楊 翠， 劉 凱， 談紅艷， 余顯權(quán)， 周麗潔

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025)

世界三大主要糧食作物之一的水稻在我國有著良好的馴化基礎(chǔ)，目前世界近一半的人口把稻米作為主食[1]。長久以來，農(nóng)業(yè)科研工作者不斷利用和改造原有資源使水稻的品種不斷改良，但同時也帶來了水稻品種同質(zhì)化趨勢日益明顯、遺傳多樣性下降的問題[2-3]。遺傳多樣性是水稻遺傳改良的基礎(chǔ)，地方水稻種質(zhì)資源因其獨有的地域適應(yīng)性優(yōu)勢及豐富的遺傳多樣性逐漸成為育種家們選育突破性品種和發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因的重要種質(zhì)材料[4-5]。

隨著生活水平的日益提高，人們對稻米的色、香、味及營養(yǎng)成分均有了更高的要求?，F(xiàn)代飲食高油高脂的特點使高血壓、肥胖癥等富貴病成為常態(tài)，進(jìn)而使我國中醫(yī)理念(藥食同用、醫(yī)藥同源)得到了老百姓們的重視。紅米作為一種富含生物堿、微量元素和維生素類物質(zhì)的特色水稻在養(yǎng)身方面的作用得到了廣大消費者的青睞[6-7]。貴州地理生態(tài)環(huán)境多樣，蘊(yùn)藏著豐富的有色稻種資源，經(jīng)全國編目的貴州有色稻資源占貴州地方稻種資源的20.5%[8]，其中紅米水稻占多數(shù)，且多集中在秈型粘稻[9]。了解地方紅米種質(zhì)資源的遺傳多樣性是其高效利用和有利挖掘的前提，本研究旨在對現(xiàn)有的147份貴州地方紅米水稻資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期了解貴州紅米水稻遺傳多樣性的特點，明確各種質(zhì)間的親緣關(guān)系，為有效利用貴州地方紅米種質(zhì)資源和新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用的147份紅米地方品種由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提供，材料名稱和來源見表1。

表1 供試材料的名稱及來源Table 1 Names and sources of the tested materials

1.2 水稻基因組DNA的提取

以實驗室發(fā)芽所得水稻幼苗為材料，提取基因組DNA。取單苗加入液氮后碾碎，裝入2 mL離心管中，隨后加入預(yù)熱的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，采用經(jīng)典CTAB法提取水稻幼苗基因組DNA。檢測質(zhì)量后加入適量的ddH2O稀釋成DNA母液，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 引物的篩選、PCR擴(kuò)增及電泳

選取均勻分布于水稻12條染色體上、相互間不連鎖的56對SSR引物(每條染色體上至少4個)，委托上海Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL：2 μL模板 DNA(30～50 ng·μL-1)，10×PCR Buffer(含Mg2+)1.2 μL，dNTP 0.2 μL，5 U·μL-1Taq酶0.1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 4.5 μL。擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，降溫至4 ℃后取出置于4 ℃冰箱備用。擴(kuò)增的產(chǎn)物采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每對SSR引物檢測1個位點，每條多態(tài)性帶為1個等位基因，參照 http://www.Gramene.org/提供的SSR信息進(jìn)行記錄。SSR數(shù)據(jù)利用POPGENE 32統(tǒng)計軟件計算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)和Shannon信息指數(shù)(I)[10]。多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)，PIC=1-∑pi2，其中pi為任一引物組合第i對多態(tài)性帶在所有供試材料中出現(xiàn)的頻率?；螂s合度(H)=觀察到的雜合數(shù)/試驗樣品總數(shù)。DNA圖譜中，在同一遷移位置，列出二元數(shù)據(jù)矩陣：有DNA擴(kuò)增帶的記為“1”，無擴(kuò)增帶的記為“0”，缺失條帶記為“2”。使用NTSYS-p 0 c 2.10 e統(tǒng)計分析軟件計算品種間的遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)的相關(guān)數(shù)據(jù)采用UPGMA(非加權(quán)配對算數(shù)平均法)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性及各位點的PIC值分析

利用分布于水稻12條染色體的56對SSR引物進(jìn)行遺傳相似性和遺傳多樣性分析。共檢測到等位基因148個，品種間不同位點的等位基因數(shù)目變幅為2～5個，平均2.642 9個。在檢測到的等位基因中，稀有的等位基因(基因頻率小于0.05)有16個，占比10.8%；基因頻率大于0.95的有4個，占比2.7%。位點RM 207和位點RM 241均檢測到5個等位片段，等位基因數(shù)在2～4之間的有54對，占參試引物的96.4%(表2)。

由表2可知，各位點的PIC值平均為0.369 4，變幅為0.040 0～0.748 7。引物RM 207和RM 241均檢測到5個等位片段，PIC值分別為0.748 7和0.724 6，說明兩個位點的等位片段在各品種間分布頻率差異均較大?；螂s合度(H)最高的是0.145 0(RM 156)，而RM 113、RM 212、RM 165、RM 109、RM 322、RM 207、RM 218、RM 3、RM 141、RM 125、RM 214、RM 344、RM 223、RM 186、RM 261、RM 471、RM 241、RM 169、RM 598、RM 131、RM 205、RM 209、RM 511的基因雜合度為0(23對)。

表2 56對SSR引物各等位基因頻率及H值Table 2 The allele frequencies and H values of 56 SSR primers

分別對每一染色體上SSR位點的總PIC值和等位片段數(shù)進(jìn)行平均(圖1)，結(jié)果顯示第9號染色體的平均PIC值最高，比12條染色體總平均高29.5%，第1、7號和第12號染色體較低，比總平均低36.6%、33.8%和31.1%(圖1-A)，表明9號染色體具有豐富的等位基因片段變異；平均等位片段數(shù)的比較分析發(fā)現(xiàn)，第4、11號染色體上的平均等位片段最多，均比12條染色體總平均多14.3%，第1號和第12號染色體上的最少，分別比12條染色體總平均少12.4%和14.4%(圖1-B)，結(jié)合平均PIC值，表明第1號和第12號染色體的等位基因片段變異較少或者等位片段分布頻率的均勻度較差。

2.2 遺傳多樣性分析

對147份貴州地方紅米品種資源的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)貴州地方紅米品種的遺傳多樣性水平較低。由表3可知，有效等位基因數(shù)變幅為1.034 6～3.978 8，平均1.758 5個，有效等位基因所占比例為66.5%。Nei’s基因多樣性指數(shù)變幅為0.033 4～0.748 7，平均為0.354 9；Shannon信息指數(shù)平均為0.604 6，變幅為0.086 1～1.471 4，其中最大值位點是引物RM 474，最小值位點是RM 435。Nei’s基因多樣性指數(shù)是等位基因數(shù)和頻率的函數(shù)[11]，故具有較高基因多樣性指數(shù)值的SSR標(biāo)記如RM 474具有較高的檢測效率。

表3 147份紅米材料遺傳多樣性SSR分析Table 3 SSR analysis of genetic diversity of 147 red rice varieties

2.3 遺傳相似性分析

根據(jù)56對SSR引物在147份供試品種中獲得的148條擴(kuò)增帶計算供試品種間的遺傳相似系數(shù)以0.02為組距進(jìn)行次數(shù)分布分析，獲得遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布圖(圖2)。由圖2表明，所有供試品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.54～1.00之間，平均為0.728。供試品種的遺傳相似系數(shù)次數(shù)呈正態(tài)分布，遺傳相似系數(shù)在0.64～0.84之間的數(shù)量為9 511個，占整個數(shù)據(jù)的92.3%；0.64以下的有546個，占總數(shù)的5.3%；0.84以上的有251個，占總數(shù)的2.4%。說明目前貴州省地方紅米水稻資源遺傳相似性較高，遺傳差異較大的品種數(shù)量相對較少。

2.4 聚類分析

利用56個SSR標(biāo)記計算出147份材料的遺傳相似系數(shù)，在0.54～0.99范圍內(nèi)存在遺傳變異。遺傳相似性較小的是金華金麻谷和大廣麻粘，較大的是油粘紅米和青稈粘紅米。按UPGMA法進(jìn)行聚類分析得聚類圖(圖3)，在遺傳相似系數(shù)為0.55的水平上，可將供試材料聚為兩大類。第Ⅰ類由140份材料組成，占供試材料總數(shù)的95.24%。在閾值為0.72處，可將其分為三個亞組，用Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3表示，分別含有128、11和1個材料。第Ⅱ類包含7個材料，分別為10號(毫米紅)、23號(雷粘)、141號(金華金麻谷)、44號(大紅晚谷)、62號(小紅晚谷)、48號(大胖谷)及106號(陽貓糯)。根據(jù)遺傳相似性越大親緣關(guān)系越近的原則，金華金麻谷和大廣麻粘親緣關(guān)系相差較大，油粘紅米和青稈粘紅米親緣關(guān)系較近。在所檢測位點中沒有基因型完全相同的品種，51號和91號種質(zhì)名稱都為“大紅米”，收集地分別為晴隆和安順，由圖3可看出二者遺傳背景并不相同。大部分來源地相同的種質(zhì)沒有聚在一起，而不同名的遺傳相似性卻較高，說明種質(zhì)之間的遺傳差異與收集地沒有較大關(guān)系。

3 討 論

遺傳多樣性是水稻育種與遺傳改良的重要基礎(chǔ)[12]。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用SSR標(biāo)記對水稻的遺傳多樣性開展了大量研究[13-23]，馬靜等[21]對中國寧夏地區(qū)的59份水稻主栽品種通過82對SSR引物進(jìn)行分析，遺傳多樣性指數(shù)平均為0.439 4，強(qiáng)調(diào)了寧夏水稻種質(zhì)多引種于東北和日本是造成遺傳多樣性不高的主要原因。從夕漢等[22]利用29個SSR標(biāo)記分析東南亞62個水稻品種，平均多態(tài)信息含量為0.515，表明來自同一來源地的品種有狹窄的遺傳基礎(chǔ)。于萍等[23]采用45對SSR引物對224個太湖流域粳稻地方品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均基因多樣性指數(shù)為0.197，闡明太湖流域連續(xù)多年的選擇壓力、遺傳瓶頸效應(yīng)是造成遺傳基礎(chǔ)變小的主要因素?，F(xiàn)階段對于貴州地方紅米資源的遺傳多樣性研究開展較少，馬琳等[14]利用13對引物對22份貴陽高坡紅米材料進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，高坡紅米品種大多數(shù)屬于秈稻，且遺傳多樣性豐富。對比研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴州省現(xiàn)有紅米種質(zhì)遺傳多樣性較低、遺傳基礎(chǔ)較狹窄，說明應(yīng)加強(qiáng)對貴州省現(xiàn)有紅米種質(zhì)的多樣性保護(hù)。導(dǎo)致出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因有：各個地區(qū)的紅米種質(zhì)親緣關(guān)系本來就較近，加上農(nóng)戶換種的普遍現(xiàn)象和優(yōu)良品種的引入，部分遺傳多樣性較高的地方品種遭到淘汰；其次可能是由于多態(tài)性較低的引物也會導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示貴州省不同地區(qū)紅米種質(zhì)的遺傳多樣性較低。

貴州具有豐富的地方紅米水稻資源，多分布于中高海拔山區(qū)較寒冷和貧瘠的坡地，具有較強(qiáng)的抗寒性和高山適應(yīng)性。本研究所用的水稻材料中存在一些品種名稱相似的材料，研究發(fā)現(xiàn)它們之間的遺傳差異較小。從夕漢等[22]對東南亞62個秈稻品種做遺傳多樣性分析時針對有些品種遺傳距離極近的情況提出了可能是由于“同種異名”導(dǎo)致的觀點。聚類圖中的油粘紅米和青稈粘紅米具有較高的遺傳系數(shù)，為0.99，且都來源于安順，是否為同一種質(zhì)有待進(jìn)一步深入研究；大紅晚谷與小紅晚谷種質(zhì)名稱非常相似，遺傳相似系數(shù)為0.875，同屬于粳稻卻來自不同地區(qū)；統(tǒng)稱為“大紅米”的兩個種質(zhì)遺傳背景不同。這些現(xiàn)象很有可能都是由于農(nóng)戶換種而引起的“同種異名”與“異種同名”。因而只有盡快收集保護(hù)這些種質(zhì)資源并建立核心種質(zhì)庫，才能避免這樣的情況發(fā)生，減少水稻遺傳基礎(chǔ)遺失。

研究結(jié)果表明，利用56個SSR標(biāo)記對147份貴州地方紅米材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，大部分品種間親緣關(guān)系較近，但也有可能是由于所選的標(biāo)記還不足以區(qū)分它們之間的差別。因此，在今后的水稻育種工作中應(yīng)該增加所用標(biāo)記位點的數(shù)量，增強(qiáng)有利基因的挖掘以及新的種質(zhì)資源的運用，拓寬貴州紅米的遺傳基礎(chǔ)。與此同時，為了解決我國稻米品質(zhì)差和糧食安全的問題，需要積極挖掘有利基因及性狀，加快收集、保存及利用一些具有遺傳基礎(chǔ)豐富、農(nóng)藝性狀優(yōu)良及品質(zhì)口感較佳的種質(zhì)資源，培育出優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)能力強(qiáng)的品種，盡早實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效的育種目標(biāo)。

4 結(jié) 論

本研究利用56對SSR引物對貴州省地方紅米水稻資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.354 9，平均Shannon信息指數(shù)(I)為0.604 6，平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.369 4。遺傳相似系數(shù)平均為0.728，在遺傳相似系數(shù)為0.55的水平上，可將供試材料聚為兩大類，其中第Ⅰ類涵蓋的品種有140個，占供試材料總數(shù)的95.24%。由此可見，貴州省地方紅米水稻資源總體上遺傳多樣性水平較低，遺傳基礎(chǔ)較狹窄，應(yīng)加強(qiáng)種質(zhì)交流，拓寬貴州地方紅米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)。