佟莉蓉， 王 娟， 宋 雨， 倪順剛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

達(dá)烏里胡枝子(Lespedezadaurica)為豆科胡枝子屬的多年生草本狀半灌木植物；其花序腋生，花冠蝶形，花為白色或黃白色[1]，花期為7—8月；具有耐寒冷和耐貧瘠等優(yōu)良特性[2],在我國分布廣泛；具有很高的營養(yǎng)和藥用價值以及生態(tài)效應(yīng)[3]。

花粉的質(zhì)量和生活力是影響受精成功的重要因素，花粉離體培養(yǎng)能為花粉提供與柱頭相似的萌發(fā)條件[4]?；ǚ垭x體培養(yǎng)分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)基，研究表明使用液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的效果差異不顯著，而液體培養(yǎng)基易觀察、操作簡便，相比于固體培養(yǎng)基更能反映花粉的發(fā)育狀況和實際活力[5-6]。其中花粉萌發(fā)率和花粉管長度能反映花粉生活力的高低[5]。在離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分如蔗糖、硼酸和鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及外界條件如培養(yǎng)時間和貯藏溫度等均可以影響花粉離體萌發(fā)生長，不同植物不同品種不盡相同[7-8]。

近年來，國內(nèi)外對花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究主要集中在農(nóng)業(yè)作物和經(jīng)濟作物上。通過對二倍體馬鈴薯(Solanumtuberosum)[9]、海仙花(Weigelacoraeensis)[10]、桃花(Prunuspersica)[11]和云南油杉(Keteleeriaevelyniana)[12]的花粉進(jìn)行離體萌發(fā)培養(yǎng)，確定了最適培養(yǎng)基的組分以及培養(yǎng)時間。目前對胡枝子屬的研究主要集中在開花習(xí)性、種子發(fā)芽特性、遺傳多樣性、藥用成分等方面[13]，有關(guān)達(dá)烏里胡枝子花粉離體萌發(fā)條件的研究普遍較少。本試驗對影響達(dá)烏里胡枝子花粉生活力的因素進(jìn)行測定，篩選出達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)的培養(yǎng)配方及最適培養(yǎng)條件，以期為其雜交育種和種質(zhì)資源保存提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗材料

試驗所用‘晉農(nóng)一號’達(dá)烏里胡枝子(Lespedezadaurica‘Jinnong No.1’，縮寫為LD)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院自主選育品種，花粉于2019年8月采自草業(yè)學(xué)院試驗田(112°34′ E，37°21′ N，海拔800 m)。

1.2 試驗方法

1.2.1花粉采集與離體培養(yǎng) 選取生長健壯，長勢良好的植株，于盛花期(8—9月)選取含苞待放的花朵帶回實驗室，用解剖針和鑷子將花粉抖落到硫酸紙上包好放入硅膠中陰干備用。本試驗所有處理所用花粉均現(xiàn)采現(xiàn)用。

參考鄧衍明等[14]的方法對達(dá)烏里胡枝子的花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)。待花粉散粉后，在單凹載玻片凹槽上方用尖頭鑷子和解剖針反復(fù)刮取花絲上的花粉，確?；ńz上的花粉全部落入凹槽內(nèi)，取適量液體培養(yǎng)基質(zhì)，在凹槽部位滴2滴，將載玻片置于底部墊有2層浸透水的濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋子后置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度25℃±1℃，相對濕度60%)內(nèi)培養(yǎng)[6]。

1.2.2培養(yǎng)條件篩選 進(jìn)行單因素試驗，設(shè)置蔗糖濃度5個處理(0，50，100，150，200 g·L-1)，硼酸濃度5個處理(0，20，40，80，120 mg·L-1)，氯化鈣濃度5個處理(0，10，30，50，80 mg·L-1)，其中蒸餾水作對照，記為0(CK)。每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)時間為4 h和6 h。分別將上述不同濃度的蔗糖、硼酸和氯化鈣溶液添加到液體培養(yǎng)基中，找出花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適濃度和最佳培養(yǎng)時間。

在單因素的基礎(chǔ)上分別選取對達(dá)烏里胡枝子影響較大的蔗糖、硼酸和氯化鈣各2個濃度水平采用3因素2水平試驗，確定適宜達(dá)烏里胡枝子的最佳處理組合，每個處理重復(fù)3次。

在最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別在光照培養(yǎng)箱和冰箱中進(jìn)行不同培養(yǎng)溫度20℃，25℃，30℃，35℃和40℃)和不同貯藏溫度(-20℃，4℃)試驗，在之前篩選的條件下進(jìn)行不同采樣時間(8：00，12：00，18：00)以及光照(40 μmol·(m2·s)-1)和黑暗(0 μmol·(m2·s)-1)兩種光照環(huán)境的篩選，每個處理設(shè)3次重復(fù)，最終確定花粉培養(yǎng)的最適溫度、采樣時間和光照條件。

1.2.3花粉萌發(fā)測定 每個玻片隨機選取5個不重復(fù)的視野，每個視野花粉數(shù)量不少于50粒，每片隨機測量20個花粉管，以視野內(nèi)花粉管長度大于花粉直徑為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[15]。用顯微測微尺測量花粉管長度，統(tǒng)計和計算平均萌發(fā)率和花粉管長度。

花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并運用Duncan法對各個處理之間的指標(biāo)進(jìn)行差異性顯著分析，運用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 培養(yǎng)基組分對達(dá)烏里胡枝子花粉離體萌發(fā)的影響

2.1.1蔗糖濃度對花粉離體培養(yǎng)的影響 各濃度培養(yǎng)4 h的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均低于培養(yǎng)6 h，且花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的升高呈先升后降的趨勢(圖1)。培養(yǎng)6 h后，各處理組的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均高于CK，濃度為15 g·L-1時花粉萌發(fā)率和花粉管長度均高于其他處理組；10 g·L-1和20 g·L-1處理的花粉萌發(fā)率無顯著差異，其中20 g·L-1處理的花粉管長度高于10 g·L-1；5 g·L-1處理的萌發(fā)率和花粉管長度略高于CK，可以看出過高或過低的蔗糖濃度都不利于花粉萌發(fā)，但花粉管長度在濃度為0～15 g·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢。由此可知，培養(yǎng)基中添加濃度15 g·L-1和20 g·L-1的蔗糖，能有效提高花粉萌發(fā)率和花粉管長度，達(dá)烏里胡枝子花粉最適培養(yǎng)時間為6 h，最適蔗糖濃度為15 g·L-1或20 g·L-1。

圖1 蔗糖對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Fig.1 Effects of sucrose on Pollen Germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters show significant differences at the 0.05 level. The same as below

2.1.2硼酸濃度對花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響 花粉萌發(fā)率和花粉管長度隨著硼酸濃度的升高呈先升后降的趨勢，且培養(yǎng)6 h后的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均高于培養(yǎng)4 h(圖2)。培養(yǎng)6 h后，CK的花粉萌發(fā)率和花粉管長度最低，隨著濃度的增加，20 mg·L-1和40 mg·L-1處理的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均無顯著差異，且20 mg·L-1處理的花粉萌發(fā)率高于其他處理組，40 mg·L-1處理的花粉管長度和其他處理組相比最長；濃度為80 mg·L-1和120 mg·L-1處理的花粉萌發(fā)率與CK相比均無顯著差異，且組間無顯著差異，但其花粉管長度均高于CK。綜上，花粉的最適培養(yǎng)時間為6 h，硼酸最適濃度為20 mg·L-1或40 mg·L-1。

2.1.3氯化鈣濃度對花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響 花粉萌發(fā)率隨著氯化鈣濃度的升高呈先升后降的趨勢，且培養(yǎng)6 h后的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均高于培養(yǎng)4 h(圖3)。培養(yǎng)6 h時，在氯化鈣濃度為0～50 mg·L-1的范圍內(nèi)，花粉萌發(fā)率隨著濃度的增加而增加。氯化鈣濃度為50 mg·L-1時花粉萌發(fā)率顯著高于CK和除80 mg·L-1處理外的其他處理組(P<0.05)，達(dá)到68%；80 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率有所降低，但高于10 mg·L-1和30 mg·L-1處理組?；ǚ酃荛L度隨著濃度的增加呈現(xiàn)出不規(guī)則變化，其中氯化鈣濃度為10 mg·L-1，50 mg·L-1和80 mg·L-1的花粉管長度均高于30 mg·L-1和CK處理組，且3個處理組間無顯著差異，其中50 mg·L-1處理的花粉管最長，為187.04 μm。綜上，適宜用于測定達(dá)烏里胡枝子花粉活力的氯化鈣濃度為50 mg·L-1和80 mg·L-1。

圖3 氯化鈣對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Fig.3 Effects of CaCl2 on Pollen Germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica

2.1.4最佳培養(yǎng)基選擇 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將蔗糖、硼酸和氯化鈣設(shè)為3個因素，將每個因素篩選出的2個濃度設(shè)為水平，采用3因素2水平試驗(表1)，尋找最佳培養(yǎng)基配方。

表1 試驗因素及濃度水平Table 1 Test factors and concentration levels

8個處理組間的花粉萌發(fā)率和花粉管長度有明顯的差異(圖4)。其中，組合7的花粉萌發(fā)率最低，組合2，3和5的萌發(fā)率次之，且2，3和5處理組組間差異不顯著；組合1，4和6的萌發(fā)率較高，且組間差異不顯著；組合8的花粉萌發(fā)率和花粉管長度均顯著高于其他處理組(P<0.05)，且花粉長勢良好，萌發(fā)率為69%，花粉管長度為263.88 μm；組合3和6的花粉管長度顯著低于其他處理組(P<0.05)，其中與組合5的差異不顯著；組合1，2，5的花粉管長度組間差異不顯著，且低于組合4和7，其中組合4花粉管長度略低于組合8，為213.11 μm?；趯_(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響，最優(yōu)組合培養(yǎng)基為組合8，故后續(xù)試驗的培養(yǎng)基配方均以組合8的配方進(jìn)行開展。

圖4 不同培養(yǎng)基處理組對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Fig.4 Effects of different media treatments on pollen germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica by different media treatment

圖5 達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)及花粉管生長的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of pollen germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica注：a,蒸餾水中培養(yǎng)6小時；b,培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時；c,花粉萌發(fā)初始階段；d-e,花粉管伸長，內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)入花粉管；f,花粉3個萌發(fā)溝最終只有一條花粉管伸長；g-i,花粉管異常，出現(xiàn)扭曲、內(nèi)含物散出、花粉管分支和纏繞成束Note:a,Culture in distilled water for 6 hours;b,Culture in medium for 6 hours;c,Initial stage of pollen germination;d-e,Pollen tube elongation,and the contents enter into the pollen tube;f,Only one pollen tube is elongated in the three pollen germination grooves;g-i,Abnormal pollen tube,distortion,content dispersion,pollen tube branching and twining into bundles

在顯微鏡中觀察到，達(dá)烏里胡枝子花粉為圓球形，直徑大約為50～70 μm(圖5a)，通常一?；ǚ壑挥幸粭l花粉管(圖5b)，萌發(fā)初期3個萌發(fā)孔均能萌發(fā)(5c)，但最終只有一個萌發(fā)孔的花粉管伸長(圖5f)。萌發(fā)初期，萌發(fā)溝處有透明的突起物(圖5c),隨著花粉管的伸長生長，花粉管中散布著內(nèi)含物(圖5-d-e)，最終全部集中在花粉管的頂端。在花粉管的生長過程中，花粉管會出現(xiàn)解體，內(nèi)含物散出、花粉管扭曲、花粉管有多個分支和眾多花粉管纏繞成束的現(xiàn)象(圖5 g-i)。

2.2 培養(yǎng)條件對達(dá)烏里胡枝子萌發(fā)生長的影響

不同采樣時間和光照條件對花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響也不同(圖6)。在相同培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)對花粉萌發(fā)率的影響在各個時間段均高于光照培養(yǎng)，其中，以中午12點的花粉萌發(fā)效果最佳，其次為早上8點；下午18點的花粉萌發(fā)率與早上8點和中午12點相比顯著下降(P<0.05)，且出現(xiàn)花粉內(nèi)含物滲出的現(xiàn)象。在暗培養(yǎng)的條件下，中午12點的花粉管長度最長，為223 μm，早上8點的花粉管長度最短，故選擇中午12點作為達(dá)烏里胡枝子花粉的最佳取樣時間。

圖6 培養(yǎng)條件對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響Fig.6 Effects of culture conditions on Pollen Germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica

2.3 不同培養(yǎng)溫度及貯藏條件對達(dá)烏里胡枝子萌發(fā)生長的影響

不同培養(yǎng)溫度顯著影響達(dá)烏里胡枝子花粉的萌發(fā)生長(P<0.05)?？傮w來看，溫度在20℃～40℃的范圍內(nèi)時，花粉萌發(fā)率和花粉管長度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降的趨勢(圖7)。在20℃～25℃內(nèi)，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均隨著溫度的升高而升高，萌發(fā)率在25℃時達(dá)到最高;在25℃～40℃之間，隨著溫度的升高花粉萌發(fā)率和花粉管長度呈下降趨勢，40℃時花粉萌發(fā)率和花粉管長度均最低。貯藏溫度為4℃的花粉萌發(fā)率顯著高于—20℃(P<0.05)，但花粉管長度卻顯著低于—20℃(P<0.05)。由此可知，達(dá)烏里胡枝子花粉的最佳貯藏溫度為—20℃，最佳培養(yǎng)溫度為25℃。

圖7 培養(yǎng)溫度及貯藏條件對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響Fig.7 Effects of culture temperature and storage conditions on Pollen Germination and pollen tube growth of Lespedeza davurica注：-20℃和4℃為貯藏溫度；20℃～40℃為培養(yǎng)溫度試驗Note:-20℃ and 4℃ is the storage temperature;20℃～ 40℃ is the culture temperature test

3 討論

花粉離體萌發(fā)法具有結(jié)果準(zhǔn)確、簡單易行的優(yōu)點。除了受自身條件限制外，花粉的萌發(fā)在很大程度上受其培養(yǎng)基成分、溫度和光照條件等的影響，只有在適宜的外界條件下，成熟的花粉才能正常的萌發(fā)及生長。

蔗糖能通過調(diào)節(jié)花粉滲透壓從而促進(jìn)其萌發(fā)和生長，但過高的濃度會使花粉管滲透壓不平衡導(dǎo)致破裂，影響萌發(fā)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度對花粉萌發(fā)的影響具有顯著性[17]?；ǚ勖劝l(fā)對蔗糖濃度的需求根據(jù)不同的植物而有所差異，一般以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～25%居多[18-19]，低濃度的如二喬玉蘭(Magnoliasoulangeana)為5%[20]，而貫月忍冬(Lonicerasempervirens)花粉在蔗糖溶液濃度為30%時萌發(fā)率最高[21]。尉倩等[22]研究表明蔗糖濃度過高會導(dǎo)致滲透勢下降，花粉因失水過多而萌發(fā)率下降，這與本試驗的研究結(jié)果相似。本試驗中蔗糖濃度過高或偏低都會使達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)率降低，花粉的萌發(fā)率和花粉管長度均隨蔗糖濃度的增加呈先升后降的趨勢，其中15 g·L-1為峰值，說明在10～15 g·L-1的范圍內(nèi)蔗糖能為花粉萌發(fā)生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)；當(dāng)蔗糖濃度為20 g·L-1時，花粉萌發(fā)率出現(xiàn)下降趨勢，但其花粉管長度無顯著降低，可能是因為花粉粒個體間原生質(zhì)不同組分的含量存在差異，導(dǎo)致部分花粉在較高的滲透壓環(huán)境中仍然能萌發(fā)和生長，從而出現(xiàn)抑制花粉管生長的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相應(yīng)升高的現(xiàn)象[23]。

硼作為植物有性生殖過程不可缺少的微量元素，在花粉萌發(fā)生長等方面都發(fā)揮著重要的作用[18]，花粉缺硼可導(dǎo)致花粉管破裂[24]。在自然生長條件下，花粉中的硼是不足以維持自身萌發(fā)生長的，但柱頭和花柱中的硼可以補償這種不足，確?；ǚ劭梢栽谥^上正常生長[25]。吳斌[17]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的硼酸能促進(jìn)小黃金西番蓮(Passifloraedulis)花粉萌發(fā)，當(dāng)硼酸濃度過高時通過影響花粉萌發(fā)進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量下降，所以適量濃度的硼酸有助于花粉萌發(fā)和花粉管生長。本研究發(fā)現(xiàn)，硼酸濃度為20～40 mg·L-1時，會促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長，當(dāng)濃度為80～120 mg·L-1時，花粉的萌發(fā)生長則會受到抑制，這與前人[10]的研究結(jié)果相似。但本研究中花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的最適硼酸濃度分別是20 mg·L-1和40 mg·L-1，造成濃度不同的原因可能是花粉自身的硼酸可以滿足萌發(fā)的需求，但不足以維持花粉管的伸長，而硼是構(gòu)建花粉管頂端細(xì)胞壁不可缺少的物質(zhì)，故花粉管生長相對于花粉萌發(fā)所需的外源硼量較多。因本試驗設(shè)置的硼酸濃度范圍較窄，故抑制達(dá)烏里胡枝子花粉管生長的濃度尚待進(jìn)一步探究。

Ca2+對促進(jìn)花粉萌發(fā)生長具有重要作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入Ca2+通道阻塞劑會干擾花粉萌發(fā)[27]；外源Ca2+與花粉細(xì)胞內(nèi)游離鈣存在互補關(guān)系，當(dāng)自身游離鈣缺乏，適量的外源Ca2+能有效促進(jìn)花粉萌發(fā)生長，但外源Ca2+濃度過高時會導(dǎo)致細(xì)胞膨壓抑制花粉萌發(fā)生長[28]。蘆娟[16]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度為40 mg·L-1時能顯著提高油橄欖(Oleaeuropaea)的萌發(fā)率，當(dāng)Ca2+濃度為120 mg·L-1時，其花粉萌發(fā)率顯著降低，且低于對照，這與本試驗研究結(jié)果相一致。本研究中Ca2+濃度為0～30 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率無顯著變化；當(dāng)Ca2+濃度為50 mg·L-1時，其花粉萌發(fā)率處于峰值；當(dāng)Ca2+濃度為80 mg·L-1時其花粉萌發(fā)率呈下降趨勢，說明Ca2+濃度過高或過低均會抑制花粉萌發(fā)。但花粉管長度在Ca2+濃度處于10，50和80 mg·L-1時均顯著升高，而50 mg·L-1時處于最高，可能是花粉細(xì)胞內(nèi)個體間Ca2+含量存在差異，因此對不同濃度的Ca2+濃度的需求不同，進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)多個花粉管長度峰值。本試驗研究結(jié)果表明達(dá)烏里胡枝子花粉細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量不均等，故自然條件下，花粉管長度與外源鈣的關(guān)系有待于后期進(jìn)行深入研究。

硼酸與蔗糖之間存在交互作用。H3BO3能與蔗糖形成絡(luò)合物，促進(jìn)花粉對糖類的吸收、轉(zhuǎn)運和代謝[29-30]；硼離子可以通過影響質(zhì)外體和鈣離子的結(jié)合，增加胞內(nèi)游離鈣離子至花粉萌發(fā)最適濃度[31]。通過對郁香忍冬(Lonicerafragrantissima)花粉進(jìn)行離體萌發(fā)研究，發(fā)現(xiàn)單一蔗糖溶液濃度為35%時萌發(fā)率最高，而對蔗糖和硼酸進(jìn)行多因素試驗時，30%蔗糖的萌發(fā)率達(dá)到最高[22]。本試驗中，單因素蔗糖濃度為15 g·L-1花粉萌發(fā)率最高，而在多因素試驗中，組合8的蔗糖20 g·L-1+硼酸40 mg·L-1+氯化鈣80 mg·L-1的處理能顯著促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長，加入硼酸后，需要的蔗糖濃度也相應(yīng)增加，可能是因為花粉萌發(fā)初期所需蔗糖和硼量較少，硼作為花粉管頂端構(gòu)建不可缺少的元素，因此在花粉管伸長生長的過程中需要的蔗糖和硼酸量較多[10]。因本實驗設(shè)置的濃度較少，花粉萌發(fā)率下降趨勢未體現(xiàn)，故后續(xù)應(yīng)對組合中各組分配比進(jìn)一步探究。

不同植物花粉離體培養(yǎng)最適采樣時間以及培養(yǎng)條件均會有所不同。鄧衍明等[14]通過對茉莉(Jasminumsambac)花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，早上花粉活力顯著高于中午和晚上的活力；呂晉慧等[32]研究發(fā)現(xiàn)地被菊(groundcoverchrysanthemum)的花粉活力在中午13：00的時候最高，與本試驗研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，8：00～12：00的花粉萌發(fā)率顯著高于18：00，且中午得萌發(fā)率最高，故中午花粉活力最好，花粉管長度也以中午12：00所取的花粉最長，可能是因為不同的時間段所處的外界環(huán)境中的溫度、濕度對花粉活力的影響較大[14]。李佛蓮等[33]研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件下山玉蘭(Magnoliadelavayi)花粉萌發(fā)率高于光照條件，這與本試驗的研究結(jié)果相一致，本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)烏里胡枝子花粉更適宜在黑暗條件下萌發(fā)，光照條件下更適宜花粉管生長。

溫度是影響花粉萌發(fā)的重要因素。適宜的溫度能促進(jìn)花粉萌發(fā)，溫度過高或過低均會抑制其萌發(fā)生長[34]，且植物不同，花粉萌發(fā)所需的最適溫度也不同。研究發(fā)現(xiàn)對于溫帶植物來說25℃～30℃為適宜溫度，低于25℃或高于35℃其萌發(fā)則會受到抑制[14]；還有研究發(fā)現(xiàn)地梢瓜(Cynanchumthesioides)[35]最適萌發(fā)溫度為30℃，而地被菊花粉的最適萌發(fā)溫度為10℃或15℃[32]；楊瀾等[36]通過對多肉植物紅司(Echeverianodulosa)花粉離體萌發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，溫度與花粉萌發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，這與本試驗研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)溫度在25℃～40℃范圍內(nèi)時，花粉萌發(fā)率和溫度呈負(fù)相關(guān)，且25℃時花粉萌發(fā)率最高，說明達(dá)烏里胡枝子花粉對高溫具有一定的耐受性。

合適的貯藏條件對花粉活力的保持至關(guān)重要。一般花粉貯藏溫度有常溫、4℃，—20℃，—70℃，—80℃和—196℃[37]。實際生產(chǎn)中常溫、4℃和—20℃由于所需條件簡單故經(jīng)常用到。朱雪晨[38]研究發(fā)現(xiàn)—20℃和—70℃均為薄殼山核桃(Caryaillinoinensis)的適宜貯藏溫度，這與本試驗研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，—20℃花粉萌發(fā)率顯著低于4℃，但—20℃下花粉管長度顯著高于其他處理組，可能是因為低溫導(dǎo)致花粉酶活性減弱，生活力下降，花粉萌發(fā)率降低，而花粉管生長主要受硼的影響，可能低溫未對其伸長生長造成影響。關(guān)于低溫貯藏環(huán)境和貯藏時間對達(dá)烏里胡枝子花粉萌發(fā)和花粉管生長和各生理機制的影響，有待于后續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

本研究綜合單因素和多因素試驗結(jié)果分析和比較，得出‘晉農(nóng)一號’達(dá)烏里胡枝子花粉離體萌發(fā)的最適液體培養(yǎng)基配方為20 g·L-1蔗糖+40 mg·L-1硼酸+ 80 mg·L-1氯化鈣，最適采樣時間為中午12：00，最適培養(yǎng)條件為黑暗條件下25℃，最適貯藏溫度為—20℃，最佳鏡檢時間為6 h。