賈義平，李翠玲，樊祜卿，王 曼

（1.菏澤市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東菏澤 274000；2.成武縣畜牧服務(wù)中心，山東成武 274200）

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的，以家畜和多種野生動(dòng)物發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性、熱性傳染病，呈世界性分布。豬是PRV 的天然宿主，因此PRV 對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重[1]。感染PRV 后，妊娠母豬可出現(xiàn)產(chǎn)木乃伊胎或死胎等流產(chǎn)癥狀[2]；不到7 日齡的仔豬，以無(wú)明顯臨床癥狀的突然死亡為特征；2～3 周齡仔豬可出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)癥狀，死亡率可高達(dá)100%；保育豬可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和呼吸道癥狀，致死率為10%～20%；生長(zhǎng)豬和育肥豬可出現(xiàn)呼吸道癥狀，常因繼發(fā)細(xì)菌性肺炎而死亡[3]。2011 年以后，PR 在我國(guó)從北向南又出現(xiàn)了新一輪流行，到2017 年全國(guó)各地仍時(shí)有PR 暴發(fā)和流行，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。本研究檢測(cè)分析了山東省菏澤市某規(guī)?；疨RV 陽(yáng)性豬場(chǎng)不同豬群感染情況，以及不同生產(chǎn)階段和場(chǎng)區(qū)環(huán)境中的病毒分布情況，以期為規(guī)模化豬場(chǎng)的PR 免疫及生物安全防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬場(chǎng)發(fā)病概況

該豬場(chǎng)存欄母豬約1 000 頭。2019 年9 月育肥豬首先出現(xiàn)呼吸困難、體質(zhì)量下降、咳嗽等癥狀，死淘率近8%；隨即保育豬出現(xiàn)咳嗽、四肢劃水、被毛粗亂、精神萎靡等臨床特征，死淘率約10%。之后逐漸波及產(chǎn)房，新生仔豬無(wú)明顯臨床癥狀死亡，2～3 周齡仔豬出現(xiàn)戰(zhàn)栗、驚厥、震顫、四肢劃水等神經(jīng)癥狀，病死率達(dá)15%，同時(shí)妊娠舍懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)（產(chǎn)木乃伊胎、死胎）以及呼吸道癥狀和高燒等特征，流產(chǎn)率約10%。該場(chǎng)PR 疫苗免疫程序見表1。

表1 該豬場(chǎng)PR 疫苗免疫程序

為查明原因，在豬場(chǎng)發(fā)病后立即采集20 份病料（育肥豬4 份、仔豬8 份、流產(chǎn)胎兒8 份），采用熒光定量PCR 方法，進(jìn)行豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、PRV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀，判斷PRV是引起豬場(chǎng)發(fā)病的主要原因。隨后對(duì)PRV-gE基因進(jìn)行測(cè)序。遺傳進(jìn)化分析顯示，該規(guī)?；i場(chǎng)中流行的PRV 屬于2.3 型變異野毒株。

1.2 樣品采集

為進(jìn)一步調(diào)查PRV 在該規(guī)?；i場(chǎng)各豬群中的感染情況、場(chǎng)區(qū)環(huán)境分布情況及病毒載量，隨機(jī)采集豬場(chǎng)臨床健康豬只鼻拭子（因鼻腔的PRV 滴度效價(jià)較高[6]），包括：母豬鼻拭子129 份，其中斷奶后20 份、妊娠前期（＜30 d）22 份、妊娠中期（31～85 d）25 份、妊娠后期（86～114 d）30 份、哺乳期32 份；仔豬（15～21 日齡）鼻拭子50 份，保育豬（45～50 日齡）鼻拭子25 份；育肥豬鼻拭子90份，其中80～90日齡32份、120～130日齡30份、160～180 日齡28 份；場(chǎng)區(qū)環(huán)境樣本拭子，包含圈舍、飼料、水源、糞便等各5 份。將采集的新鮮拭子樣本，使用滅菌生理鹽水懸浮。樣本收集后，若不能即時(shí)檢測(cè)，則2～8 ℃冷藏過夜保存；若長(zhǎng)期保存，則-80 ℃冷凍保存。

1.3 檢測(cè)及分析

采用PRV-gE基因熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品），按照試劑盒使用說明進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判定：Ct ≤35 或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，為陽(yáng)性；Ct 值在35～38 范圍內(nèi)，則對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，若Ct 值仍在35～38 范圍內(nèi)，且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，為陽(yáng)性，反之為陰性；Ct ＞38 或無(wú)Ct 值，為陰性。將標(biāo)準(zhǔn)品Ct 值與濃度制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后依據(jù)待檢樣品Ct 值計(jì)算待檢樣品濃度，并換算成拷貝數(shù)。采用Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS 19.0 軟件，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行加權(quán)處理后實(shí)施卡方檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 母豬群檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：母豬群PRV-gE平均陽(yáng)性率為17.83%，妊娠前后各階段表現(xiàn)為先上升后下降趨勢(shì)，其中妊娠中期最高，為24.00%。經(jīng)SPSS 卡方檢驗(yàn)，各階段陽(yáng)性率差異不明顯（P＞0.05）。

2.2 生長(zhǎng)豬群檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：生長(zhǎng)豬群PRV-gE平均陽(yáng)性率為11.52%，且隨日齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)急速上升又快速下降趨勢(shì)，其中80～90 日齡育肥豬陽(yáng)性率最高，為28.13%，經(jīng)SPSS 卡方檢驗(yàn)，與其他日齡段豬群差異顯著（P＜0.05）。

表2 母豬群PRV-gE 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

表3 生長(zhǎng)豬群PRV-gE 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同生產(chǎn)階段場(chǎng)區(qū)環(huán)境及豬群病毒載量檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示：飼料、水源、上豬臺(tái)和出豬臺(tái)樣品中未檢測(cè)到PRV-gE陽(yáng)性，而妊娠舍（糞溝、限位欄表面、妊娠母豬），產(chǎn)房（糞溝、產(chǎn)床表面、分娩舍底部、哺乳母豬、仔豬），保育和育肥舍（圈舍欄表面、保育豬、育肥豬）樣品中均檢測(cè)到PRV-gE陽(yáng)性；育肥豬群帶毒量最高，為3.6×105拷貝數(shù)/mL，經(jīng)SPSS 卡方檢驗(yàn)，與其他環(huán)境及豬群樣品差異均顯著（P＜0.05）。

3 討論

PR 流行給國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。2012 年以后，我國(guó)各地Bartha-K61 疫苗免疫豬群也發(fā)生過大規(guī)模PR 疫情或處于野毒感染狀態(tài)，導(dǎo)致種豬繁殖障礙，仔豬死亡率升高。Gu 等[8]對(duì)山東省2013—2016 年采集的2 033 份血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PR 野毒抗體陽(yáng)性率為57.8%；張曉陽(yáng)[9]對(duì)山東省2018 年采集的5 038 份血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)gE 抗體總體陽(yáng)性率為45.00%。上述結(jié)果表明，PRV 變異毒株已經(jīng)在山東省廣泛流行，并持續(xù)感染。另有研究[10]表明，Bartha-K61 疫苗對(duì)分離到的PR 毒株僅能提供50%的交叉保護(hù)。Zhou 等[11]在山東省某豬場(chǎng)的研究結(jié)果表明，免疫Bartha-K61 毒株疫苗后，仍然出現(xiàn)仔豬頑固性腹瀉、神經(jīng)癥狀以及母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等癥狀。該豬場(chǎng)免疫疫苗同樣為Bartha-K61，仍然發(fā)生PR 野毒感染，表明Bartha-K61 疫苗不能完全抵御野毒入侵。

表4 不同生產(chǎn)階段場(chǎng)區(qū)環(huán)境和豬群病毒載量檢測(cè)結(jié)果

楊濤等[12]在分子生物學(xué)水平上比較了PRV Bartha-K61 疫苗株與當(dāng)前流行的變異株之間的差異，發(fā)現(xiàn)疫苗株和變異株分屬于不同的分支。古金元等[13]和劉照虎等[14]分別對(duì)山東省不同地區(qū)的規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行了PRV 分離，發(fā)現(xiàn)分離株與國(guó)內(nèi)報(bào)道的PRV 變異株核苷酸同源性均高于歐美毒株，與疫苗株Bartha-K61 株遺傳距離較遠(yuǎn)。這進(jìn)一步解釋了該豬場(chǎng)免疫的Bartha-K61 疫苗株不能對(duì)變異株提供充足保護(hù)的原因。

PR 發(fā)生后，為探究該豬場(chǎng)不同豬群感染情況，以便為后期疫苗免疫程序優(yōu)化和生物安全防控提供數(shù)據(jù)支撐，本研究檢測(cè)了不同豬群的鼻拭子樣品，發(fā)現(xiàn)病原總體陽(yáng)性率為14.28%。張樹金等[15]在2015—2017 年對(duì)山東省PRV 流行情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PRV 平均抗原陽(yáng)性率為12.30%。劉照虎等[14]在山東省進(jìn)行PR 檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)2017 年、2018年的病原陽(yáng)性率分別為11.20%、7.54%。該豬場(chǎng)檢出的PR 病原陽(yáng)性率較高，說明本場(chǎng)PRV 感染較為嚴(yán)重，當(dāng)然也可能與本次檢測(cè)樣本量較小有關(guān)，后需進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本量。對(duì)生長(zhǎng)豬群進(jìn)行PRV 檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)豬群間的病原陽(yáng)性率有差異，其中育肥豬顯著高于其他日齡段。這一方面和該場(chǎng)使用的Bartha-K61 疫苗株與變異株同源性較差，交叉保護(hù)力不足有關(guān)；另一方面可能是二免日齡過早（35 日齡），受母源抗體干擾，導(dǎo)致75 日齡二次加強(qiáng)免疫效果較差，產(chǎn)生保護(hù)力不足。在對(duì)妊娠母豬群進(jìn)行PRV 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，妊娠母豬群間的病原陽(yáng)性率差異不明顯，但妊娠中期略高。張嘉保等[16]在對(duì)妊娠母豬細(xì)胞免疫水平的研究中發(fā)現(xiàn)，妊娠中期免疫抑制作用較強(qiáng)（差異不顯著）。另有研究[17]表明，妊娠可以使病毒活化，增加感染PRV 的潛在風(fēng)險(xiǎn)，且孕期的胎盤傳播，主要從懷孕中期開始。本研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠中期病原陽(yáng)性率較高，這可能與母豬妊娠中期的免疫抑制有關(guān)。

鼻腔黏膜和口腔是PRV 感染的主要入侵部位[18]。研究[19]表明，感染PRV 豬的分泌物、排泄物和呼吸物中都有較高的病毒載量，且病毒對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力。本研究發(fā)現(xiàn)，除飼料、水源、上豬臺(tái)、售豬臺(tái)外，不同豬群及各階段生產(chǎn)環(huán)境中均可檢測(cè)到PRV，且豬群帶毒量越高，相應(yīng)環(huán)境中的病毒載量就越高。這進(jìn)一步說明該豬場(chǎng)PRV 的傳播主要通過豬與豬的直接接觸，或是與PRV 污染的感染物相接觸。故嚴(yán)格執(zhí)行場(chǎng)區(qū)各生產(chǎn)階段的有效隔離，加強(qiáng)消毒處理，對(duì)于防止PRV 傳播尤為重要。

綜上，該規(guī)模豬場(chǎng)不同豬群均遭受PRV 不同程度的感染，尤其是母豬妊娠中期和育肥豬早期，且大部分環(huán)境中均能檢測(cè)到病毒。因此，規(guī)模豬場(chǎng)要加強(qiáng)PRV 監(jiān)測(cè)，通過監(jiān)測(cè)來(lái)調(diào)整優(yōu)化PR 免疫程序，同時(shí)要加強(qiáng)生物安全控制，進(jìn)行系統(tǒng)性防控。