李倩倩 邵菁,3 吳大強(qiáng),3 汪天明,3 汪長中,3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，合肥 230012； 2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230012； 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012)

念珠菌屬(Candidaspp.)是條件致病性真菌，主要存在于皮膚、口腔、胃腸黏膜等部位[1]。常見念珠菌屬包括白念珠菌(Candidaalbicans)和非白念株菌(non-albicansCandidaspecies)，后者主要包括光滑念珠菌(Candidaglabrata)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)等[2]。隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的使用，很多念珠菌屬臨床分離株具有較強(qiáng)的耐藥性，往往造成較高的臨床致病率和致死率(30%～40%)[3]。生物膜(biofilm)的形成是念珠菌屬耐藥性的重要原因之一，目前大部分常見念珠菌屬都能形成生物膜[4]，而念珠菌感染往往與兩種或兩種以上念珠菌形成的混合生物膜(mixed biofilm)有關(guān)。比如在嚴(yán)重口腔念珠菌病患者和外陰念珠菌病患者的感染部位能夠分離出白念珠菌和光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌等非白念株菌[5-6]，42%的HIV陽性患者口腔常出現(xiàn)兩種以上念珠菌感染[7]，這可能與念珠菌混合生物膜往往比單一生物膜(single biofilm)具有更強(qiáng)致病力有關(guān)[8-9]。本文就影響念珠菌屬混合生物膜的形成因素進(jìn)行綜述。

1 種 屬

白念珠菌與非白念珠菌以及非白念珠菌之間形成混合生物膜的能力是不同的。Rossoni等研究表明克柔念珠菌和光滑念珠菌能夠在體內(nèi)外形成混合生物膜。在體外培養(yǎng)時(shí)，光滑念珠菌在單一生物膜中比其在混合生物膜中具有更高的菌落形成單位(colony formation unite)，而克柔念珠菌則剛好相反；光滑念珠菌單一生物膜的代謝活性顯著高于混合生物膜，克柔念珠菌的代謝活力則在單一生物膜和混合生物膜中無差異；感染小鼠口腔后發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌單一生物膜的菌落形成單位也明顯高于混合生物膜中的光滑念珠菌，說明克柔念珠菌在混合生物膜中抑制了光滑念珠菌的生長，這有利于兩者的口腔定植和生物膜形成[10]。Rossoin等[11]還研究了白念珠菌分別與光滑念珠菌和克柔念珠菌之間的相互作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，混合生物膜中白念珠菌菌落形成單位顯著低于單一生物膜(白念珠菌與光滑念珠菌混合時(shí)減少了77%，與克柔念珠菌混合時(shí)減少了89%)；將單菌和混合菌分別感染幼蟲后發(fā)現(xiàn)，單菌感染組在18 h內(nèi)全部死亡，而混合感染組分別在72 h(白念珠菌和光滑念珠菌)和96 h(白念珠菌和克柔念珠菌混合)全部死亡，說明白念珠菌與光滑念珠菌、克柔念珠菌都能形成混合生物膜，且相互之間均為競爭關(guān)系；同時(shí)白念珠菌單一生物膜比白念珠菌-光滑念珠菌、白念珠菌-克柔念珠菌混合生物膜的毒力更強(qiáng)。白念珠菌也可以與都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)形成混合生物膜，并且在混合生物膜中白念珠菌的生長比都柏林念珠菌更具有優(yōu)勢[12]。

2 基 因

在念珠菌屬混合生物膜的形成過程中，念珠菌之間相關(guān)基因表達(dá)的變化對混合生物膜的形成可造成影響。

2.1 細(xì)胞壁蛋白相關(guān)基因

Cabral等[13]研究表明PGA基因可不同程度地促進(jìn)白念珠菌PGA過表達(dá)株和正常株單一生物膜和混合生物膜的形成，PGA59和PGA22基因的過表達(dá)均可增強(qiáng)白念珠菌黏附非生物底物的能力，PGA22通過改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和/或功能影響細(xì)胞黏附。

2.2 菌絲相關(guān)基因

Richard[14]等通過白念珠菌缺陷株的篩選，發(fā)現(xiàn)nup85、suv3和mds3突變株不能形成菌絲；當(dāng)突變株和正常株按照1∶1的接種量混合培養(yǎng)時(shí)，這些突變株的菌體細(xì)胞可以進(jìn)入正常株的生物膜中形成混合生物膜，從而彌補(bǔ)它們的黏附缺陷。將光滑念珠菌細(xì)胞壁蛋白EPA1和EPA6基因表達(dá)作為對照組，當(dāng)光滑念珠菌和白念珠菌混合培養(yǎng)時(shí)，白念珠菌上調(diào)了5個(gè)編碼光滑念珠菌細(xì)胞壁蛋白基因的表達(dá)(EPA8、EPA19、AWP2、AWP7和CAGL0F00181)，這有利于光滑念珠菌的定植，加大了口腔混合感染的風(fēng)險(xiǎn)[15]。Barros等[16]將白念珠菌分別與光滑念珠菌和克柔念珠菌混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)的白念珠菌相比，混合培養(yǎng)時(shí)光滑念珠菌(P=0.0025)和克柔念珠菌(P=0.0005)能顯著抑制白念珠菌絲狀化，而且白念珠菌的HWP1基因表達(dá)也明顯減少。

2.3 生物膜相關(guān)基因

Barros等[17]將白念珠菌和克柔念珠菌、光滑念珠菌分別單獨(dú)或共培養(yǎng)0 h、12 h和24 h形成單一生物膜和混合生物膜，通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與克柔念珠菌共培養(yǎng)時(shí)，白念珠菌的ALS3、HWP1、BCR1、EFG1和TEC1等生物膜相關(guān)基因表達(dá)被完全抑制，表明這兩個(gè)菌屬之間的轉(zhuǎn)錄組和表型之間存在拮抗關(guān)系；當(dāng)與光滑念珠菌共培養(yǎng)時(shí)，白念珠菌顯示出與克柔念珠菌相似的基因表達(dá)譜，但改變程度較小。該研究結(jié)果表明，克柔念珠菌和光滑念珠菌可通過改變或抑制白念珠菌黏附和生物膜的形成，與白念珠菌形成競爭關(guān)系，進(jìn)而影響致病性。

3 接種量比與營養(yǎng)成分

不同念珠菌屬對碳氮源的需求不太一樣，在共培養(yǎng)的過程中會(huì)對周圍營養(yǎng)產(chǎn)生競爭，營養(yǎng)競爭又會(huì)反過來對種群數(shù)量產(chǎn)生重要影響，而作為菌體起始濃度的接種量比會(huì)進(jìn)一步加劇種群之間的營養(yǎng)競爭。

3.1 接種量比

Olson等[18]研究了白念珠菌和光滑念珠菌初始接種量比的不同對二者混合生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)白念珠菌和光滑念珠菌接種量比分別為1∶3和1∶1時(shí)，與白念珠菌單一生物膜相比，二者混合生物膜的菌團(tuán)量(biomass)明顯增加；培養(yǎng)6 h的混合生物膜厚度比白念珠菌單一生物膜明顯增大。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌和白念珠菌的初始接種比分別為1∶1、1∶2和2∶1時(shí)，大部分情況下單一生物膜菌落形成單位明顯高于混合生物膜[19]。

3.2 培養(yǎng)基

分別用SDB和RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)白念珠菌和光滑念珠菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)與單一生物膜相比，二者形成的混合生物膜代謝活性無明顯差異，而SDB培養(yǎng)的混合生物膜菌團(tuán)量明顯高于RPMI-1640培養(yǎng)的混合生物膜，且SDB培養(yǎng)基中混合生物膜多以酵母態(tài)細(xì)胞聚集，RPMI-1640培養(yǎng)基中混合生物膜則多以菌絲態(tài)出現(xiàn)[20]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，使用不同培養(yǎng)基(RPMI-1640、YND和YPD培養(yǎng)基)時(shí)，混合生物膜中白念珠菌菌落形成單位幾乎全部都明顯低于光滑念珠菌，而且混合生物膜的總菌落形成單位也都明顯低于單一生物膜[19]。

3.3 碳源

Bezerra等[21]發(fā)現(xiàn)與無葡萄糖相比，葡萄糖濃度分別為100和300 mmol/L時(shí)，白念珠菌-光滑念珠菌混合生物膜菌落形成單位明顯升高，其中當(dāng)葡萄糖濃度為300 mmol/L時(shí)，無論單一生物膜還是混合生物膜與無葡萄糖相比不溶性細(xì)胞外多糖(insoluble extracellular polysaccharides，IEPS)的含量都顯著增加?？偟膩碚f，生物膜形成過程中高濃度葡萄糖有利于念珠菌單一生物膜和混合生物膜的生長。Weerasekera等[22]研究葡萄糖、蔗糖和糖精對白念珠菌和熱帶念珠菌單一生物膜、混合生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)與不補(bǔ)加上述三種糖相比，5%葡萄糖下混合生物膜的代謝活性比5%的蔗糖更高，且混合生物膜中酵母態(tài)細(xì)胞比白念珠菌單一生物膜顯著減少。

4 抗真菌藥物

常用的抗真菌藥物包括唑類藥物、棘白霉素類藥物和多烯類藥物，而不同的念珠菌屬對不同的抗真菌藥物具有不同的敏感性。

4.1 藥物動(dòng)力學(xué)

Vipulanandan等[23]研究了氟康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B對混合生物膜(白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4種念珠菌形成的混合生物膜經(jīng)氟康唑處理后，標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株(包括敏感株和耐藥株)分別形成的混合生物膜中光滑念珠菌的占比都高于其他念珠菌；經(jīng)卡泊芬凈處理后，標(biāo)準(zhǔn)菌株混合生物膜中熱帶念珠菌占比最高，而臨床株(敏感株和耐藥株)混合生物膜中光滑念珠菌和熱帶念珠菌占比較高；經(jīng)兩性霉素B處理后，標(biāo)準(zhǔn)菌株混合生物膜中白念珠菌占比最高，但其在臨床菌株(敏感株和耐藥株)混合生物膜中占比最少，總體來說抗真菌藥物有利于非白念珠菌在多物種形成的混合生物膜中生長。Pesee等[24]發(fā)現(xiàn)光滑念珠菌單一生物膜和光滑念珠菌-白念珠菌混合生物膜形成能力均顯著低于白念珠菌單一生物膜，且單獨(dú)使用卡泊芬凈后，白念珠菌單一生物膜的SMIC50顯著低于混合生物膜，而光滑念珠菌單一生物膜的SMIC50與混合生物膜相比沒有明顯變化；單獨(dú)使用氟康唑后，光滑念珠菌單一生物膜的SMIC50與混合生物膜相比明顯下降；與單獨(dú)使用時(shí)比，二者聯(lián)用(均為1/4SMIC50)能更顯著地抑制混合生物膜菌團(tuán)量。

4.2 藥物滲透作用

Al-Fattani等[25]研究氟康唑和氟胞嘧啶對白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌單一生物膜以及白念珠菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)形成的混合生物膜的滲透，發(fā)現(xiàn)氟康唑比氟胞嘧啶能更快地滲透到全部念珠菌單一生物膜中，而氟康唑和氟胞嘧啶分別通過白念珠菌GDH2346、GDH2023和GRI682(臨床株)的生物膜擴(kuò)散速率相似。不過藥物通過光滑念珠菌或克柔念珠菌生物膜的擴(kuò)散率比近平滑念珠菌或熱帶念珠菌生物膜的快，但是這兩種藥物通過白念珠菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)形成的混合生物膜擴(kuò)散率明顯低于其單一生物膜。

4.3 其他藥物

Carmello等[26]將白念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌單一生物膜以及白念珠菌-光滑念珠菌、白念珠菌-熱帶念珠菌混合生物膜用哌唑嗪(photodithazine，PDZ)和LED燈(37.5 J/cm2, 660 nm)照射。結(jié)果顯示，150 mg/L哌唑嗪能使3種念珠菌活力分別降低1.0 log10、1.2 log10、1.5 log10，能使混合生物膜中每個(gè)念珠菌活力下降1.0 log10，并可使單一生物膜菌團(tuán)量減少，但對混合生物膜菌團(tuán)量沒有明顯影響，這說明哌唑嗪介導(dǎo)的抗菌光動(dòng)力療法在滅活單一生物膜時(shí)比混合生物膜更有效。Silva等[27]將100 μg/mL的銀納米顆粒和100 μg/mL制霉菌素分別加入到預(yù)先形成的白念珠菌和光滑念珠菌的單一生物膜和混合生物膜中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，無論銀納米顆粒還是制霉菌素都能顯著降低白念珠菌和光滑念珠菌形成的單一生物膜和混合生物膜中菌落形成單位和總菌團(tuán)量，說明二者能顯著抑制白念珠菌和光滑念珠菌形成的單一生物膜和混合生物膜。

5 其他相關(guān)影響因素

除了上述所討論的營養(yǎng)物質(zhì)、抗真菌藥物等因素的影響，相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)還有一些其他因素(如被膜基質(zhì)等)也會(huì)對念珠菌混合生物膜的形成產(chǎn)生較大影響。

5.1 生物膜基質(zhì)(biofilm matrix，BM)

念珠菌屬生物膜胞外基質(zhì)(extracellular matrix)包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸等[28]。β-1,3-葡聚糖是念珠菌生物膜基質(zhì)中的一種重要多糖，它有助于生物膜的形成和積累，并保護(hù)生物膜中的菌體細(xì)胞免受宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的清除[29]。Tan等[30]發(fā)現(xiàn)，β-1,3-葡聚糖酶對浮游狀態(tài)非白念珠菌的生長和黏附?jīng)]有影響，但是能抑制熱帶念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌共同形成的混合生物膜；兩性霉素B和β-1,3-葡聚糖酶聯(lián)用時(shí)，熱帶念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌單一生物膜以及三者形成的混合生物膜菌體細(xì)胞新陳代謝活力顯著降低，β-1,3-葡聚糖酶可以恢復(fù)混合生物膜菌體細(xì)胞對抗真菌藥物的敏感性。

5.2 群感效應(yīng)分子(酪醇、法尼醇)

Monteiro等[31]用40 mmol/L酪醇和60 mmol/L法尼醇聯(lián)合處理白念珠菌和光滑念珠菌的單一生物膜和混合生物膜，與未處理組相比，白念珠菌單一生物膜和混合生物膜的菌團(tuán)量都增加，但光滑念珠菌單一生物膜菌團(tuán)量減少，同時(shí)白念珠菌和光滑念珠菌的單一生物膜和混合生物膜代謝活性都顯著降低，混合生物膜中光滑念珠菌菌落形成單位減少比白念珠菌減少的更多，且混合生物膜中菌絲和酵母態(tài)細(xì)胞明顯減少。Arias等[32]使用白念珠菌ATCC10231和光滑念珠菌ATCC90030在丙烯酸樹脂和羥基磷灰石表面形成單一生物膜和混合生物膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 mmol/L酪醇能顯著降低在兩個(gè)表面上形成的單一生物膜和混合生物膜代謝活性及菌落形成單位，并能造成菌體細(xì)胞損傷，說明酪醇對二者形成的混合生物膜具有抑制作用。

5.3 益生菌

研究表明乳酸桿菌屬具有抗真菌及其生物膜的作用[33]。Tan等[34]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌上清液可抑制熱帶念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌單一生物膜以及三者形成的混合生物膜生長和細(xì)胞活力，而且在預(yù)先形成的生物膜中添加乳酸桿菌上清液也能破壞生物膜的進(jìn)一步形成。Kunyeit等[35]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和伊撒酵母菌(Issatchenkiaoccidentalis)對光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌分別與白念珠菌形成的混合生物膜有明顯的抑制作用。

6 小 結(jié)

一般來說，相比單一生物膜，念珠菌混合生物膜的毒力更強(qiáng)，對抗真菌藥物的敏感性更低。目前雖然發(fā)現(xiàn)種屬及其他相關(guān)因素(如營養(yǎng)物質(zhì)、抗真菌藥物等)會(huì)對念珠菌混合生物膜的形成產(chǎn)生影響，但是具體到特定念珠菌屬混合生長的作用機(jī)制研究則仍屬于起步階段，某些菌屬混合生長的報(bào)道還有不一致的地方。念珠菌之間的相互作用是病原性真菌研究的重要課題，將有助于對真菌混合生物膜耐藥機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，對臨床真菌治療也具有極為重要的指導(dǎo)意義。