朱 晗,郝德君,魏原芝,孫麗昕,文全民

(南京林業(yè)大學林學院，南方現代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

昆蟲在長期協(xié)同進化過程中，與病毒、細菌、真菌、原生動物等多種微生物相互選擇、相互適應，形成了密切的共生關系。研究表明，昆蟲腸道細菌具有多方面的功能，如調節(jié)營養(yǎng)代謝幫助宿主分解難以降解的食物變?yōu)橐子谙盏慕M分[1]；直接為宿主昆蟲提供必需氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質[2]；分解代謝產生短鏈脂肪酸(SCFAs)等代謝副產物影響宿主昆蟲的脂質和碳水化合物代謝，維持穩(wěn)態(tài)[3]；調控激素的信號途徑從而影響宿主昆蟲的生長發(fā)育及其壽命[4]；降解殺蟲劑，保護宿主免受毒害[5]；參與腸道干細胞增殖和上皮細胞再生的生理活動[6]；參與昆蟲信息素的合成，調控宿主昆蟲種間通訊及種群行為[7]；引起宿主昆蟲的物種分化[8]；抑制昆蟲寄主植物的防御反應[9]等等。

仁扇舟蛾(Closterarestitura)為鱗翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae)扇舟蛾屬(Clostera)，具有世代多、產卵量大、幼蟲孵化率高、蟲口數量易在短期內劇增等特點[10-11]，是楊樹重要的食葉害蟲。國外分布于印度、越南、馬來西亞和印度尼西亞，國內分布于南方的安徽、江蘇、上海、浙江、江西、福建、湖南、廣東、云南、海南、臺灣和香港等地[10]。近些年，江蘇、安徽、上海等地仁扇舟蛾相繼爆發(fā)成災，不僅影響了我國重要速生樹種——楊樹的生長發(fā)育，也造成很大程度的生態(tài)環(huán)境破壞。目前雖然開展了仁扇舟蛾的形態(tài)特征[10]、生物學特性[11]、與寄主植物的相互關系[12]以及嗅覺感受蛋白[13]等方面的研究，但未見其腸道共生微生物的研究報道。本研究采用細菌分離培養(yǎng)法，利用16S rDNA基因序列分析和PCR擴增技術，結合菌落形態(tài)觀察和生理生化特征鑒定腸道中可培養(yǎng)細菌的種類，了解仁扇舟蛾腸道共生細菌的主要類群及其群落結構特征，為進一步研究特異功能細菌的生理生化特征和功能奠定基礎，也為探討腸道菌群對宿主的生理功能和生態(tài)學意義提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

仁扇舟蛾2～3齡幼蟲采自南京市浦口區(qū)烏江鎮(zhèn)(118°52′E，31°89′N)楊樹行道樹，帶回實驗室后置于光暗周期為14L/10D、溫度(25±2) ℃、相對濕度為(65±5)%的條件下飼養(yǎng)，喂食新鮮的楊樹葉片，每日更換1次。以實驗室飼養(yǎng)的第2代5齡幼蟲為供試昆蟲。

1.2 腸道解剖及可培養(yǎng)細菌的分離培養(yǎng)

選取10頭健康的5齡幼蟲，饑餓處理12 h，后用PBS緩沖液沖洗蟲體表面多次，置于75%酒精中體表消毒3 min，并用無菌水漂洗3次。無菌環(huán)境下解剖腸道，將分離的前、中和后腸分別置于2 mL離心管中，加入PBS緩沖液0.5mL研磨，并于室溫下1 000 r/min離心3 min，取上清液，用無菌水分別稀釋10-1～10-6倍，涂布于NA和LB固體培養(yǎng)基上。LB固體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，pH 7.0。NA固體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，pH 7.0。重復3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。根據菌落顏色、大小和形態(tài)分離純化單菌落，純化所得菌株于25%甘油中保存置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道可培養(yǎng)細菌的形態(tài)觀察及生理生化實驗

利用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化所得菌株，待長出單菌落后觀察形態(tài)特征，包括：大小、形狀、顏色、透明度、表面光滑與否及邊緣特點等。觀察菌體形態(tài)，包括菌體單染、革蘭染色、芽孢染色和鞭毛染色等。生理生化性狀包括酶活測定、H2S產生、硝酸鹽還原、丙二酸鹽及檸檬酸鹽的利用、IMViC(吲哚實驗、甲基紅實驗、伏-普實驗和檸檬酸鹽實驗)、碳素化合物利用(糖類和醇類)和大分子化合物水解(淀粉、液化明膠和七葉苷水解)等。

1.4 腸道可培養(yǎng)細菌DNA的提取和16S rDNA擴增

活化保存?zhèn)溆玫木N，提取細菌基因組DNA。16S rDNA通用引物：27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′) 和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應體系為25 μL：ddH2O 17.25 μL，10×TransTaq-T Buffer 2.5 μL，gDNA (50 ng/μL) 2.0 μL，Primer 27 F (10 mmol /L) 和Primer 1492 R(10 mmol /L) 各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，TransTaq-T DNA Polymerase (5 U/μL) 0.25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，后送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.5 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序得到的16S rDNA序列用Clustal X 1.82軟件進行多序列比對，后與NCBI GenBank數據庫進行Blast同源性比對，選取各個菌株的近緣序列，利用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹，使用Bootstrap檢驗進化樹的可靠性，Bootstrap值為1 000。

2 結果與分析

2.1 腸道可培養(yǎng)細菌的形態(tài)特征

研究分離得到仁扇舟蛾5齡幼蟲可培養(yǎng)細菌22株，其中前腸5株，中腸10株，后腸7株，對其依次編號為CF1-5、CM1-10和CH1-7。純化后，22株菌的菌落和菌體形態(tài)的觀察結果見表1。其中，3株菌的形狀為球形，19株為桿狀；8株細菌革蘭染色呈陰性，14株細菌革蘭染色呈陽性；9株細菌有芽孢，8株細菌有莢膜，18株細菌有鞭毛。

表1 仁扇舟蛾幼蟲腸道細菌基本特征Table 1 The basic characteristics of intestinal bacteria in the gut of Clostera restitura larval

2.2 腸道可培養(yǎng)細菌的生理生化鑒定及16S rDNA基因片段的擴增與克隆

測定結果表明(表2)，所有菌株對糖醇等碳素化合物的利用差異不顯著，均具有較強的分解能力。但不同菌株在酶活測定、H2S產生、硝酸鹽還原、丙二酸鹽及檸檬酸鹽利用等方面具有顯著差異，少數菌株在IMViC實驗中呈陽性反應。大多數菌株在大分子化合物水解實驗中呈陽性反應，可分解利用淀粉、液化明膠、七葉苷、檸檬酸鹽以及丙二酸鹽，但不能還原硝酸鹽且不能產生H2S。

表2 仁扇舟蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌各菌株生理生化性狀Table 2 Biochemical characteristics of cultured bacteria in the gut of Clostera restitura larval

以提取的腸道細菌基因組DNA為模板，采用細菌通用引物(27F和1492R)擴增后，通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，條帶清晰，且獲得的細菌16SrDNA基因片段全長在1 500 bp左右，是實驗所需目的片段(圖1)。

圖1 腸道細菌DNA PCR擴增電泳圖譜Fig.1 The electropherogram of the intestinal bacterial DNA PCR amplification

2.3 腸道可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 仁扇舟蛾幼蟲腸道細菌的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA phylotypes of the intestinal bacteria of Clostera restitura larvae

將獲得的序列提交NCBI GenBank數據庫進行Blast同源性比對，將測序得到的仁扇舟蛾幼蟲腸道細菌16S rDNA序列進行系統(tǒng)進化分析，結果見圖2。結合可培養(yǎng)細菌的形態(tài)特征和生理生化指標，鑒定結果如下：前腸5種細菌分別為皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)、氣球菌屬(Aerococcus)、斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)和Exiguobacteriumacetylium；中腸10種細菌分別為極小短小桿菌(Curtobacteriumpusillum)、皮氏羅爾斯頓菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiaginsengis)、氣球菌屬(Aerococcus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophlia)、斯氏假單胞菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和Paenibacillusuliginis；后腸7種細菌分別為皮氏羅爾斯頓菌、鉆特省芽孢桿菌(Bacillusdrentensis)、斯氏假單胞菌、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、寡養(yǎng)單胞菌和瓜兩面神菌(Janibactermelonis)。

3 討 論

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結合16S rDNA分子鑒定技術，研究了仁扇舟蛾5齡幼蟲不同腸段的可培養(yǎng)細菌群落結構。結果表明，仁扇舟蛾幼蟲腸道內的可培菌種類豐富，其中以變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群。在同為舟蛾科的櫟黃掌舟蛾(Phaleraassimilis)腸道菌的研究中發(fā)現其腸道優(yōu)勢菌群也以變形菌門和厚壁菌門為主，以葡萄球菌屬和短小桿菌屬為主要菌群[14]。在鱗翅目腸道菌群的相關研究中，大多數可培養(yǎng)細菌都屬于變形菌門，其中α-變形菌門和γ-變形菌門最為常見；在科水平上，以腸桿菌科、芽孢桿菌科、假單胞菌科、葡萄球菌科、腸球菌科最為常見；在屬水平上，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和腸球菌屬最為常見[15]。在夜蛾科的相關研究中，變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，其中克雷伯氏菌屬和沙雷氏菌屬為優(yōu)勢菌屬[16]。在舞毒蛾(Lymantriadispar)的腸道中發(fā)現分離出的70%的細菌屬于革蘭陽性的γ-變形菌門[17]。

昆蟲中腸段作為食物消化和吸收的主要場所，菌群種類和數量相對較高。本研究發(fā)現腸道細菌的種類會隨著腸段的不同有所差異，如中腸段特有極小短小桿菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌、蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和Paenibacillusuliginis。此外，相鄰腸段之間往往存在相同的細菌，例如從前腸和中腸中分離出的氣球菌屬，中腸和后腸共有的寡養(yǎng)單胞菌。前、中和后腸等3個腸段共有的細菌為皮氏羅爾斯頓菌和斯氏假單胞菌。

昆蟲腸道菌群不僅與宿主有關，而且與環(huán)境、取食的寄主植物有極大的關系。楊樹葉片中含有較為豐富的單寧[18]，仁扇舟蛾作為楊樹重要的食葉害蟲，相關研究表明節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬均可降解單寧[19]。本研究分離到仁扇舟蛾腸道中的這些細菌可能在克服植物次生代謝物質的化學防御上發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究首次分析了仁扇舟蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌的種類與群落結構組成。這些細菌可能在提高宿主昆蟲對環(huán)境的適應性、為宿主提供營養(yǎng)和降解外源有毒物質等方面發(fā)揮作用，相關功能有待后續(xù)研究。