梁薇薇,陳立新,段文標(biāo),李亦菲,李少然,于穎穎

東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱 150040

在森林生態(tài)系統(tǒng)中,酚酸類物質(zhì)可作為植物參與競爭的直接或間接手段[1],為其提供競爭優(yōu)勢。酚酸類物質(zhì)是目前公認(rèn)的化感物質(zhì)[2-3],可由植物揮發(fā)、淋溶、滲出和殘渣的分解釋放到環(huán)境中[4],通過許多潛在機制,如對植物根系的導(dǎo)水性和養(yǎng)分吸收的影響,導(dǎo)致礦物成分的變化[5],從而抑制植物生長,或者通過對植物光合作用、可溶性物質(zhì)和抗氧化酶產(chǎn)生影響而導(dǎo)致植物生長受到抑制[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8-9],松樹林內(nèi)凋落物浸提液對松樹種子萌發(fā)及幼苗生長有不同程度影響,其受凋落物浸提液濃度影響顯著。

紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)廣泛分布于亞洲東部,是我國東北地區(qū)典型地帶性頂極植被類型(針闊混交林)主要優(yōu)勢種和建群種。通過在涼水國家級自然保護(hù)區(qū)闊葉紅松林內(nèi)調(diào)查、觀測及前期研究中發(fā)現(xiàn),紅松生長和更新受到不同程度地抑制。前期試驗通過高效液相色譜法(HPLC)在闊葉紅松林凋落物(椴樹、紅松、楓樺)及土壤中鑒定出13種酚酸類物質(zhì),其中苯甲酸、丁香酸、香草酸含量較高,因此,本試驗假設(shè)這3種酚酸物質(zhì)可作為化感物質(zhì)影響紅松生長更新。為驗證所提假設(shè),本試驗通過室內(nèi)模擬試驗進(jìn)行紅松種子萌發(fā)和苗木盆栽試驗,分析不同濃度3種酚酸溶液對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)及紅松苗生長指標(biāo)和生理特性的影響,為探索闊葉紅松林內(nèi)化感作用機理及解決紅松更新障礙問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4月4日,于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場取回低溫窖藏并催芽的紅松種子及3年生紅松苗。其中,紅松種子千粒重700 g,紅松苗株高(22.0±3.8)cm,地徑(5.1±0.8)mm。苯甲酸(BA：benzoic acid)、丁香酸(SA：syringic acid)和香草酸(VA：vanillic acid)購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 種子發(fā)芽試驗

紅松種子在蒸餾水中浸泡催芽6 h后,用10%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒10 min,用無菌蒸餾水漂洗數(shù)次,然后用無菌去離子水沖洗3次后陰干。培養(yǎng)皿(直徑9 cm)及紗布于高壓滅菌鍋中高溫高壓滅菌20 min,將兩層滅菌紗布鋪在潔凈培養(yǎng)皿內(nèi),每培養(yǎng)皿中放入均勻飽滿受體紅松種子15粒。設(shè)苯甲酸、丁香酸、香草酸各3個濃度處理組(2、20、200 mg/L),試驗中所設(shè)3個濃度處理均以前期試驗測定凋落物及土壤中實際酚酸物質(zhì)濃度為參考選取,以蒸餾水為對照(CK),每組重復(fù)3次,每培養(yǎng)皿內(nèi)分別注入溶液15 mL(處理液添加量基于種子周圍沒有水膜)。培養(yǎng)皿用滅菌紗布覆蓋,在(25±0.5)℃ 恒溫箱(1/1000過氧乙酸消毒)中培養(yǎng),每天滴入2 mL相應(yīng)溶液對紗布進(jìn)行濕潤以保持其濕度。種子置床后第一粒種子萌發(fā)時間作為種子發(fā)芽起始時間,種子萌發(fā)標(biāo)志以胚根突破種皮1 mm為標(biāo)準(zhǔn),于每天中午記錄發(fā)芽數(shù),連續(xù)3 d沒有種子萌發(fā)為止,計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)。將發(fā)芽種子每天補充2 ml處理液,直至種子脫殼,利用毫米刻度尺測量種子胚軸長、胚根長。

1.3 苗木生長試驗

蛭石與珍珠巖(高溫高壓滅菌20 min)1:1混合裝入200 × 250 mm塑料盆中(至盆高3/4處),將3年生紅松苗移栽到盆中緩苗15 d。試驗前,記錄每株紅松苗株高及地徑(距地面1 cm處)位置,盆栽試驗于實驗室(平均溫度25 ℃,平均日長12 h)自然光下進(jìn)行,用2、20、200 mg/L苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液進(jìn)行澆灌,對照(CK)澆灌等量蒸餾水,每處理重復(fù)5盆,每10 d澆灌250 mL相應(yīng)溶液及5 mL Hoagland營養(yǎng)液,并將托盤中流出液倒回盆內(nèi),以確保各處理組土壤中酚酸含量與試驗設(shè)計一致。在紅松苗生長期間,根據(jù)基質(zhì)濕度補充蒸餾水以防止水分脅迫,直到試驗結(jié)束。2018年10月15日結(jié)束試驗,將紅松苗整株收獲,進(jìn)行生長指標(biāo)(株高、地徑、生物量)、光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)、抗氧化酶活性(過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD)、膜脂過氧化指標(biāo)(丙二醛MDA)及可溶性滲透物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白)含量測定。

1.4 測定方法

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)按以下公式計算：發(fā)芽勢(%)=前4 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[10]；發(fā)芽率(%)=試驗期間種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[11]；發(fā)芽指數(shù)= ∑Gt/Tt[12],式中,Gt為第t天發(fā)芽種子數(shù),Tt為發(fā)芽天數(shù)。光合色素含量采用分光光度法測定[13]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定,過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[14]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[15]；可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮顯色法測定[16]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[17]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 19. 0對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)、紅松苗生長指標(biāo)及生理特性指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及多重比較(Duncan’s test),用Sigmaplot 12.5進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度苯甲酸、丁香酸和香草酸溶液對紅松種子萌發(fā)的影響

不同濃度3種酚酸溶液均抑制紅松種子萌發(fā),其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均顯著低于CK(P<0.05)。酚酸溶液濃度變化對紅松種子發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)影響差異均不顯著,對發(fā)芽率影響差異顯著(P<0.05),其中,20 mg/L BA、VA溶液和200 mg/L SA溶液對紅松種子發(fā)芽抑制效果強于其他濃度處理組,發(fā)芽率僅為64.45%、57.78%和53.33%(表1)。

不同濃度3種酚酸對紅松種子胚軸長及胚根長影響差異不顯著。紅松種子胚根受3種酚酸溶液影響強于胚軸,其中,BA濃度2 mg/L、20 mg/L時促進(jìn)胚根生長,200 mg/L時抑制胚根生長,不同濃度SA溶液均促進(jìn)胚根生長,而VA溶液對胚根影響表現(xiàn)為低濃度抑制,高濃度促進(jìn)(圖1)。

表1 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

圖1 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松種子胚軸長、胚根長的影響Fig.1 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on hypocotyl length and radicle length of Pinus koraiensis seeds不同小寫字母表示同種酚酸不同濃度間差異顯著(P < 0.05)；CK：對照組 control；BA：苯甲酸 benzoic acid；SA：丁香酸 syringic acid；VA：香草酸 vanillic acid

2.2 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗生長指標(biāo)的影響

各處理組株高、地徑、生物量增加量均低于CK,表明不同濃度BA、SA和VA溶液對紅松苗生長(株高、地徑)及物質(zhì)積累(生物量)具有抑制作用。酚酸濃度變化對紅松苗株高和地徑影響差異均不顯著,但對生物量、根干重和莖干重影響差異均顯著(P<0.05)。其中,VA溶液對紅松苗株高抑制作用強于其他處理組,SA溶液對地徑抑制作用強于其他處理組。200 mg/L BA溶液對紅松苗生物量增加抑制作用強于其他處理組。20 mg/L BA溶液抑制紅松苗地上部分生長,而促進(jìn)地下部分物質(zhì)積累。BA溶液各處理組根莖比均高于CK。2 mg/L、20 mg/L SA溶液和VA溶液處理組根莖比低于CK,200 mg/L處理組高于對照(表2)。

2.3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉光合色素含量的影響

BA、SA和VA溶液處理紅松苗對其針葉葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素均有一定影響。其中,不同濃度BA溶液處理紅松苗后,針葉葉綠素a含量均低于CK,且含量差異顯著(P<0.05)。SA溶液對針葉葉綠素a含量影響為中、低濃度抑制,高濃度促進(jìn),而VA溶液作用與之相反。不同濃度BA溶液處理紅松苗后,其針葉葉綠素b含量均低于CK且含量差異不顯著。20 mg/L SA溶液抑制針葉葉綠素b產(chǎn)生,其他濃度處理組針葉葉綠素b含量與CK差異均不顯著；中濃度 VA溶液對針葉葉綠素b抑制作用強于其他濃度。不同濃度BA溶液處理組針葉類胡蘿卜素含量均低于CK,且濃度變化對其含量影響差異顯著(P<0.05)。SA溶液對針葉類胡蘿卜素含量影響為中、低濃度抑制,高濃度促進(jìn),而VA溶液為中、低濃度促進(jìn),而高濃度抑制。20 mg/L SA溶液對葉綠素a、葉綠素b影響強于其他處理組,其含量僅為CK的56.47%、62.07%。20 mg/L BA、SA和VA均對類胡蘿卜素影響強于其他處理組,其含量分別為CK的57.14%、61.90%、57.14%(表3)。

表3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗光合色素的影響

2.4 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉抗氧化酶系統(tǒng)及膜脂過氧化的影響

不同濃度BA和VA溶液對紅松苗針葉POD活性影響顯著(P<0.05),不同濃度SA溶液對POD活性影響不顯著。BA溶液隨濃度升高對POD活性抑制作用減弱,而SA溶液隨濃度升高對POD活性抑制作用增強。不同濃度3種酚酸溶液對CAT活性影響整體與對POD活性影響一致。3種酚酸溶液對SOD活性影響除200 mg/L BA溶液抑制其活性外,其余各處理組均增加SOD活性,其中BA各濃度處理組針葉SOD 活性顯著高于CK,2 mg/L BA溶液對SOD活性促進(jìn)作用強于其余處理組,且高于CK組SOD活性13.6%(圖2)。

圖2 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the antioxidant enzyme activity of Pinus koraiensis seedlings不同小寫字母表示同種酚酸不同濃度間差異顯著(P < 0.05)；下同；POD：過氧化物酶 peroxidase；CAT：過氧化氫酶 catalase；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase

圖3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗MDA含量的影響 Fig.3 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the MDA content of Pinus koraiensis seedlingsMDA：丙二醛 malondialdehyde

不同濃度BA、SA和VA溶液均顯著增加紅松苗針葉MDA 含量,MDA含量隨BA溶液濃度增加表現(xiàn)為先增加后降低,20 mg/L BA溶液對針葉MDA合成的促進(jìn)作用強于2 mg/L和200 mg/L。MDA含量隨SA和VA溶液濃度增加而增加,200 mg/L SA對MDA合成的促進(jìn)作用高于其他處理組,且高于CK組MDA含量70.51%(圖3)。

2.5 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

不同濃度VA溶液、SA和VA混合溶液對紅松苗針葉可溶性糖及可溶性蛋白含量影響顯著(圖4)。針葉可溶性糖含量隨BA溶液濃度升高而逐漸增加,而可溶性蛋白含量為CK>200 mg/L>2 mg/L>20 mg/L。SA溶液處理紅松苗后,針葉可溶性糖含量為20 mg/L>2 mg/L>CK>200 mg/L,可溶性蛋白含量均高于CK。VA處理紅松苗后,針葉可溶性糖含量為20 mg/L>CK>2 mg/L>200 mg/L,可溶性蛋白含量為CK>2 mg/L>200 mg/L>20 mg/L。其中,200 mg/L BA對針葉可溶性糖含量產(chǎn)生的促進(jìn)作用顯著強于其他處理組,而200 mg/L VA溶液對針葉可溶性糖含量產(chǎn)生的抑制作用明顯強于其他處理組。

3 結(jié)論與討論

3.1 酚酸物質(zhì)影響種子萌發(fā)

酚酸類物質(zhì)對種子萌發(fā)的影響是通過復(fù)雜的生化過程介導(dǎo)實現(xiàn)的。已有大量研究表明,酚酸抑制種子發(fā)芽[18-21]。本實驗結(jié)果與前人研究一致,BA、SA、VA溶液均對種子萌發(fā)存在抑制作用,且對種子萌發(fā)的抑制作用強于對胚軸及胚根長的影響。向日葵(HelianthusannuusL.)葉片水提物通過抑制白芥(SinapisalbaL.)種子內(nèi)肽鏈內(nèi)切酶和異檸檬酸裂解酶活性,干擾種子內(nèi)部儲存蛋白質(zhì)和脂肪酸降解,進(jìn)而阻礙種子對O2的吸收,抑制ATP產(chǎn)生,從而干擾種子能量代謝,最終抑制種子萌發(fā)[22]。激素在種子萌發(fā)中發(fā)揮重要作用,不同激素協(xié)同或拮抗調(diào)控著植物生長發(fā)育[23-25]。Shu等[26]和Holdsworth等[27]研究表明,赤霉素促進(jìn)種子萌發(fā),而脫落酸抑制種子萌發(fā)。Muscolo等[28]研究了不同森林土壤中提取的低分子酚類物質(zhì)對落葉松(Pinuslaricio, Poiret, spp calabrica)種子萌發(fā)及其萌發(fā)過程中呼吸酶和磷酸戊糖氧化途徑酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)所有酚酸對落葉松萌發(fā)均有抑制作用,且種子萌發(fā)受抑制與糖酵解酶和氧化磷酸戊糖途徑酶的活性密切相關(guān)。由此可見,BA、SA、VA溶液對紅松種子萌發(fā)的影響可以通過抑制胚胎生長、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾種子中活性氧的產(chǎn)生和積累、影響種子萌發(fā)過程中酶活性和代謝途徑、打破種子內(nèi)源激素平衡等多種途徑來實現(xiàn)。

圖4 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗可溶性物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the soluble matter content of Pinus koraiensis seedlings

3.2 酚酸物質(zhì)影響幼苗生長及生理特性

已知化感物質(zhì)通過改變植物代謝過程而導(dǎo)致植物生長減緩[29-30]。其中,酚酸類物質(zhì)可影響植物體內(nèi)吲哚乙酸(IAA)濃度,調(diào)節(jié)參與IAA合成或分解的酶的活性,IAA通過改變細(xì)胞壁伸展性和通透性引起細(xì)胞分裂,因此,酚酸類物質(zhì)可以在完整植株莖伸長、細(xì)胞分裂及分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用,引起植物生物量積累的變化[16]。Bi等[31]研究9種酚類化合物對西洋參(PanaxquinquefoliusL.)幼苗根莖生長的抑制作用,其中水楊酸、肉桂酸、香豆酸、香草酸、丁香酸均能顯著抑制其幼苗根莖生長。本試驗中,不同濃度3種酚酸均可導(dǎo)致紅松苗生物量積累減少,其中,SA、VA溶液對紅松苗株高及地徑的抑制強于BA,BA溶液對地下部分物質(zhì)積累的抑制作用弱于其他處理組。同時,不同濃度酚酸溶液處理紅松苗使針葉葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量出現(xiàn)不同程度減少。葉片光合色素在植物光合作用中發(fā)揮極為重要的作用,其含量降低將導(dǎo)致光能吸收及傳遞受阻,最終引起光合速率下降[32]。Nimbal等[33]研究認(rèn)為,化感物質(zhì)能有效抑制光系統(tǒng)Ⅱ中電子受體QA和QB之間的電子傳遞,進(jìn)而影響光合作用。Baziramakenga等[6]研究結(jié)果表明,低濃度苯甲酸和肉桂酸可以增加大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)葉綠素含量,而高濃度則產(chǎn)生相反效果。葉綠素含量與植物生物量積累密切相關(guān)[34],葉片葉綠素含量降低會限制光合速率和光合產(chǎn)物的積累,從而降低植物的總生長量[22,35],因此,紅松苗針葉葉綠素含量減少是導(dǎo)致紅松苗生物量積累受抑制的原因之一。

不同濃度3種酚酸處理紅松苗后,其針葉中POD、CAT活性受到顯著抑制,SOD活性增加。SOD清除植物體內(nèi)超氧化物陰離子并產(chǎn)生 H2O2[36],POD和CAT將紅松苗體內(nèi)過多H2O2清除從而降低活性氧的毒害作用[37-38],但由于酚酸處理使紅松苗體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性發(fā)生改變致使其不能保持原有正常水平,從而破壞了活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡[39-41]?；钚陨叩腟OD將O2-轉(zhuǎn)化為 H2O2時,活性下降的POD、CAT無法清除大量累積的H2O2以確保紅松苗體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡,導(dǎo)致過量H2O2累積在紅松苗體內(nèi)加劇了膜脂過氧化,使膜結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞,引起一系列生理生化代謝紊亂,導(dǎo)致傷害發(fā)生,對紅松苗機體形成氧化損傷,作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖及可溶性蛋白含量升高正是3種酚酸對紅松苗機體氧化損傷結(jié)果的體現(xiàn)。MDA作為氧化傷害和脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物,具有很強的毒性,可抑制蛋白質(zhì)合成或?qū)е旅富钚詥适42]。因此,從MDA含量顯著增加也可看出不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗產(chǎn)生較大程度傷害,紅松苗因氧化損傷致使其生長受抑制,生長狀況變差。由此可知,苯甲酸、丁香酸、香草酸通過破壞紅松苗體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)而抑制紅松苗生長。

酚酸脅迫條件下,植物細(xì)胞會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如可溶性糖、可溶性蛋白等),以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢、維持水分平衡及細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)[43]?？扇苄蕴遣粌H作為細(xì)胞的代謝能源和結(jié)構(gòu)組成成分,還是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中的各種信號[44]。糖信號途徑與脅迫途徑相互作用,以調(diào)節(jié)植物的代謝反應(yīng)[45-46]。可溶性糖含量的波動是化感脅迫過程中常見的現(xiàn)象[47]。而由于蛋白質(zhì)相對合成速率減小,現(xiàn)有可溶性蛋白質(zhì)大量分解為游離氨基酸,用于調(diào)節(jié)滲透壓并提供代謝能源,從而造成可溶性蛋白含量降低[48-49]。本試驗中,不同濃度BA、SA、VA溶液對可溶性糖及可溶性蛋白含量影響顯著,其中,紅松苗為平衡3種濃度BA溶液及20 mg/L SA和VA溶液的化感脅迫作用而積累可溶性糖,使可溶性糖含量增加,而紅松苗為調(diào)節(jié)不同濃度 BA、VA溶液對其產(chǎn)生的化感作用,導(dǎo)致紅松苗針葉中可溶性蛋白含量減少。不同濃度酚酸溶液對紅松種子萌發(fā)及苗木生長的影響存在較大差異性,可能是由于紅松在不同生育時期對酚酸感應(yīng)程度不同造成。

本試驗證實了先前提出的假設(shè),即BA、SA、VA在闊葉紅松林生態(tài)系統(tǒng)中可能作為化感物質(zhì)影響紅松種子萌發(fā)及苗木生長。而在自然生態(tài)環(huán)境中,化感作用是化感物質(zhì)綜合作用的結(jié)果,因此,研究化感物質(zhì)間的化感綜合效應(yīng)及設(shè)計合理的野外實驗,對進(jìn)一步正確了解影響闊葉紅松林中的化感作用機理及解決紅松更新障礙問題具有更重要的意義。