陳可欣 駱鄭航 李 玲 顧玉婷 袁 康 胡振陽 都立輝

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實驗室，南京 210023)

我國是糧食生產(chǎn)大國，然而每年有近3%的糧食因霉菌污染而浪費(fèi)[1]。霉菌是影響糧食安全儲藏的重要因素之一，糧食受到霉菌侵染后，會霉?fàn)€腐敗而產(chǎn)生霉、酸、腐臭等難聞氣味，不僅降低了糧食品質(zhì)，給我國農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會給消費(fèi)者的健康安全帶來隱患[2，3]。

化學(xué)農(nóng)藥因其毒性較大，污染環(huán)境等弊端受到消費(fèi)者排斥[4]。而與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥的有效成分是天然產(chǎn)物，使用后易分解為無毒物質(zhì)，對人體危害小，對環(huán)境無污染，有較好的應(yīng)用前景[5]。

隨著人們健康與環(huán)保意識增強(qiáng)，天然植物精油在食品行業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。植物精油 (essential oils) 是植物不同組織中一類次生物質(zhì)，由分子量較小的簡單化合物組成，是一類易揮發(fā)、有強(qiáng)烈的芳香氣味的油狀液體[6]。香樟精油是從香樟葉 (Cinamomumcamphora)中提取的活性物質(zhì)，主要成分為α-松油醇、β-松油醇、樟腦烯、檸檬烴和丁香油酚等[7，8]。植物精油中的活性物質(zhì)通過不同方式發(fā)揮作用，因而起到廣譜的抑菌效果[9]。香樟精油已廣泛應(yīng)用于香精香料、精細(xì)化學(xué)品合成、藥物合成、日用化工等領(lǐng)域，相關(guān)研究及開發(fā)利用等工作由來已久[10]?，F(xiàn)有的相關(guān)研究主要圍繞植物精油的抑菌機(jī)理、抑菌成分及檢測技術(shù)進(jìn)行，并已取得一定成果，但香樟精油應(yīng)用于儲糧霉菌的研究較少，因此有必要對香樟精油作用于儲糧霉菌如灰綠曲霉的抑菌效果進(jìn)一步研究[11，12]。

基于香樟精油在食品中微生物抑制領(lǐng)域的應(yīng)用，本試驗主要測定了香樟精油對灰綠曲霉的最小抑制濃度，研究不同濃度的香樟精油的抑菌活性，探討香樟精油抑制灰綠曲霉的抑菌機(jī)理，為香樟精油對灰綠曲霉的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰綠曲霉、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯(Potato Dextrose Broth，PDB)、香樟精油；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1酶標(biāo)儀，BSC-250隔水式恒溫培養(yǎng)箱，TM3000掃描電鏡，傅里葉紅外光譜，流式細(xì)胞儀BD FACSVerse，紫外分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

配置新鮮的PDA培養(yǎng)基，接種灰綠曲霉，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取長勢良好的霉菌接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，相同條件，重復(fù)三次。將培育好的霉菌接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培育3～5 d。將菌液與已滅菌的30%的甘油以體積比1∶1混合均勻，-70 ℃保存。使用菌種時，菌液解凍活化，取1%菌液接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，備用[13]。

孢子液的制備：在PDA培養(yǎng)基上接種灰綠曲霉，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用無菌水反復(fù)沖洗菌落表面，洗下孢子，用無菌紗布濾去菌絲，制得孢子懸浮液。充分振蕩混勻后，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察計數(shù)。保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度的測定

將適量香樟精油溶于5%的Tween-80水溶液中，得到初始濃度為16 μL/mL的精油溶液，通過二倍稀釋法得到精油濃度為8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL的體系。將計數(shù)后的菌液，取適量離心，并用不同濃度的精油溶液重懸，使得霉菌孢子濃度為105CFU/mL，以不加菌液的培養(yǎng)基作為陽性對照，以不加精油的菌液作為陰性對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、12、24、36、48、60、72 h和84 h時檢測不同濃度精油處理后霉菌的OD600值(在波長600 nm處測定樣品的光密度Optical density，OD600)，與陽性對照組OD600值相近的最小精油濃度為香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度[14]。

1.3.3 香樟精油對灰綠曲霉最小殺菌濃度的測定

按上述方法，配制濃度為8、4、2、1、0.5 μL/mL的香樟精油，并調(diào)節(jié)灰綠曲霉孢子濃度為105CFU/mL，未經(jīng)精油處理的菌液作為空白對照，于恒溫振蕩箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，取50 μL經(jīng)精油處理的灰綠曲霉孢子液滴加在PDA培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察其生長情況，拍照記錄。

1.3.4 香樟精油抑制菌絲生長活性的測定

按上述方法，將灰綠曲霉孢子懸浮液按5×105CFU/mL的濃度分別接種于含有0.5、1、2 μL/mL不同濃度香樟精油的PDB培養(yǎng)基中，以精油未處理組樣品為對照組。于恒溫振蕩箱中28 ℃培養(yǎng)3 d后，收集菌絲體，于烘箱中60 ℃干燥至恒重，稱重其干基[15]；與對照組對比，計算菌絲生長的抑制率。公式如下：

菌絲抑制率=(WC-WS)/WC×100%

式中：WC為對照中的平均菌絲干重；WS為含有香樟精油的培養(yǎng)基中的平均菌絲干重。

1.3.5 香樟精油對孢子萌發(fā)的影響

將灰綠曲霉分別接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃靜置培養(yǎng)，待其生長成熟后，用無菌水沖洗平板中菌絲，經(jīng)紗布過濾制得霉菌孢子懸浮液；離心收集孢子，分別用含有0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油PDB培養(yǎng)液重懸霉菌孢子，使孢子的最終濃度為105CFU/mL，置于28 ℃恒溫孵育，并分別在6、9、12 h時在顯微鏡下觀察，當(dāng)孢子萌芽的長度比孢子直徑長時，即判定為孢子萌發(fā)，計算霉菌孢子萌發(fā)率。

1.3.6 香樟精油對灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇含量的影響

霉菌麥角固醇含量的測定方法如下：將霉菌孢子懸浮液按5×105CFU/mL的濃度接種于含0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油的PDB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，無菌水沖洗菌絲體，并在濾紙上過濾收集，置于25%的KOH醇溶液中，在85 ℃下孵育4 h，加入2 mL無菌水和5 mL正庚烷后振蕩2 min后，將正庚烷層收集，并用UV-1700在230 nm至300 nm之間掃描。正庚烷層中麥角固醇(在282 nm)和麥角固醇的中間產(chǎn)物(脫氫麥角固醇在230 nm和282 nm)的存在導(dǎo)致了特征曲線。未經(jīng)精油處理的樣品為對照。麥角固醇含量的計算公式如下：

脫氫麥角固醇=(A230/518)/菌絲濕重

麥角固醇=(A282/290)/菌絲濕重-脫氫麥角固醇

式中：A230為230 nm處吸收峰的吸光度；A282為282 nm處吸收峰的吸光度。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察香樟精油處理對灰綠曲霉形態(tài)的影響

按上述方法培養(yǎng)，取適量灰綠曲霉孢子液分別加入0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油，將樣品于28 ℃培養(yǎng)24 h。取出孢子液離心(3 000 r/min，10 min)，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸兩次，加入戊二醛溶液于4 ℃固定4 h。用不同濃度的酒精溶液(30%、50%、70%、90%、100%)梯度脫水，叔丁醇置換酒精，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察[16]。

1.3.8 香樟精油處理對灰綠曲霉線粒體ATP酶活性的影響

根據(jù)上述方法收集 0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理的灰綠曲霉菌絲體，重懸于10 mL含有50 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1 mmol/LPMSF(苯基甲磺酰氟)的緩沖液中后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，以10 000 g離心30 min后用2%的葡萄糖溶液破壞細(xì)胞獲得線粒體，并以2 000 g離心5 min，然后以10 000 g離心30 min。將10%的線粒體重懸于緩沖液中并儲存于4 ℃?zhèn)溆?。使用ATP酶試劑盒(A016-1-1)檢測香樟精油處理霉菌中的線粒體ATP酶活性。

1.3.9 傅里葉紅外光譜對香樟精油處理灰綠曲霉菌絲體的測定

按上述方法培養(yǎng)，將生長成熟的灰綠曲霉，分別用0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油處理，所有樣品均置于28 ℃培養(yǎng)24 h。離心(3 000 r/min，10 min)，用PBS重懸2次，30 ℃烘干。烘干后的樣品與光譜純溴化鉀按比例混勻，反復(fù)研磨制備成透明的薄膜壓入顆粒中。將薄片放在紅外光譜儀中進(jìn)行紅外光譜檢測[17-19]。

1.3.10 流式細(xì)胞儀檢測香樟精油作用后灰綠曲霉細(xì)胞的死亡情況

按上述方法培養(yǎng)，取適量灰綠曲霉孢子液離心(9 000 r/min，3 min)，除去上清液，分別加入0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油，振蕩混合，所有樣品均置于28 ℃培養(yǎng)24 h后離心，用PBS溶液沖洗，重懸兩次，過膜。加入1 μg/mL PI(Propidium Iodide)染液，于35 ℃避光保存30 min[20]。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.11 實驗數(shù)據(jù)處理

本文中所有實驗均平行三次。運(yùn)用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計對試驗結(jié)果單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯方差分析(P<0.05)，采用Origin 2018軟件處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度(MIC)測定

通過MIC和MFC定性和定量評估香樟精油的抑菌活性，由圖1可以看出，不同濃度的香樟精油對灰綠曲霉具有良好的抑制效果。當(dāng)香樟精油濃度達(dá)到1 μL/mL時，灰綠曲霉呈現(xiàn)出與陽性對照類似的生長趨勢且為1 μL/mL，香樟精油處理后的菌體在600 nm下的吸光度與陰性對照相比無顯著性差異(P>0.05)，表明灰綠曲霉的MIC為1 μL/mL。

圖1 不同濃度香樟精油對灰綠曲霉的生長抑制作用

2.2 香樟精油對灰綠曲霉最小殺菌濃度測定

灰綠曲霉孢子經(jīng)不同體積濃度的香樟精油溶液處理后，孢子活力發(fā)生改變，在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長呈濃度依賴性抑制狀態(tài)。當(dāng)香樟精油的體積濃度為8倍MIC(8 μL/mL)及以上時，灰綠曲霉孢子在PDA培養(yǎng)基上不生長，由此可推測灰綠曲霉的最小殺菌濃度為8 μL/mL。

2.3 香樟精油抑制灰綠曲霉菌絲生長

隨香樟精油濃度的增加，灰綠曲霉的菌絲生長受到不同程度的抑制。如表1所示，經(jīng)過不同濃度(0、0.5、1和2 μL/mL)香樟精油處理3 d后其菌絲干重分別為0.47、0.26、0.16、0.09 g。與對照組比較，在0.5、1和2 μL/mL濃度精油對灰綠曲霉菌絲生長抑制率分別為23.32%、33.16%、66.58%、74.80%，經(jīng)0.5 μL/mL及以上濃度香樟精油處理后的菌絲干重呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

表1 灰綠曲霉經(jīng)不同濃度香樟精油處理的菌絲干重、麥角固醇及ATP酶活性變化

2.4 香樟精油抑制灰綠曲霉孢子萌發(fā)

如圖2所示，空白組灰綠曲霉的孢子萌發(fā)率在6、9、12 h時分別為43.33%、77.33%和96%，未受精油處理的灰綠曲霉孢子在12 h內(nèi)幾乎全部萌發(fā)。而不同濃度精油處理組(0.5、1、2 μL/mL)的霉菌孢子在6 h幾乎不萌發(fā)，1 μL/mL精油處理組的孢子萌發(fā)率在12 h時僅為27.33%，孢子萌發(fā)率受抑制效果顯著(P<0.05)。由此可見，當(dāng)灰綠曲霉孢子濃度為105CFU/mL時，0.5 μL/mL及以上濃度的香樟精油可有效抑制灰綠曲霉孢子萌發(fā)生長為菌絲體。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異達(dá)0.05顯著水平。圖2 不同濃度香樟精油對灰綠曲霉孢子萌發(fā)的影響

2.5 香樟精油抑制灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇的生成

麥角固醇是霉菌細(xì)胞膜的主要成分之一，麥角固醇含量是評價霉菌膜完整性的重要指標(biāo)之一。如表1所示，灰綠曲霉經(jīng)0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理后，灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇含量分別為814.41、220.10、155.06、131.90 μg/g。因此，當(dāng)香樟精油濃度達(dá)0.5 μL/mL及以上時，質(zhì)膜中麥角固醇含量顯著降低(P<0.05)，霉菌細(xì)胞膜的組分發(fā)生了變化。麥角固醇含量的降低，往往伴隨著細(xì)胞整體性被破壞和霉菌細(xì)胞膜通透性的改變。

2.6 掃描電鏡檢測香樟精油處理對灰綠曲霉菌體形態(tài)的影響

由圖3可知，空白對照組中灰綠曲霉的孢子形態(tài)完整，圓潤飽滿，表面平滑。而用0.5 μL/mL體積濃度的香樟精油處理后，灰綠曲霉表面變得不平整，產(chǎn)生褶皺與凹陷，表明灰綠曲霉的細(xì)胞膜受到一定損傷；當(dāng)濃度增加到1 μL/mL和2 μL/mL時，菌絲體形體遭嚴(yán)重破壞，扭曲變形。由此推測香樟精油導(dǎo)致菌絲體內(nèi)含物流出[21]。

圖3 掃描電鏡觀察不同濃度香樟精油處理后灰綠曲霉形態(tài)

2.7 香樟精油抑制灰綠曲霉ATP酶的活性

ATP酶可催化ATP分解為ADP和磷酸根離子，并在此過程中釋放能量，為細(xì)胞供能。如表1所示，經(jīng)過不同濃度(0、0.5、1、2 μL/mL)香樟精油處理3天后其菌絲體ATP酶活性分別為1.08、0.88、0.55和0.47 U/mgprot。隨香樟精油濃度的增加，灰綠曲霉線粒體ATP酶活性降低。與對照組比較，0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理對灰綠曲霉ATP酶活性的抑制率分別為18.11%、48.76%和56.83%。結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組的線粒體ATP酶活性顯著降低(P<0.05)且各處理組間差異顯著(P<0.05)，表明0.5 μL/mL及以上濃度的香樟精油可顯著抑制灰綠曲霉的線粒體ATP酶活性(P<0.05)。ATP酶活性的降低可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)供能不足，使霉菌生長代謝紊亂從而干擾霉菌正常生理活動。

2.8 紅外光譜檢測香樟精油處理對灰綠曲霉組成成分的影響

利用紅外光譜(FTIR)測定灰綠曲霉在香樟精油的作用下官能團(tuán)變化情況，進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變。結(jié)合圖表分析可以看出，3 400 cm-1譜峰相對強(qiáng)度有所減小，說明灰綠曲霉結(jié)構(gòu)中羥基減少[25]；2 910 cm-1譜峰相對強(qiáng)度減小，說明甲基(—CH3)和亞甲基(—CH2)含量減??；1 650 cm-1譜峰強(qiáng)度有所減小，表明有機(jī)羧酸含量減小[26]；1 530 cm-1吸收峰強(qiáng)度減小，說明脂肪族化合物、木質(zhì)素以及碳水化合物的量減小。1 380 cm-1處吸收峰強(qiáng)度減小，表明氨基含量減?。? 250 cm-1譜峰減弱表明C—O、Si—O減??；1 050 cm-1譜峰強(qiáng)度減弱，表明纖維素有少量的降解[27]。因此，隨著香樟精油濃度升高，對灰綠曲霉作用增大，灰綠曲霉的組成物質(zhì)逐漸被消耗，樣品的光譜信息也隨之改變。

圖4 紅外光譜觀察經(jīng)不同濃度香樟精油處理后灰綠曲霉的表征變化

表2 ATR-FTIR光譜區(qū)的功能團(tuán)特性[22-24]

2.9 流式細(xì)胞儀測定香樟精油對灰綠曲霉細(xì)胞膜完整性的影響

非通透性PI染液，不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，只能穿過受損的細(xì)胞膜并對細(xì)胞核染色[28]。因此可用PI作為染液用流式細(xì)胞儀分析香樟精油對灰綠曲霉的膜完整性的影響[29，30]。由圖5可知，隨著香樟精油體積濃度提高，染色細(xì)胞增加，膜完整性破壞的程度也隨之呈依賴性升高[31]。經(jīng)過0.5倍MIC(0.5 μL/mL)的香樟精油處理后，灰綠曲霉的死亡細(xì)胞明顯增長，推測是由于正常菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性發(fā)生變化，引起自身溶解和死亡所致[32，33]。

圖5 流式細(xì)胞儀測定香樟精油對灰綠曲霉細(xì)胞膜完整性的影響

3 結(jié)論

本研究通過最小抑菌濃度、最小殺菌濃度、孢子萌發(fā)和菌絲干重對香樟精油的抑菌能力進(jìn)行檢測；通過麥角固醇含量、掃描電鏡檢測、線粒體ATP酶活性、紅外光譜和流式細(xì)胞術(shù)等實驗對香樟精油抑制灰綠曲霉的機(jī)理進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)香樟精油對灰綠曲霉有很好的抑菌效果，其最低抑菌濃度為1 μL/mL，最低殺菌濃度為8 μL/mL，菌絲生長受到抑制。經(jīng)0.5 μL/mL及更高濃度的香樟精油處理，灰綠曲霉菌落數(shù)顯著減少，灰綠曲霉孢子表面產(chǎn)生褶皺與凹陷，且與對照組相比差異明顯；隨香樟精油濃度提升，孢子萌發(fā)率顯著降低，孢子的凋亡情況也顯著增強(qiáng)，精油體積濃度越高，香樟精油抑制灰綠曲霉的效果越顯著。香樟精油處理后，灰綠曲霉細(xì)胞變形，霉菌表面明顯受損。且精油濃度越高，霉菌受到的損傷越嚴(yán)重，精油處理會改變霉菌細(xì)胞的完整性與膜滲透性。因此，香樟精油抑制灰綠曲霉的作用方式主要是降低質(zhì)膜中麥角固醇的含量，使細(xì)胞膜通透性增加，改變細(xì)胞膜內(nèi)外平衡；使線粒體ATP酶活性降低，破壞其表面結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到抑菌效果。

綜上，香樟精油作為抑菌劑，可有效抑制灰綠曲霉，為精油作為天然抑菌劑應(yīng)用于糧食儲藏提供了理論依據(jù)。后續(xù)可進(jìn)一步對香樟精油作用于不同類型的儲糧菌種以及復(fù)合精油的作用進(jìn)行深入研究。