)基因之間的復(fù)雜作用的結(jié)果(圖1)。研究滯育蠶卵活化環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和sod、cat、sdh等滯育基因的互作關(guān)系可能是闡明家蠶滯育分子機(jī)制、構(gòu)建家蠶滯育基因網(wǎng)絡(luò)骨架的一個有效切入點(diǎn)[53]。滯育相關(guān)基因往往和內(nèi)分泌、代謝相關(guān)基因交叉調(diào)控，比如外界環(huán)境信號化為化學(xué)信號保留至蛹期，再調(diào)控滯育相關(guān)基因表達(dá)，基因互作網(wǎng)絡(luò)成員眾多，關(guān)系復(fù)雜，涉及信號通路范圍較廣，研究困難。隨著高通量測序技術(shù)和組學(xué)的發(fā)展，一次性獲得大量的序列信息成為可能，為研究該時期基因關(guān)系提供了技術(shù)支持。

圖1 家蠶滯育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2 滯育關(guān)聯(lián)基因涉及的信號通路

2.1 G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-coupled receptors，GPCRs)

G蛋白具有GTP酶的特性，G蛋白偶聯(lián)型受體與G蛋白偶聯(lián)后產(chǎn)生胞內(nèi)信使如cAMP、cGMP等，將信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)。GPCRs可感知化學(xué)信息，是外界環(huán)境與神經(jīng)系統(tǒng)的第一接口[54]。滯育也是通過GPCRs起始的，1 000個以上GPCRs同時受到滯育信息素刺激，相互聚集活化，產(chǎn)生活性因子，繼而產(chǎn)生一系列的級聯(lián)式反應(yīng)誘導(dǎo)滯育的產(chǎn)生。其下游的偶聯(lián)反應(yīng)包括cGMP信號通路、TGF-β(transforming growth factor-β)信號通路和胰島素/胰島素樣生長因子1(insulin/ insulin-like growth factor-1，IIS)信號通路[55]。家蠶卵巢中克隆出家蠶滯育激素受體基因dhr， ORF長1 311 bp，編碼436個氨基酸，就屬于一種GPCR，家蠶血淋巴中的DH首先需與家蠶卵巢膜上的DHR結(jié)合，才能進(jìn)入家蠶卵巢內(nèi)[56]。

2.2 cGMP信號通路

cGMP是GPCRs活化信號的下游直接接受者，對感覺神經(jīng)傳導(dǎo)非常關(guān)鍵。其主要成員包括跨膜蛋白鳥苷酸環(huán)化酶DAF-11，cGMP門控離子通道蛋白TAX-2和TAX-4。cGMP途徑位于類胰島素信號途徑和TGF-β信號途徑的上游(圖2)。研充表明，DAF-11特異性地在化感器ASI、ASJ和ASK上表達(dá)，cGMP濃度與滯育呈正相關(guān)，即cGMP低濃度時蟲體進(jìn)行正常的生長發(fā)育，高濃度時蟲體進(jìn)入滯育狀態(tài)[57-58]。家蠶中DH與卵母細(xì)胞上的特異受體結(jié)合，使鳥苷酸環(huán)化酶活性下降，進(jìn)而使cGMP的合成受到抑制，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)cGMP的濃度下降導(dǎo)致膜上海藻糖酶的活性提高，酶分解血液海藻糖成葡萄糖的反應(yīng)加快，更多的葡萄糖通過膜進(jìn)入卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞中合成糖原[59]。

圖2 GPCR與cGMP信號通路[56]

2.3 TGF-β信號通路

TGF-β通路中的主要成員包括DAF-7、TGF-β受體(I型和II型)、核受體DAF-3、DAF-8和DAF-14及轉(zhuǎn)錄因子DAF-5[60]。作用機(jī)理大致如下：在適當(dāng)?shù)臈l件下，DAF-7/TGF-β濃度升高，與活化的DAF-1和DAF-4受體結(jié)合，DAF-8、DAF-14被受體復(fù)合物磷酸化，導(dǎo)致核激活，抵抗復(fù)合物DAF-3/SMAD、DAF-5/SNOSKI的作用，抑制DAF-5的功能，導(dǎo)致初始下游基因的轉(zhuǎn)錄翻譯被阻止，促進(jìn)能量利用、蟲體正常代謝及生長發(fā)育。當(dāng)DAF-7濃度降低或缺乏時，DAF-3/DAF-5啟動下游基因的表達(dá)，蟲體儲存能量，減少食物攝取，進(jìn)入滯育狀態(tài)(圖3)[55，61]。TGF-β信號通路通過控制細(xì)胞的大小和細(xì)胞的數(shù)目來調(diào)節(jié)家蠶的組織器官形成和早期胚胎發(fā)育。家蠶在卵滯育誘導(dǎo)階段，相關(guān)因子會大量表達(dá)抑制TGF-β信號通路成員的基因轉(zhuǎn)錄，從而阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，協(xié)助滯育卵逐漸停止發(fā)育，誘導(dǎo)滯育啟動[62]。

圖3 TGF-β信號通路[55]

2.4 IIS信號通路

IIS信號通路參與滯育形成。在線蟲中，胰島素受體同系物DAF-2、PI3-激酶/AGE-1的減少都可導(dǎo)致蟲體壽命延長1～2倍[63]。其簡單的作用模型如下：在適宜的條件下，分泌的IIS與相應(yīng)的受體DAF-2結(jié)合，以此激活A(yù)GE-1/PI3K激酶，PIP2在活化的AGE-1作用下產(chǎn)生PIP3；PIP3激活激酶PDK、AKT1和AKT2，活化的激酶促使DAF-16/FOXO被SGK磷酸化，進(jìn)而使得DAF-16/FOXO被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，與FTT-2/14-3-3蛋白結(jié)合保留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，最終激活下游眾多基因的轉(zhuǎn)錄，蟲體正常發(fā)育；環(huán)境不利時，IIS不被激活，DAF-16/FOXO保留在細(xì)胞核內(nèi)，啟動抵抗應(yīng)激及滯育形成相關(guān)基因，蟲體進(jìn)入滯育狀態(tài)(圖4)[55，64]。IIS信號通路對昆蟲的能量代謝，特別是糖類代謝至關(guān)重要。家蠶滯育卵在啟動滯育后，卵內(nèi)胰島素、類胰島素因子及中間調(diào)節(jié)因子PIP3的基因轉(zhuǎn)錄都被下調(diào)，IIS信號通路被抑制，能量代謝被降低；下游因子FOXO則表達(dá)上調(diào)，啟動一系列細(xì)胞和生理過程維持滯育[65]。

圖4 IIS信號通路[55]

3 滯育關(guān)聯(lián)基因的研究熱點(diǎn)

3.1 利用組學(xué)技術(shù)挖掘滯育關(guān)聯(lián)基因

滯育過程具有復(fù)雜性和整體性，單一針對某些基因的研究難以系統(tǒng)全面地解析昆蟲滯育發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機(jī)制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以昆蟲整個基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白組為研究對象，同時實(shí)現(xiàn)從“因”和“果”2個方向來探究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，相互間進(jìn)行驗(yàn)證，從海量的數(shù)據(jù)中篩選出關(guān)鍵基因的組學(xué)被用來挖掘關(guān)鍵的滯育關(guān)聯(lián)基因、構(gòu)建其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的范蘭芬等[66]測定了家蠶的滯育卵及非滯育卵的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，初步篩選出3個主存儲蛋白、9個熱激蛋白、37個新陳代謝酶、22個核糖體蛋白，并測定了這些蛋白的編碼基因表達(dá)水平，驗(yàn)證了部分基因功能；張峰賓等[67]為了研究親代胚胎是如何接受外界環(huán)境刺激，并最終影響子代滯育這一問題，對注定產(chǎn)滯育卵孵育胚胎和注定產(chǎn)非滯育卵孵育胚胎的反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定到7個滯育候選基因，包括3個熱激蛋白基因，2個節(jié)律基因及2個TRP家族基因，并利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，在個體水平上驗(yàn)證這些基因的功能與滯育有關(guān)；陳艷榮等[68]2019年分別對注定產(chǎn)滯育卵和注定產(chǎn)非滯育卵的雌蛹進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出1個關(guān)健的滯育準(zhǔn)備期關(guān)聯(lián)基因——akr2e-like，利用Crisp/cas9技術(shù)敲除該基因后，使25 ℃孵化的雌蠶產(chǎn)下部分非滯育卵，證明該基因參與滯育調(diào)控。

3.2 從表觀遺傳學(xué)的角度研究滯育關(guān)聯(lián)基因

表觀遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變的基因或者蛋白表達(dá)的變化，這種改變可以作為遺傳信息傳給下一代(跨代遺傳)，最終在后代中表現(xiàn)出來；主要包括DNA甲基化，組蛋白共價修飾，染色質(zhì)重塑，基因沉默和RNA編輯等調(diào)控機(jī)制。最近的研究表明，表觀遺傳機(jī)制在家蠶滯育基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，目前相關(guān)研究主要集中在各類甲基化酶的表達(dá)及滯育關(guān)聯(lián)基因的DNA甲基化修飾2個方向[69-72]。李冰等[69]測定了家蠶的甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(Bmdnmt1和Bmdnmt2)在不同組織、不同胚胎發(fā)育階段和不同品系中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：2種甲基轉(zhuǎn)移酶基因在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)最高，尤其是在胚胎早期；特別是通過HCl處理，在滯育終止卵中表達(dá)顯著上調(diào)。蔣濤等[71]檢測了4種不同化性的家蠶品種中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物相關(guān)基因在不同階段的表達(dá)水平，并測定了不同濃度的滯育激素或鹽酸處理蠶卵中總m6A含量，結(jié)果表明，滯育命運(yùn)組m6A修飾復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)高于非滯育命運(yùn)組。2020年李冰等[72]又比較分析了家蠶滯育卵與滯育終止卵的DNA甲基化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出364個與甲基化相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)滯育命運(yùn)卵HCl處理后甲基化水平比非滯育卵高0.05%，主要是由于CG甲基化位點(diǎn)較多；通過分析G2/M期特異性E3泛素蛋白連接酶(G2E3)，推測甲基化可能通過調(diào)節(jié)家蠶中的細(xì)胞周期而影響胚胎滯育。

4 小結(jié)

滯育是受基因控制與外界環(huán)境多種因素影響的生物學(xué)過程，是昆蟲的一種特殊發(fā)育階段。滯育昆蟲特殊的復(fù)雜生理狀態(tài)變化、體內(nèi)各類物質(zhì)的代謝變化，本質(zhì)上是基因的表達(dá)與變化。研究滯育關(guān)聯(lián)基因有助于了解昆蟲的生物學(xué)特性，窺探昆蟲對環(huán)境適應(yīng)和進(jìn)化的途徑，提高害蟲防治效率和昆蟲資源利用效率；目前大量研究篩選出一批新的滯育關(guān)聯(lián)基因，將進(jìn)一步完善家蠶滯育調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，有助于闡明家蠶滯育的分子機(jī)制，為家蠶育種提供理論依據(jù)，更好地開發(fā)利用家蠶等經(jīng)濟(jì)昆蟲，并可為農(nóng)林害蟲的防治新途徑研究提供借鑒。