盧俊玲　尤燕舞

[專家介紹]尤燕舞，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，學(xué)術(shù)帶頭人。曾在美國(guó)洛杉磯Cedars Sinai醫(yī)學(xué)中心擔(dān)任博士后研究員。主要從事慢性腎臟疾病的基因、免疫及分子機(jī)制的研究。現(xiàn)任中國(guó)僑聯(lián)特聘專家、廣西醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟病學(xué)分會(huì)常務(wù)委員、廣西醫(yī)師協(xié)會(huì)腎臟內(nèi)科醫(yī)師分會(huì)常務(wù)委員、廣西中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)會(huì)常務(wù)委員、廣西醫(yī)學(xué)會(huì)百色市腎臟病學(xué)分會(huì)副主任委員，百色市第四屆政協(xié)委員，2012年入選“廣西高校優(yōu)秀人才計(jì)劃”，先后獲得“百色市專業(yè)技術(shù)拔尖人才”“中國(guó)僑界貢獻(xiàn)獎(jiǎng)”“優(yōu)秀教師”“廣西十佳青年醫(yī)師”“十佳醫(yī)德標(biāo)兵”“教學(xué)名師”等榮譽(yù)稱號(hào)。主持在研國(guó)家自然科學(xué)基金2項(xiàng)、廣西自然科學(xué)基金4項(xiàng)、廣西高?？蒲兄攸c(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng)，主持完成廣西高等教育教學(xué)改革研究課題1項(xiàng)。在國(guó)際、國(guó)內(nèi)知名期刊公開(kāi)發(fā)表論著80多篇。榮獲廣西科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、三等獎(jiǎng)各1項(xiàng)，廣西醫(yī)藥衛(wèi)生適宜技術(shù)推廣三等獎(jiǎng)1項(xiàng)，百色市科技創(chuàng)新二等獎(jiǎng)1項(xiàng)。

【摘要】 外泌體是由B細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞釋放并存在不同體液中的外囊泡，其攜帶的蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，參與細(xì)胞的通信、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及生化組成，是目前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。外泌體蛋白質(zhì)在多種人類疾病診療中占有重要地位，而腎臟疾病具有發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、診斷難等特點(diǎn)，所以腎臟穿刺仍是診斷腎臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但因?yàn)閷儆谇秩胄圆僮鞴什蛔鳛樵\斷的首選檢查，外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析則能精準(zhǔn)地鑒定出多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，并且能較好地運(yùn)用在腎臟疾病的診療中。該文通過(guò)不同方面討論外泌體蛋白組學(xué)分析在腎臟疾病研究中的最新進(jìn)展，有望為腎臟疾病的診療提供新思路。

【關(guān)鍵詞】 外泌體;蛋白質(zhì)組學(xué);腎臟疾病

中圖分類號(hào)：R692? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.001

【Abstract】 ? Exosomes are vesicles released by B cells， T cells and other cells and exist in different body fluids. Proteins carried by exosomes can be transported between cells， participate in cell communication， material transport and biochemical composition. This has become a research hotspot of precision medicine. Exosomes play an important role in the diagnosis and treatment of various human diseases， while kidney diseases， because of their complicated pathogenesis and difficult diagnosis， renal puncture is still the gold standard for the diagnosis of them. However， because of its invasive operation， it is not the first choice for diagnosis of renal diseases. Exosomes proteomics analysis can accurately identify a variety of protein biomarkers， and it can be better used in the diagnosis and treatment of renal diseases. Therefore， this review discusses the latest progress of exosomes proteomic analysis in kidney disease research from different aspects， which is expected to provide new ideas for the diagnosis and treatment of kidney disease.

【Key words】?exosomes; proteomics; kidney diseases

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，腎臟疾病的高發(fā)病率及死亡率已成為目前重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]，對(duì)腎臟疾病進(jìn)行早期診斷及早期治療尤為重要。血液和尿液檢查仍是臨床診斷腎臟疾病的首選，根據(jù)當(dāng)前腎臟疾病改善全球預(yù)后KDIGO指南，診斷和風(fēng)險(xiǎn)分層主要是功能性標(biāo)志物：肌酐和胱抑素C，腎小球?yàn)V過(guò)率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）和分析尿白蛋白排泄作為腎臟損害的主要標(biāo)志物[2]，但是這些體液檢驗(yàn)通常因不夠靈敏或特異性不足，難以作出明確的診斷。目前影像學(xué)檢查在腎臟疾病的診斷中僅發(fā)揮有限的作用，主要用于診斷腎結(jié)石或大體解剖缺陷，如囊性疾病、惡性腫瘤和阻塞性腎病。重要的是，影像檢查使用的造影劑拓寬了腎臟成像診斷的范圍，同時(shí)也增加了腎毒性的可能。因此，腎臟穿刺仍是診斷腎臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種診斷操作具有侵入性，并伴有各種并發(fā)癥，出血是其最大危害[3]，因此不適合在腎臟疾病診斷及監(jiān)測(cè)預(yù)后中多次使用，故腎臟疾病的診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)迫切需要新的生物標(biāo)志物來(lái)敏感、特異地檢測(cè)腎臟損傷并實(shí)現(xiàn)靶向治療。外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析能精準(zhǔn)地鑒定出多種疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，如癌癥[4～5]、自身免疫性疾病[6]等，近年來(lái)，不少研究發(fā)現(xiàn)外泌體蛋白能較好地運(yùn)用于腎臟疾病的診療中，因此，從不同方面討論外泌體蛋白組學(xué)分析在腎臟疾病研究中的最新進(jìn)展，有望為腎臟疾病的診療提供新思路。

1?外泌體蛋白作為生物標(biāo)志物載體的優(yōu)勢(shì)

外泌體由B細(xì)胞、T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞釋放并存在于血液[7]、尿液[8]、腦脊液[9]、羊水[10]等不同體液中納米大?。?0～150納米）的外囊泡（External vesicle，EV）。在保持轉(zhuǎn)移物質(zhì)的生物活性的前提下，外泌體攜帶穩(wěn)定的組織特異性蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)移至特定的靶細(xì)胞，改變靶細(xì)胞的生化組成以及信號(hào)通路[11～13]，同時(shí)以細(xì)胞間通信的一種新形式，以及運(yùn)載工具，重新編程靶細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)其生理及病理過(guò)程[14]，因此外泌體可以代表靶細(xì)胞的現(xiàn)階段的狀態(tài)。

外泌體蛋白比傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)志物具有獨(dú)特的功能，首先，與直接在血液中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)相比，外泌體蛋白質(zhì)具有更高的敏感性，致死性全身照射小鼠的尿總蛋白質(zhì)組學(xué)與尿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)之間的比較，在尿外泌體鑒定出23種差異蛋白質(zhì)[15]。第二，外泌體蛋白高度穩(wěn)定，脂質(zhì)雙層可保護(hù)外泌體蛋白免受外部蛋白酶和其他酶的侵害，磷酸化蛋白可與冷凍5年的外泌體樣品分離[16]。第三，蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）是一種分解生命活動(dòng)的重要翻譯后修飾，替代生物的生長(zhǎng)發(fā)育，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及疾病的發(fā)生發(fā)展，可以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性，介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)外部環(huán)境刺激的響應(yīng)往往通過(guò)PTM實(shí)現(xiàn)。PTM有許多形式，而磷酸化是最受矚目的[17]。所以，使用外泌體蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物及治療的載體是理想的，這允許最低限度地采用非侵入性“液體活檢”的方法來(lái)診斷甚至監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展。

2?外泌體蛋白的質(zhì)譜分析技術(shù)

在1994年第一屆國(guó)際雙向電泳大會(huì)上，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins首次提出蛋白質(zhì)組這個(gè)概念。目前， 基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry LC-MS /MS）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要分析手段。定量分析可以是絕對(duì)的也可以是相對(duì)的，實(shí)際上，MS的許多生化應(yīng)用都依賴于相對(duì)定量，而相對(duì)定量則分為非標(biāo)記定量技術(shù)及穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量技術(shù)。2.1?非標(biāo)記定量技術(shù)?非標(biāo)記定量技術(shù)主要的方法如下：一種是基于質(zhì)譜峰的峰面積或峰強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量[18]，另外一種是基于蛋白的肽段鑒定數(shù)來(lái)進(jìn)行定量[19]。近年來(lái)，基于質(zhì)譜的非標(biāo)記定量技術(shù)隨著其數(shù)據(jù)處理軟件和程序的不斷開(kāi)發(fā)，該技術(shù)得到了較廣泛的應(yīng)用，如SAINT-MS1[20]、RIPPER[21]。非標(biāo)記定量技術(shù)少了標(biāo)記步驟，減少了標(biāo)記時(shí)導(dǎo)致的誤差，而且因?yàn)槊總€(gè)樣品是分開(kāi)進(jìn)行分析的，所以解決了分析樣品數(shù)量的煩惱，甚至可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)多組生物樣品的高通量定量分析。

2.2?穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量技術(shù)?蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)定量的經(jīng)典方法——穩(wěn)定的同位素標(biāo)記技術(shù)，是向樣品中引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記，通過(guò)比較不同同位素標(biāo)記物的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析。樣本在質(zhì)譜分析前、穩(wěn)定同位素標(biāo)記后混合，一次性實(shí)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)定量，有效消除了非標(biāo)記定量分析過(guò)程中的不穩(wěn)定性，最大程度減小了定量誤差，主要技術(shù)包括通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)中的氨基酸對(duì)同位素進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC）、酶促標(biāo)記法以及化學(xué)標(biāo)記法，化學(xué)標(biāo)記法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的方法之一，因?yàn)樗峁┝藢⑼凰貥?biāo)記選擇性地引入肽或蛋白質(zhì)所需位置的靈活性。它有一個(gè)類似于代謝標(biāo)記的原理，化學(xué)反應(yīng)是用來(lái)將這些標(biāo)記合并到它們想要的位置[22]。一般的外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析流程如圖1。

3?外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在腎臟疾病診療中的應(yīng)用

腎臟是一個(gè)復(fù)雜的器官，對(duì)體內(nèi)體液平衡起著至關(guān)重要的作用，其損傷以及改變對(duì)個(gè)人的健康產(chǎn)生巨大影響。腎臟的功能單位，即腎單位，在不同的結(jié)構(gòu)（腎小球、小管等）和高度分化的極化上皮細(xì)胞方面顯示出精細(xì)的組織結(jié)構(gòu)，所有這些細(xì)胞都具有特定的轉(zhuǎn)運(yùn)特性。因此，編碼不同蛋白質(zhì)的基因突變，如受體、通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)成分，不僅影響腎功能，而且影響腎外器官。因此，外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在腎臟的形成及相關(guān)疾病的診療是具有一定潛力的。

3.1?糖尿病腎病?糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種進(jìn)行性腎臟疾病，是糖尿病的主要并發(fā)癥，也是終末期腎臟疾病最常見(jiàn)的病因，以腎病綜合征和彌漫性腎小球硬化為特征。早期DN無(wú)明顯的癥狀。目前，在診斷有糖尿病的基礎(chǔ)上，微量白蛋白尿以及大量蛋白尿?yàn)樵u(píng)估糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)的最佳無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)，但仍有其局限性。RAIMONDO等人[24]應(yīng)用無(wú)標(biāo)記LC-MS/MS方法從2型DN動(dòng)物模型中分離出尿外泌體的差異蛋白質(zhì)組，這些蛋白質(zhì)主要是膜相關(guān)或細(xì)胞質(zhì)的，參與運(yùn)輸、信號(hào)和細(xì)胞黏附，是外泌體蛋白的經(jīng)典功能，提示外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在DN生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的潛力。ZUBIRI等人[25]發(fā)現(xiàn)DN大鼠腎組織中的調(diào)節(jié)蛋白-30明顯下調(diào)，同樣的，在其尿外泌體也有相同的變化趨勢(shì)，同時(shí)這些結(jié)果在人類樣本的初步研究中得到了進(jìn)一步證實(shí)。同樣，ZUBIRI等[26]發(fā)現(xiàn)DN患者尿外泌體中AMBP、MLL3和VDAC1呈現(xiàn)顯著的改變，表明外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)可以作為DN早期診斷和進(jìn)展監(jiān)測(cè)的新工具。

3.2?高血壓性腎病?蛋白尿是高血壓患者中心血管風(fēng)險(xiǎn)和腎臟損害的指標(biāo)，慢性腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）抑制可促進(jìn)血壓控制并防止新發(fā)性白蛋白尿的發(fā)展。然而，盡管存在慢性RAS阻滯，仍有大量患者發(fā)生蛋白尿，并且其生理病理機(jī)制尚未得到充分研究。GONZALEZ-CALERO等人[27]對(duì)目標(biāo)患者進(jìn)行了3年的隨訪，其分類為：a）持續(xù)性白蛋白尿患者;b）發(fā)生新蛋白尿的患者;c）維持蛋白尿的患者，組之間進(jìn)行外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析，總共鑒定出487種蛋白質(zhì)，其中48種蛋白質(zhì)在對(duì)高血壓和/或蛋白尿的反應(yīng)中顯示出改變的模式，通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)顯著改變的蛋白質(zhì)是免疫應(yīng)答、補(bǔ)體激活、蛋白水解和代謝過(guò)程的主要參與者，主要與硫化合物、脂質(zhì)和多糖的代謝有關(guān)。鑒定出的蛋白質(zhì)構(gòu)成藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶標(biāo)，并可能有助于確定治療策略，以避開(kāi)長(zhǎng)期治療的高血壓患者的蛋白尿進(jìn)展。

3.3?腎結(jié)石?全球范圍內(nèi)，約80%的腎結(jié)石由草酸鈣與磷酸鈣混合而成[28]，SINGHTO等[29]發(fā)現(xiàn)與CaO一水化合物（CaOx monohydrate，COM）一起孵育的巨噬細(xì)胞外泌體中，Annexin A2 等26種蛋白質(zhì)的含量發(fā)生了明顯變化，經(jīng)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析表明，這些差異的蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合、鈣結(jié)合、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)的分解。經(jīng)功能分析得知，經(jīng)COM處理的外泌體增強(qiáng)了腎小管細(xì)胞的IL-8產(chǎn)生，激活了中性粒細(xì)胞遷移，增加了外泌體膜的脆性，與COM晶體的結(jié)合能力增強(qiáng)，隨后增強(qiáng)了通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)遷移腔室的晶體入侵。這表明巨噬細(xì)胞外泌體在對(duì)COM晶體的炎癥反應(yīng)中起重要作用，并且可能參與腎間質(zhì)的晶體侵襲、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答和細(xì)胞外基質(zhì)分解。因此，這些來(lái)自COM處理的巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)的協(xié)同反應(yīng)極大可能促進(jìn)腎結(jié)石的形成。但仍需進(jìn)一步的研究，特別是在臨床上證實(shí)此假設(shè)。

3.4?心腎綜合征?慢性心力衰竭（chronic heart failure，HF）破壞正常的腎功能，并導(dǎo)致進(jìn)一步促進(jìn)HF進(jìn)展的心腎綜合征。MELENOVSKY等人[30]在慢性容量超負(fù)荷的雄性大鼠體內(nèi)使用主動(dòng)脈-腔靜脈瘺管誘發(fā)HF，發(fā)現(xiàn)HF腎臟相對(duì)于對(duì)照組，有67種蛋白質(zhì)的表達(dá)差異約1.5倍，且差異最大的是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，上調(diào)20倍，高級(jí)糖基化產(chǎn)物特異性受體、骨膜素、caveolin-1和其他與內(nèi)皮功能有關(guān)的其他蛋白質(zhì)（vWF、cavins1-3、T-kininogen2），促炎性ECM激活（MFAP4、collagen-VI、galectin-3、FHL-1、calponin）和參與腎小球?yàn)V過(guò)膜完整性的蛋白質(zhì)（CLIC5、ZO-1），這些差異蛋白質(zhì)可以與腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活協(xié)同作用，并且可以作為治療心腎綜合征的標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)。

3.5?監(jiān)測(cè)移植組織的免疫排斥反應(yīng)?腎臟移植是終末期腎臟疾病的首選和最成功的治療方法，但因?yàn)槭荏w及供體免疫表型的因素，需要檢測(cè)移植是否成活，腎穿則是監(jiān)測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但反復(fù)的侵入性操作，產(chǎn)生較多的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)和相對(duì)較高的費(fèi)用。有研究證明腎移植后T細(xì)胞參與腎臟同種異體移植的急性排斥過(guò)程[31]，PARK團(tuán)隊(duì)[32]研發(fā)了iKEA監(jiān)測(cè)平臺(tái)——整合的腎臟外泌體測(cè)定法，此平臺(tái)可檢測(cè)T細(xì)胞淋巴細(xì)胞的尿液外泌體，并成功發(fā)現(xiàn)CD3是檢測(cè)T細(xì)胞來(lái)源尿液外泌體的有效標(biāo)記。SIGDEL等[33]從移植患者中鑒定出的349種外泌體蛋白中，功能上涉及炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的11種尿液外泌體蛋白在急性排斥患者的尿液樣本中含量更高，其中3種是尿液外泌體所獨(dú)有的。尿液外泌體特異的蛋白質(zhì)改變提供了潛力，并提供了一組獨(dú)特的敏感生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)腎移植急性排斥。

3.6?海綿狀海綿腎病?海綿狀海綿腎?。╩edullary sponge kidney，MSK）是一種罕見(jiàn)且被忽視的腎臟疾病，通常與腎鈣化/腎結(jié)石病和腎盂前導(dǎo)管中的囊性異常有關(guān)，MSK的診斷準(zhǔn)確性目前較低，因?yàn)樗Q于個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，并且診斷需要有創(chuàng)放射線和/或腎毒性造影劑進(jìn)行醫(yī)學(xué)成像。BRUSCHI等人[34]從MSK患者的尿液中分離出外泌體并鑒定其中蛋白質(zhì)含量，確定了由20種高區(qū)分蛋白組成的核心小組，最有特征的是Ficolin 1、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2（MASP2）和補(bǔ)體成分4-結(jié)合蛋白β（C4BPB），這些都是凝集素補(bǔ)體途徑的主要調(diào)節(jié)成員，F(xiàn)icolin 1可以與MASP2形成復(fù)合物以激活凝集素補(bǔ)體途徑[35]，而在MSK患者中MASP2的下調(diào)伴隨著C4BPB的上調(diào)，C4BPB是一種多聚體蛋白，通過(guò)阻止經(jīng)典C3和C5轉(zhuǎn)化酶的形成來(lái)抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[36]。這可能反映了腎臟減輕凝集素補(bǔ)體途徑激活的生理嘗試。這也可以解釋FCN1和MASP2的反調(diào)控。但是，需要更多的研究來(lái)證實(shí)這種效果。所以，根據(jù)以上外泌體蛋白數(shù)據(jù)首次表明凝集素補(bǔ)體途徑可能參與了與MSK相關(guān)的復(fù)雜生物機(jī)制。

4?展望

目前，隨著疾病的多樣化，傳統(tǒng)的診療手段已滿足不了人們對(duì)疾病診療的期望，應(yīng)運(yùn)而生的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成為熱門(mén)的話題，而外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)代表細(xì)胞的特定標(biāo)記，能最大程度地反映細(xì)胞的狀態(tài)，因此成為疾病診療的標(biāo)志物的候選者，但由于目前外泌體的分離純化以及蛋白質(zhì)組學(xué)的分析技術(shù)尚未成熟，導(dǎo)致相關(guān)研究較少，所以，需要進(jìn)一步深入研究外泌體蛋白質(zhì)，尤其是腎臟疾病，甚至更多相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后等方面，從而在腎臟疾病的診治上獲得新的思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-06-22?修回日期：2020-07-23）

（編輯：梁明佩）