王 險(xiǎn)， 楊 杰

(1.北京觀韜中茂律師事務(wù)所，北京 100032；2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100160)

蝗蟲(chóng)俗稱螞蚱，是農(nóng)田中常見(jiàn)的一種昆蟲(chóng)，蝗蟲(chóng)主要發(fā)生在熱帶、溫帶草原和沙漠地區(qū)，蝗蟲(chóng)的食性雜、食量大，喜食小麥、水稻、谷子、玉米、蔬菜等農(nóng)作物，食物匱乏時(shí)豆類、煙草、蘆葦、果樹(shù)、林木及雜草的葉子、嫩莖、花蕾和嫩果等植物均會(huì)受到蝗蟲(chóng)的危害，蝗蟲(chóng)每天都要吃掉和自己的體重相當(dāng)?shù)氖澄?，一旦成?zāi)，有可能導(dǎo)致糧食顆粒無(wú)收，嚴(yán)重威脅我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前防治蝗蟲(chóng)主要是采用化學(xué)農(nóng)藥防治的方法，盡管化學(xué)防治可以迅速壓低蝗蟲(chóng)的蟲(chóng)口密度，但是往往造成污染環(huán)境、殺傷大量有益動(dòng)物、人畜中毒和害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性等不良后果。生物農(nóng)藥治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不殺傷天敵、對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人畜安全，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本文通過(guò)incoPat科技創(chuàng)新情報(bào)平臺(tái)(IncoPat收錄了全球102個(gè)國(guó)家/組織/地區(qū)1億余件專利信息)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用關(guān)鍵詞及分類號(hào)(蝗蟲(chóng)、螞蚱、locust、locusts、grasshopper、A01N63、C12N、C12R、A01P7/06、A01P7/04、A01P7/02、A01P7/00)對(duì)2000年01月01日至2020年10月15日之間的專利數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索統(tǒng)計(jì)。通過(guò)全面分析生物方法防治蝗蟲(chóng)的中國(guó)專利申請(qǐng)態(tài)勢(shì)、重點(diǎn)申請(qǐng)人狀況和專利技術(shù)分析，為生物防治蝗蟲(chóng)提供專利信息支撐。

1 中國(guó)專利申請(qǐng)態(tài)勢(shì)

(圖1)給出了生物防治蝗蟲(chóng)的申請(qǐng)趨勢(shì)?？梢钥闯觯锓乐位认x(chóng)的專利數(shù)量并不是很多，發(fā)展也比較晚。2013年以前每年申請(qǐng)的專利數(shù)量少于10件，2013年以后申請(qǐng)的數(shù)量逐漸增加，但是到2019年每年的申請(qǐng)數(shù)量也未能突破30件。申請(qǐng)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)范圍是目前已公開(kāi)的專利。由于時(shí)間原因，部分新申請(qǐng)的專利可能還處于未公開(kāi)的狀況，導(dǎo)致(圖1)2020年的申請(qǐng)量出現(xiàn)偏低的情況。

圖1 生物防治蝗蟲(chóng)專利申請(qǐng)趨勢(shì)

2 主要申請(qǐng)人的申請(qǐng)量趨勢(shì)

(圖2)可以看出，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人主要以高校和研究所為主，其中山西大學(xué)是生物防治蝗蟲(chóng)領(lǐng)域申請(qǐng)量最多的申請(qǐng)人，從2000年至今年累計(jì)申請(qǐng)量達(dá)到42件。排名第二的是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，申請(qǐng)量達(dá)25件，明顯高于其余申請(qǐng)人。

圖2 主要申請(qǐng)人的申請(qǐng)量排名

3 國(guó)內(nèi)主要申請(qǐng)人的重點(diǎn)研究方向

3.1 山西大學(xué) (圖3)可以看出，山西大學(xué)在蝗蟲(chóng)生物防治研究方面主要著力與RNAi干擾技術(shù)的研究。RNA干擾(RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為人類的疾病治療和作物害蟲(chóng)防治開(kāi)辟了新的途徑。山西大學(xué)主要研究了通過(guò)不同的基因干擾昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)、昆蟲(chóng)表皮酯質(zhì)合成、表皮蛋白等影響抑制蝗蟲(chóng)蛻皮，達(dá)到殺死蝗蟲(chóng)的效果。

3.2 中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所 (圖4)顯示中國(guó)農(nóng)科院植保保護(hù)研究所在RNAi干擾、真菌防治、通過(guò)基因引起免疫抑制反應(yīng)調(diào)節(jié)真菌對(duì)蝗蟲(chóng)侵染的效果等方面都進(jìn)行了一定的研究。RNAi干擾技術(shù)著力研究相關(guān)基因干擾蝗蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)干擾蝗蟲(chóng)的發(fā)育達(dá)到防治蝗蟲(chóng)的目的。真菌防治方面，中國(guó)農(nóng)科院植保研究所主要研究了相關(guān)蛋白基因增強(qiáng)綠僵菌殺滅蝗蟲(chóng)的效率，綠僵菌及金龜子綠僵菌與相關(guān)化藥的組合物。中國(guó)農(nóng)科院植保所還通過(guò)相關(guān)基因?qū)е禄认x(chóng)產(chǎn)生免疫的應(yīng)答達(dá)到致死蝗蟲(chóng)的效果。

圖4 中國(guó)農(nóng)科院植保所蝗蟲(chóng)研究方向

3.3 四川大學(xué) 申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)一種殺蟲(chóng)蛋白所致.該蛋白分子量為25100 Da，經(jīng)研究表明該菌無(wú)芽孢，本身具有較強(qiáng)毒蛋白，具有構(gòu)建成為遺傳工程菌廣泛用于生物防治的潛力。(圖5)可知四川大學(xué)在抗殺蟲(chóng)基因技術(shù)上做了相關(guān)研究。此外，申請(qǐng)人還對(duì)真菌及植物來(lái)源的活性化合物對(duì)蝗蟲(chóng)的防治進(jìn)行了相關(guān)研究。

圖5 四川大學(xué)蝗蟲(chóng)防治研究方向

3.4 重慶大學(xué) (圖6)可以看出重慶大學(xué)在RNAi干擾技術(shù)和真菌防治蝗蟲(chóng)方面進(jìn)行了研究。重慶大學(xué)研究了ATP合酶α和β亞基基因cDNA的保守序列，并構(gòu)建其RNA、DNA等構(gòu)建體，利用RNAi技術(shù)沉默蝗蟲(chóng)體內(nèi)ATP合酶α亞基，使體內(nèi)ATP合酶α亞基的表達(dá)明顯受到抑制，導(dǎo)致蝗蟲(chóng)產(chǎn)生致死效應(yīng)，可應(yīng)用于RNAi技術(shù)對(duì)東亞飛蝗害蟲(chóng)防治。重慶大學(xué)還研究了蝗綠僵菌工程菌株的制備和綠僵菌及綠僵菌和化學(xué)農(nóng)藥的組合物進(jìn)行蝗蟲(chóng)防治。

圖6 重慶大學(xué)蝗蟲(chóng)防治研究方向

3.5 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)是一種蝗蟲(chóng)專性的寄生原生動(dòng)物，只對(duì)蝗蟲(chóng)等直翅目昆蟲(chóng)有致病性，對(duì)脊椎動(dòng)物完全無(wú)致病性，在田間使用過(guò)程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低，在防治蝗蟲(chóng)災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力。(圖7)可以看到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)主要研究方向是蝗蟲(chóng)微孢子在防治蝗蟲(chóng)方面的應(yīng)用。

圖7 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)蝗蟲(chóng)防治研究方向

4 生物防治蝗蟲(chóng)專利技術(shù)分析

通過(guò)國(guó)內(nèi)主要申請(qǐng)人生物防治蝗蟲(chóng)的研究方向分析可以看出，我國(guó)在蝗蟲(chóng)生物防治方面主要研究方向集中在以下三個(gè)方面：1、RNA干擾技術(shù)；2、真菌防治；3、蝗蟲(chóng)微孢子。

4.1 RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，自2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)以來(lái)，RNAi技術(shù)一直躋身于科技前沿。RNAi不僅是研究基因功能的有力工具，同時(shí)在害蟲(chóng)防治方面也具有極大潛力。通過(guò)RNA干擾進(jìn)行害蟲(chóng)防治具有如下特點(diǎn)：1)殺蟲(chóng)具有專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解，無(wú)殘留；3)對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害，相對(duì)安全。因此學(xué)者將其稱為第四代殺蟲(chóng)劑?；赗NA干擾進(jìn)行害蟲(chóng)防治的基礎(chǔ)技術(shù)是篩選靶標(biāo)序列獲得具有高致死作用的dsRNA。廣泛用于昆蟲(chóng)RNAi實(shí)驗(yàn)的基本方法有兩種。一種方法是采用體外合成的dsRNA，然后將其導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)或細(xì)胞中，稱為外源性RNAi；另一種方法是用DNA表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)或細(xì)胞中，在體內(nèi)或細(xì)胞中表達(dá)時(shí)合成dsRNA，稱為內(nèi)源性RNAi。盡管內(nèi)源性方法可以在昆蟲(chóng)生活史的任何時(shí)間實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性或組織特異性的RNAi，具有遺傳性等優(yōu)點(diǎn)，但由于很多昆蟲(chóng)還沒(méi)有建立成功的轉(zhuǎn)基因體系，所以這種方法目前還并不適合許多昆蟲(chóng)的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重點(diǎn)手段。國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人研究的方向也主要是通過(guò)篩選基因序列合成相關(guān)的dsRNA，然后將其導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)或細(xì)胞中進(jìn)行防治蝗蟲(chóng)研究。

4.2 真菌防治 昆蟲(chóng)病原真菌是昆蟲(chóng)病原生物中的最大類群。據(jù)野外調(diào)查越冬昆蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)疾病中約有60%是由真菌引起的，病原真菌也是最早被系統(tǒng)地利用來(lái)控制害蟲(chóng)的昆蟲(chóng)病原微生物?；认x(chóng)的主要病原真菌，包括綠僵菌M.anisopliae、白僵菌B.bassiana、黃綠僵菌M.flavoviride、黃曲霉菌Aspergillus flavus等[1]。我國(guó)申請(qǐng)人中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、重慶大學(xué)、四川大學(xué)、中科院動(dòng)物研究所、江西天人生態(tài)股份有限公司等都對(duì)對(duì)綠僵菌、白僵菌進(jìn)行了相關(guān)研究，也有對(duì)蛋白或化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌或白僵菌組合來(lái)提高相應(yīng)真菌的殺蟲(chóng)效果的研究。

白僵菌是一種半知菌類的蟲(chóng)生真菌，可以侵入6個(gè)目15科200多種昆蟲(chóng)、螨類的蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖，同時(shí)不斷產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結(jié)晶，這些物質(zhì)可引起昆蟲(chóng)中毒，使體液發(fā)現(xiàn)機(jī)能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。金龜子綠僵菌屬于半知菌亞門(mén)綠僵菌屬，是一種廣譜的昆蟲(chóng)病原真菌，可寄生于多種昆蟲(chóng)體內(nèi)。綠僵菌具有顯著的殺蟲(chóng)效果，并且具有不同于現(xiàn)有殺蟲(chóng)劑的全新的作用機(jī)理，主要作用于昆蟲(chóng)血淋巴免疫系統(tǒng)，使之喪失免疫防御功能。白僵菌和綠僵菌制劑對(duì)人、畜無(wú)毒，對(duì)作物安全，無(wú)殘留、無(wú)污染，但能感染家蠶幼蟲(chóng)，形成僵蠶病。因此，百僵菌和綠僵菌制劑防治蝗蟲(chóng)具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

4.3 蝗蟲(chóng)微孢子 蝗蟲(chóng)微孢子Nosema(Paranosema)locustae 是一種可以侵染100多種直翅目昆蟲(chóng)的單細(xì)胞真核病原微生物，其在田間的應(yīng)用范圍非常廣泛?；认x(chóng)取食了被蝗蟲(chóng)微孢子污染過(guò)的食物后，孢子即在蝗蟲(chóng)消化道中萌發(fā)，暴發(fā)性地突出極絲尖端，穿進(jìn)寄主細(xì)胞和中腸腸壁細(xì)胞，到達(dá)血腔，進(jìn)入感受性組織細(xì)胞如在脂肪體中開(kāi)始無(wú)性裂殖生殖，將孢子的孢原質(zhì)釋放出來(lái)，開(kāi)始在寄主的細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，消耗蝗蟲(chóng)體內(nèi)的能源物質(zhì)，導(dǎo)致蟲(chóng)體總脂含量和血淋巴甘油脂含量大幅度下降及血淋巴脂肪酶活力大幅度上升，使蝗蟲(chóng)出現(xiàn)畸形，發(fā)育期延長(zhǎng)，壽命縮短，喪失生殖能力。此外，微孢子還可侵染蝗蟲(chóng)的唾腺、圍心細(xì)胞及神經(jīng)組織；在其病蟲(chóng)體內(nèi)的卵細(xì)胞、側(cè)輸卵管、中輸卵管中均發(fā)現(xiàn)有微孢子，產(chǎn)卵量下降約50%，孵化率極低，取食量下降，隨著微孢子在寄主體內(nèi)不斷增殖，使寄主的生理機(jī)能等遭到破壞而死亡?；认x(chóng)微孢子不污染環(huán)境、不殺傷天敵、對(duì)人畜安全，不產(chǎn)生對(duì)其他生物的二次毒害，有利于保護(hù)生物多樣性。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)針對(duì)蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的致病力一般較弱的缺陷，從從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)(Antonospora locustae)，命名為AL2008L-04株系，結(jié)果表明，AL2008-01株系具有良好的致病力，提高蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的毒力。

5 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)專利數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和技術(shù)分析可以看出，我國(guó)生物防治蝗蟲(chóng)的研發(fā)主體集中在高校和研究所，研究的重點(diǎn)在使用RNA干擾技術(shù)。RNA干擾技術(shù)具有殺蟲(chóng)具有專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用；RNA在自然界極易降解，無(wú)殘留；對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害，相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)。其研究的機(jī)理是通過(guò)選擇合適的基因序列然后在體外合成的dsRNA，將合成的dsRNA在注入蝗蟲(chóng)體內(nèi)。這樣的方法在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域大規(guī)模防治蝗蟲(chóng)上存在施用困難的缺點(diǎn)。因此，研發(fā)適用大規(guī)模防治蝗蟲(chóng)的RNA干擾技術(shù)是未來(lái)發(fā)展的方向。

昆蟲(chóng)病原真菌，相較于化學(xué)殺蟲(chóng)劑，具有環(huán)境友好、抗逆性強(qiáng)、能大量擴(kuò)散、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，是廣泛應(yīng)用的一類生物農(nóng)藥。然而，目前昆蟲(chóng)病原真菌作為殺蟲(chóng)劑仍然存在著致死時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。通過(guò)研究真菌致病機(jī)理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌殺蟲(chóng)劑的效果是當(dāng)前研究的一個(gè)重要方向。

蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)是一種蝗蟲(chóng)專性的寄生原生動(dòng)物，只對(duì)蝗蟲(chóng)等直翅目昆蟲(chóng)有致病性，對(duì)脊椎動(dòng)物完全無(wú)致病性，實(shí)驗(yàn)研究證明對(duì)蜜蜂也不感染，安全性好，而且該病原物在田間使用過(guò)程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低，因此在防治蝗蟲(chóng)災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力?？朔?dāng)前蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的致病力一般較弱的缺陷，篩選合適的蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)提高蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的毒力是該領(lǐng)域值得關(guān)注的研發(fā)方向。