陳忠偉，何文娜，2，何 穎，段振華，盧冰霞，段群棚，甘甲忠，趙 武，甘一波，全琛宇，黃 宇

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)，廣西南寧 530005；3.玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林 537000）

近年來，隨著養(yǎng)豬場(chǎng)的規(guī)?；⒓s化發(fā)展，豬群飼養(yǎng)密度日益增大，加之生產(chǎn)周轉(zhuǎn)加快、健康養(yǎng)殖技術(shù)滯后等原因，造成廣西部分地區(qū)多種豬病流行，尤其是病毒性疫病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害日趨嚴(yán)重。其中，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）和豬偽狂犬病病毒（PRV）等是養(yǎng)豬業(yè)中常見的病毒性疫病病原[1-2]。這4 種病原單獨(dú)或混合感染均能引起豬群的繁殖障礙或呼吸道疫病，具有傳播速度快、危害性大、消滅困難、隱性帶毒、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[2-6]，對(duì)豬場(chǎng)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2015—2019 年，段群棚等[7]從廣西14 個(gè)地市規(guī)模豬場(chǎng)采集1 114 份具有呼吸道癥狀病豬樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)豬呼吸道疫病多發(fā)且以多病原混合感染為主，其中PRRSV 檢出率最高，PCV2 次之；同年黎軍[4]等也發(fā)現(xiàn)，廣西生豬主產(chǎn)區(qū)以及中小型豬場(chǎng)的PRRSV、PRV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、CSFV 和PCV2 等病原的感染情況較為嚴(yán)重。玉林市生豬養(yǎng)殖量位于廣西前列，上述幾種主要病毒性疫病的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。為了解玉林市此類病原的感染情況，本研究對(duì)2016—2019 年從玉林市規(guī)模化豬場(chǎng)采集的血清和組織樣本進(jìn)行了CSFV、PRRSV、PCV2 和PRV 4 種病原的血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，以期為玉林市乃至整個(gè)廣西地區(qū)主要豬病毒性疫病的有效防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 2016—2019年，每年春季（4月）、秋季（10 月）集中免疫3 周左右進(jìn)行采樣。采樣時(shí)，按照《自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳關(guān)于印發(fā)2019 年廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃的通知》（桂農(nóng)廳發(fā)〔2019〕129 號(hào)）和玉林市動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃要求（玉市農(nóng)發(fā)〔2019〕22 號(hào)），對(duì)玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）規(guī)模豬場(chǎng)，采取簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式，按比例分配到各縣（市、區(qū)），每個(gè)場(chǎng)采集20～30 份血清樣品。每份血清樣品不少于2 mL，并且清亮、無融血。3 年間共檢測(cè)284 個(gè)場(chǎng)次的6 954 份血清樣品。其中，2019 年由于開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估抽樣檢測(cè)，采集的血清樣品數(shù)有所減少。

1.1.2 組織樣本 按照1.1.1 中相關(guān)文件要求，以玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）母豬存欄200 頭以上規(guī)?；i場(chǎng)的臨床健康豬群為目標(biāo)群，根據(jù)各縣（市、區(qū)）目標(biāo)群數(shù)量，按比例確定采樣豬場(chǎng)數(shù)量后，采取簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式確定抽取的場(chǎng)群，每個(gè)場(chǎng)群采集樣品不少于10 份（屠宰時(shí)采集），具體數(shù)量按照?qǐng)鋈阂?guī)模確定。2016—2019 年，在玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）采集113 個(gè)場(chǎng)次的1 539 份臨床健康豬群組織（肺臟、淋巴結(jié)、脾臟）樣品。在此期間，還有自主送檢的249 個(gè)場(chǎng)次536 份病死豬組織病料（肺臟、淋巴結(jié)、脾臟）樣品。每份樣品包括頜下淋巴結(jié)2個(gè)、脾臟50 g 和肺臟50 g。對(duì)上述組織樣品均進(jìn)行CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 檢測(cè)。

1.1.3 主要試劑 CSFV、PRRSV、PRV、PCV2抗體檢測(cè)試劑盒，均購自北京金諾百特科技有限公 司；DL 2 000 DNA Marker、PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0 plus dye）、PrimeScriptTMOne step RT-PCR Kit Ver.2，均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA 快速抽提試劑盒，為TIANGEN 生物科技有限公司的TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 抽提試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)CSFV、PRRSV、PCV2、PRV-gB 血清抗體，采用PCR/RTPCR 方法進(jìn)行上述4 種病原的抗原檢測(cè)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的各病毒基因序列，利用Meg Align（DNAstar），Primer Premier 7.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。上述引物均送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 組織樣本處理及病毒DNA/RNA 提取 取送檢的組織樣本（每頭豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟混合為1 份樣品），按質(zhì)量比1:5 加入生理鹽水，在組織研磨儀內(nèi)研磨，反復(fù)凍融3 次，4 ℃條件下10 000 r/min 離心5 min 后取上清，進(jìn)行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱備用。按照TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA 抽提試劑盒說明書，對(duì)樣品上清進(jìn)行DNA/RNA 提取，對(duì)所獲得的DNA/RNA直接進(jìn)行PCR/RT-PCR 檢測(cè)或置于-70 ℃保存。

1.2.4 CSFV 和PRRSV 的RT-PCR 檢測(cè) 利用特異性引物對(duì)提取的樣品RNA 進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR 擴(kuò)增體系25.0 μL：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，RNA 模板5.0 μL，ddH2O 5.5 μL。RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃30 min，94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，按表1 退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

表1 引物信息

1.2.5 PCV2、PRV 的PCR 檢測(cè) 利用特異性引物對(duì)提取的樣品DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系25.0 μL：PremixTaq12.5 μL，DNA 模板5.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，按表1 退火溫度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳及結(jié)果觀察同1.2.4。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS 軟件（卡方檢驗(yàn)）進(jìn)行顯著性差異分析，判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR/PCR 檢測(cè)

各病原經(jīng)特異性引物擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物電泳后，在紫外線光下可觀察到大小分別為288 bp（CSFV）、738 bp（PRRSV）、1 154 bp（PCV2）和217 bp（PRV）的目的條帶（圖1），均與預(yù)期片段大小相符，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)

2.2.1 不同年份 統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：2016—2019 年CSFV、PCV2、PRV-gB 場(chǎng)群平均抗體陽性率以及個(gè)體平均抗體陽性率均在70% 以上。其中：CSFV、PCV2 抗體陽性率整體呈上升趨勢(shì)，2018年以來CSFV 保持在90%以上，PCV2 在80%以上；PRRSV 抗體陽性率總體偏低，但2019 年場(chǎng)群平均抗體陽性率以及個(gè)體平均抗體陽性率均在90%以上；PRV-gB 抗體陽性率總體較為平穩(wěn)，抗體陽性率大多維持在80%～88%。

圖1 4 種病原RT-PCR/PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 不同地區(qū) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：2016—2019 年，玉林市各縣（市、區(qū)）的CSFV 群體及個(gè)體抗體陽性率均在75%以上，其中北流市場(chǎng)群陽性率（80.00%）和個(gè)體陽性率（78.06%）最低，與其他地區(qū)有顯著差異（P＜0.05）；北流市、福綿區(qū)、玉州區(qū)的PRRSV 場(chǎng)群抗體陽性率未超過70%，顯著低于其他地區(qū)（P＜0.05）；玉林市各縣（市、區(qū)）的PCV2 抗體陽性率均在70%以上，無顯著性差異（P＞0.05）；福綿區(qū)的PRV-gB 抗體陽性率最低（P＜0.05），未達(dá)到70%，其他6個(gè)地區(qū)均在70%以上。

表2 2016—2019 年玉林市規(guī)?；i場(chǎng)主要病毒性疫病抗體陽性率統(tǒng)計(jì) %

2.3 病原學(xué)檢測(cè)

2.3.1 不同年份 統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4～5）顯示：2016—2019 年，規(guī)模豬場(chǎng)健康豬及病死豬組織樣品中均檢出CSFV、PRRSV、PCV2 和PRV。其中：健康豬組織樣品中的PRRSV 和PCV2 抗原陽性率較高（場(chǎng)群總抗原陽性率分別為27.43%、26.55%，個(gè)體總抗原陽性率分別為6.37%、4.81%），其次是PRV（分別為12.39%、2.92%），CSFV 最低（分別為4.42%和0.58%）；不同年份的健康豬組織樣品中，CSFV 抗原陽性率基本穩(wěn)定，PRRSV、PRV波動(dòng)較大，PCV2 有加重趨勢(shì)。病死豬組織樣品中，各病原的分布規(guī)律和變化趨勢(shì)與健康豬組織基本相符，但陽性檢出率均高于健康豬。

表3 各縣（市、區(qū)）規(guī)?；i場(chǎng)主要病毒性疫病抗體陽性率統(tǒng)計(jì) %

表4 不同年份規(guī)模化豬場(chǎng)健康豬組織樣品檢測(cè)結(jié)果 %

表5 不同年份規(guī)?；i場(chǎng)病死豬組織樣品檢測(cè)結(jié)果 %

2.3.2 不同地區(qū) 健康豬群統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）顯示：玉林市各縣（市、區(qū)）CSFV 場(chǎng)群和個(gè)體抗原陽性率均無顯著差異（P＞0.05），PRRSV、PCV2 和PRV 的場(chǎng)群抗原陽性率無顯著差異（P＞0.05），但個(gè)體抗原陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。病死豬群統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表7）顯示：各縣（市、區(qū)）的CSFV、PCV2 以及PRV的場(chǎng)群和個(gè)體抗原陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各縣（市、區(qū)）的PRRSV 場(chǎng)群抗原陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但個(gè)體抗原陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表6 不同地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)健康豬組織樣品檢測(cè)結(jié)果 %

表7 不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)病死豬組織樣品檢測(cè)結(jié)果 %

3 討論

豬瘟（CSF）具有高度傳染性，目前主要通過接種疫苗防制[9]。自2007 年以來，隨著我國(guó)CSF強(qiáng)制免疫的全面鋪開，CSF 得到了有效控制，因而在2017 年國(guó)家取消了CSF 強(qiáng)制免疫，實(shí)施差別化免疫策略[10]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016—2019 年廣西玉林市CSFV 抗體一直保持較高水平，且整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明玉林市規(guī)模化豬場(chǎng)CSF 免疫預(yù)防工作效果良好，取消強(qiáng)制免疫對(duì)其影響不大，規(guī)模豬場(chǎng)仍重視CSF 的免疫預(yù)防。但玉林市各縣（市、區(qū)）仍有CSFV 抗原被檢出，臨床健康豬場(chǎng)群和個(gè)體的抗原陽性率分別為3.13～5.88%和0.30～1.11%，說明玉林市的規(guī)?；i場(chǎng)還存在一定程度的顯性及隱性感染，存在疫情散發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能有以下原因：（1）部分豬場(chǎng)免疫程序不合理導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降或免疫有效期縮短；（2）過分強(qiáng)調(diào)季節(jié)性免疫或春秋防集中性免疫，而忽視了夏冬季節(jié)出生的豬只，導(dǎo)致漏免。因此，各地區(qū)各豬場(chǎng)應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況，制定科學(xué)合理的免疫防控方案，并定期進(jìn)行抗體水平監(jiān)測(cè)，以降低CSF 發(fā)生概率。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）目前主要采取疫苗免疫防控，但防控效果不理想，病毒感染長(zhǎng)期存在[11-12]。唐小明等[13]認(rèn)為，這是由于PRRSV變異快，不同地區(qū)流行毒株存在一定差異所致。吳佳俊等[14]通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，2015 年我國(guó) PRRS疫情出現(xiàn)了反彈，種豬場(chǎng)群與個(gè)體陽性率均出現(xiàn)了大幅上升。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016—2019 年玉林市豬場(chǎng)的場(chǎng)群免疫抗體陽性率連續(xù)3 年低于70%，說明PRRS 免疫效果欠佳。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)PRRSV 病原檢出率較高，并且呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。由此說明，廣西玉林市PRRS 疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。從區(qū)域分布來看，博白、陸川、興業(yè)等主要生豬養(yǎng)殖縣的PRRS 病原檢出率相對(duì)較高。究其原因可能是這些縣區(qū)生豬養(yǎng)殖量大且以小散養(yǎng)戶為主，散養(yǎng)戶與規(guī)模場(chǎng)相互交織分布，而大部分小散養(yǎng)戶管理不規(guī)范，生物安全防控意識(shí)薄弱。因此，玉林市規(guī)模豬場(chǎng)在當(dāng)前的養(yǎng)殖大環(huán)境下，單純依靠疫苗免疫難以達(dá)到預(yù)期的保護(hù)效果，必須加強(qiáng)生物安全防控，采取嚴(yán)格的生物安全措施、科學(xué)合理的免疫程序、有效的凈化根除計(jì)劃等，只有這樣才能達(dá)到良好的防控效果[15]。同時(shí)，玉林市各縣（市、區(qū)）疫病防控相關(guān)部門需要加強(qiáng)生物安全防控知識(shí)培訓(xùn)與宣傳，提高各養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）防控意識(shí)。

圓環(huán)病毒病是危害廣西養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。PCV2 可引起斷仔奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，可致斷奶仔豬和育肥豬出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢和間質(zhì)性肺炎等癥狀，可經(jīng)呼吸道感染不同日齡的豬，少數(shù)懷孕母豬感染后可經(jīng)胎盤垂直感染給仔豬[16-17]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，玉林市規(guī)?；i場(chǎng)的PCV2 免疫抗體雖能達(dá)較高水平，但病原檢出率也較高，僅次于PRRSV，與之前黎軍等[4]、段群棚等[7]報(bào)道的PCV2 在廣西地區(qū)全年的發(fā)病率均處于較高水平，且夏季發(fā)病率最高的結(jié)果相符。這可能與廣西夏季持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)及豬群密度過大等有關(guān)，即豬群在高濕悶熱的環(huán)境下容易產(chǎn)生應(yīng)激，導(dǎo)致豬群整體免疫力下降，患病率隨之升高。此外，PCV2 屬于免疫抑制性病原，豬本身體質(zhì)會(huì)對(duì)疫苗免疫效果有一定影響。因此，在做好PCV2 免疫接種的同時(shí)，需重視豬群飼養(yǎng)管理，進(jìn)行綜合防控，這樣才能取得理想的疫病防控效果。

豬偽狂犬病（PR）是我國(guó)目前豬群疫病中優(yōu)先凈化的病種之一，且已取得了一定的防控成效，其中種豬群凈化是防控關(guān)鍵[13，18]。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然2016—2019 年廣西玉林市PR 免疫效果較好，但病原陽性率波動(dòng)較大，說明玉林市較多豬群仍受PRV 威脅。造成這一現(xiàn)象的原因一方面可能是引種問題，另一方面可能是PRV 變異株的出現(xiàn)，造成傳統(tǒng)疫苗保護(hù)率下降。因此，目前防控和凈化PR 的關(guān)鍵問題是種豬PR 凈化，對(duì)豬場(chǎng)新引進(jìn)的種豬應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)定期做好抗原抗體監(jiān)測(cè)工作[19]。

目前，對(duì)于規(guī)?；i場(chǎng)來說，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 都有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，要定期對(duì)這些重要病原進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰帶毒豬；在發(fā)現(xiàn)疫情后要及時(shí)上報(bào)，迅速隔離，盡快確定致病源，并對(duì)健康豬群進(jìn)行緊急免疫接種，病死豬全部深埋并無害化處理，有條件的豬場(chǎng)可以將陽性豬全部淘汰，以控制傳染源，逐步凈化豬群[20]；堅(jiān)持豬群全進(jìn)全出制度，實(shí)施封閉式管理，以有效控制豬傳染病的發(fā)生及傳播[21]。本次調(diào)查所采集樣品來自玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）的部分規(guī)模豬場(chǎng)，在一定程度上可以反映本市規(guī)模豬場(chǎng)4 種疫病的免疫水平及感染狀態(tài)。本調(diào)查的局限性就在于采樣過程中場(chǎng)內(nèi)抽樣并不能做到完全隨機(jī)，且抽樣場(chǎng)群數(shù)量依照計(jì)劃按比例分配，未進(jìn)行系統(tǒng)采樣設(shè)計(jì)，這樣可能會(huì)出現(xiàn)抽樣系統(tǒng)誤差。同時(shí)，抗體檢測(cè)無法區(qū)分是免疫抗體還是感染抗體，也會(huì)導(dǎo)致本次結(jié)果出現(xiàn)偏差。

4 結(jié)論

監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，2016—2019 年玉林市規(guī)?；i場(chǎng)CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 4 種病原的免疫抗體保護(hù)水平總體較高，但部分縣（市、區(qū)）水平偏低，且均存在豬群帶毒現(xiàn)象，因此疫病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。因此，各縣（市、區(qū)）要根據(jù)本地養(yǎng)殖情況及疫病流行情況，制定嚴(yán)格合理的免疫計(jì)劃，加強(qiáng)綜合防控，持續(xù)做好監(jiān)測(cè)，切實(shí)做好豬場(chǎng)疫病防控。