華煒聰　鄧在春　張筠　朱丹萍　陳眾博

[摘要] 耐多藥腸桿菌的出現(xiàn)嚴重威脅著人類健康。AcrAB-TolC外排泵的過量表達是引起腸桿菌多重耐藥的主要機制之一，其主要由周質融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質子轉運子AcrB構成，受整體調控因子、局部調控因子以及環(huán)境中的化學物質等調節(jié)。對AcrAB-TolC外排泵的研究，不僅有助于闡明相關耐藥本質，還有助于研制有臨床意義的外排泵抑制劑（EPIs），為解決腸桿菌多重耐藥問題提供新思路。本文對AcrAB-TolC外排泵的結構、調控等方面的研究進展作一綜述。

[關鍵詞] AcrAB-TolC;外排泵;腸桿菌;多重耐藥

[中圖分類號] R378.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2021）04-0184-05

Research progress of AcrAB-TolC efflux pump in multidrug resistant enterobacteria

HUA Weicong1 ? DENG Zaichun1， 2 ? ZHANG Yun2 ? ZHU Danping2 ? CHEN Zhongbo1， 2

1.Ningbo University School of Medicine， Ningbo ? 315020， China; 2.Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University， Ningbo ? 315020， China

[Abstract] The emergence of multidrug-resistant enterobacteria poses a serious threat to human health. Overexpression of AcrAB-TolC efflux pump is one of the main mechanisms that causes multidrug resistance in enterobacteria. It is mainly composed of periplasmic fusion protein AcrA， outer membrane channel protein TolC and drug proton transporter AcrB， and is regulated by global regulatory factors， local regulatory factors and chemicals in the environment. The study of AcrAB-TolC efflux pump is not only helpful to clarify the nature of drug resistance， but also helpful to develop clinically significant efflux pump inhibitors（EPIs）， providing new ideas for solving the problem of multiple drug resistant enterobacteria. This article makes a review on the research progress of the structure and regulation of AcrAB-TolC efflux pump.

[Key words] AcrAB-TolC; Efflux pump; Enterobacteria; Multidrug resistance

隨著抗生素使用的日益增多，細菌多重耐藥問題已成為全球公共衛(wèi)生危機[1-2]。多重耐藥是指細菌對三種及以上的抗生素同時耐藥。目前臨床觀察到的重癥細菌感染中，多重耐藥的腸桿菌較多。藥物外排泵是腸桿菌產生多重耐藥的主要機制之一[1，3]，其化學本質為蛋白質?？股鼗蛴卸净衔锎嬖跁r，外排作用可能是腸桿菌應激反應中最快和最有效的抵抗機制[3]。革蘭陰性桿菌中最具臨床意義的外排泵是耐藥結節(jié)細胞分化（Resistance nodulation-cell division，RND）家族的成員，能識別廣泛的底物，與多重耐藥相關。這些外排泵以三聚體方式存在，橫跨細菌內外膜;其中，AcrAB-TolC系統(tǒng)是最經典的RND家族，多存在于腸桿菌科細菌[4]。腸桿菌中存在許多膜孔蛋白，可以根據(jù)分子的大小、形狀和電荷等選擇性地允許分子（包括抗生素）被動擴散[5]。當細胞內的藥物濃度聚集達到一定數(shù)值時，AcrAB-TolC外排泵以質子驅動力為能力將其泵出，從而增強了細菌在不良環(huán)境中的生存能力。因此，細胞內的藥物濃度也是藥物流入和流出之間的平衡點。AcrAB-TolC系統(tǒng)可能在細菌耐藥質粒傳播方面有一定的推動作用[6]。此外，其也是大多腸桿菌毒力和生物膜形成所必需的[7-8]。對部分細菌來說，該泵表達水平決定多重耐藥表型，泵失活則菌株可從多重耐藥變回敏感。所以，進一步研究AcrAB-TolC泵對臨床具有重要意義。若能研制出有臨床價值的外排泵抑制劑，將極大幫助臨床醫(yī)生的用藥，恢復現(xiàn)有抗生素的臨床療效，降低多重耐藥細菌感染所致的死亡率，是細菌多重耐藥問題上的重大突破。

1 AcrAB-TolC外排泵的結構

1.1 AcrAB-TolC外排泵結構蛋白的組成

AcrAB-TolC外排泵主要由周質融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質子轉運子 AcrB構成。外排功能的實現(xiàn)需要三者共同參與，缺一不可。否則，即使存在其他能夠增強外排泵功能的機制，細菌仍然不會產生耐藥性。不過，Saw等[9]的實驗側面印證了Doumith等實驗結論“在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分離株中acrB mRNA轉錄物的表達沒有增加”，說明AcrAB-TolC系統(tǒng)可能并不是腸桿菌必需的耐藥機制。

AcrA、AcrB和TolC蛋白以三聚體的形式存在。其中AcrA蛋白被認為在膜融合中起到了一定作用，其位于周質間隙中，其C端肽鏈連接著內膜上AcrB，N端肽鏈則在C端的協(xié)助下與外膜通道蛋白TolC相互作用[10]。AcrA近膜端結構域的構象變化對AcrAB- TolC的組裝至關重要，可以作為開發(fā)新型泵抑制劑的靶點[11]。AcrA蛋白缺失時，可由其同源周質融合蛋白AcrE補充，兩者同源性為68.5%，功能相似。相關實驗證明，若要以周質融合蛋白為泵抑制劑的藥物靶點，必須同時作用于AcrA和AcrE蛋白才有效[12]。AcrB蛋白位于細胞內膜，其能捕獲來自細胞周質的物質，并將有害的物質排出細胞，稱為細菌的“吸塵器”[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，AcrB蛋白缺失后，與其同源的RND外排泵系統(tǒng)如AcrD、AcrF蛋白會代償性產生，這樣既可以保證細菌細胞膜的結構完整，又能維持外排功能[14]。但若AcrB蛋白只是處于失活狀態(tài)，則不會發(fā)生以上蛋白的代償性生成。不過，AcrD和AcrF蛋白的生成水平低至無法檢測，這意味著實際上，AcrD和AcrF蛋白無法補救AcrB蛋白缺失致外排功能喪失后所帶來的影響[5]。TolC蛋白位于細胞外膜，為排出的藥物和毒素提供了一條穿越細菌外膜的途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，細菌細胞的藥敏性與TolC變異體的濃度變化不相匹配。無論實驗組細胞的TolC蛋白濃度低于還是高于對照組的TolC蛋白濃度（濃度相差至少10倍），大部分常用抗生素的MIC仍保持不變，說明即使將TolC蛋白抑制到極低濃度，也無法限制外排泵的藥物外排能力，從中可推測只有一小部分TolC蛋白參與外排作用[15]。所以對新藥研發(fā)來說，TolC蛋白并不是抑制多藥外排的良好靶點。

1.2 AcrAB-TolC外排泵的作用過程

革蘭陰性桿菌由于有雙膜結構，實現(xiàn)外排途徑較復雜。Shi等[16]認為，AcrA-TolC泵的開啟和抗生素的泵出是一個短暫的過程，大部分時間組件均處于封閉狀態(tài)，而不是活躍狀態(tài)。通過斷層掃描數(shù)據(jù)進一步揭示AcrAB-TolC外排泵的組裝順序。首先，AcrB與AcrA蛋白結合形成二聚體AcrAB。然后，AcrA改變構象以嵌合TolC。一旦TolC與AcrAB二聚體結合，組裝完全的外排泵保持靜止狀態(tài)。當AcrB遇到藥物分子時，該泵開放通道，沿通道長軸收縮，使底物（藥物）通過通道排出細胞，待底物排出后立即關閉[13，17]。不同于尋常那些狹小、緊密貼合的結合位點，AcrAB-TolC外排泵轉運蛋白結合藥物分子的位點通常較寬大，以允許用更少的自由能去容納更多的底物[18]。AcrAB-TolC外排泵大多為非特異性的，可以排出多種不同作用機制和不同作用位點的抗生素，但也有少數(shù)是特異性的，如四環(huán)素外排泵。

2 AcrAB-TolC外排泵的調控因子

AcrAB-TolC外排泵的調控分為整體調控和局部調控兩種，整體調控因子有MarA、RamA、Rob、SoxS等，局部調控因子主要有AcrR，本文主要對整體正調控因子MarA和RamA及局部負調控因子AcrR作一綜述。

2.1 MarA蛋白對AcrAB-TolC外排泵的正向調節(jié)

MarA蛋白是一種整體轉錄激活子，增加AcrAB-TolC泵的外排作用，屬于AraC/XylS家族蛋白的成員。在操縱子mar家族中，除marA外，參與多重耐藥機制的還有marR、marB。marA基因雖然總是被MarR抑制，但其編碼的MarA蛋白能夠與marR基因阻遏位點上游的DNA序列（即marbox）結合以發(fā)揮正反饋作用，從而抑制marR基因并激活marA基因。MarR蛋白除了可以抑制acrAB基因表達，在沒有任何環(huán)境信號影響時，也可阻止自身轉錄。marB基因可增加marA基因的表達水平，在轉錄后起作用，具體機制不明[19]。

至今，仍有不少學者認為，Mar突變體僅僅是通過促使AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)過度表達而引起多重耐藥。其實不然，mar系統(tǒng)對其他基因也有調節(jié)作用，有些還參與了對特定藥物的耐藥機制。Sharma等[20]通過實驗鑒定了33個受MarA蛋白調控的靶基因，發(fā)現(xiàn)除acrAB和tolC基因外，MarA蛋白還能上調在脂質轉運、DNA損傷修復和轉錄調控中起作用的基因，從而減少抗生素滲入和DNA損傷。

2.2 RamA蛋白對AcrAB-TolC外排泵的正向調節(jié)

RamA蛋白是MarA蛋白的同系物，也屬于AraC/XylS家族。與MarA一樣，RamA通過直接結合acrAB和tolC基因位點上游的退化核苷酸序列（即rambox）而激活acrAB和tolC[5]。ramR基因位于ramA的上游，其能抑制ramA的轉錄，同樣，RamA蛋白也能抑制RamR蛋白的結合。當ramR基因缺失或失活時，RamA蛋白則會過量表達，引起多重耐藥[21-23]。多數(shù)AcrAB-TolC外排泵的底物無法誘導RamA蛋白的表達，而當AcrB蛋白失活后，RamA可呈四倍速增長。當AcrAB-TolC泵部分失活或加入外排泵抑制劑時，RamA的表達量明顯升高[19，24]。沙門氏菌在RamA蛋白缺失的情況下，篩選出MDR突變體很困難，這意味著，RamA在沙門菌多重耐藥機制中是主要的調控因子[25]。不過少數(shù)腸桿菌中不存在RamA蛋白，如大腸埃希菌。

氯丙嗪能以濃度依賴的方式誘導RamA蛋白，Ricci等[26]先通過氯丙嗪誘導RamA蛋白過量表達，再去除氯丙嗪，發(fā)現(xiàn)RamA蛋白的量立刻恢復至誘導前的水平，推測過高水平的RamA蛋白或過量的AcrAB-TolC系統(tǒng)可能對細菌有害，且認為有另一種調節(jié)機制在維持平衡。外排泵的高能量需求是其不過度表達的可能因素。進一步的實驗表明，RamA蛋白的量能夠恢復到誘導前的水平是通過Lon蛋白酶的調節(jié)。該酶可以水解RamA、MarA蛋白等，若Lon突變可導致AcrAB蛋白和多重耐藥的增加[19]。

2.3 AcrR蛋白對AcrAB-TolC外排泵的負向調控

局部調控因子AcrR抑制acrAB基因的過表達[27]。acrR基因位于acrAB操縱子的上游，與acrAB基因轉錄方向相反。AcrR蛋白N端存在DNA結合的螺旋-轉角-螺旋結構基序，C端存在特異性配體結合序列。毒性化合物能與AcrR蛋白的C端結構域結合，引起其N端結構域的構象改變，AcrR蛋白從DNA中釋放，使靶基因（即acrAB基因）得以轉錄[28]。反之，AcrR蛋白再與acrAB基因調控區(qū)特異性結合發(fā)揮泵抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，AcrR蛋白缺失除了增加耐藥性，還可提高細菌的活性、黏附、毒力，促進生物膜的形成等[27]。同MarR蛋白一樣，AcrR蛋白也能抑制自身的合成。

3 環(huán)境因素對外排泵的調控作用

大量環(huán)境因素也能調控外排泵系統(tǒng)。腸桿菌大多存在于宿主消化道中，常與膽汁、脂肪酸和陽離子肽等環(huán)境誘導因子接觸，這些環(huán)境誘導因子與Rob蛋白結合從而誘導AcrAB蛋白過表達，以助腸桿菌生存[19]。Urdaneta等[29]實驗證明，亞致死濃度的膽鹽誘導acrAB基因轉錄的上調，對腸桿菌早期適應宿主環(huán)境至關重要。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，在缺少單個或多個外排泵系統(tǒng)的沙門氏菌突變體中，只有AcrAB蛋白缺失的突變體無法在亞致死濃度的膽鹽環(huán)境下生長，揭示了AcrAB蛋白對細菌膽汁耐受的重要性。另有研究證實，大量環(huán)境刺激可以增加ramA基因的表達以激活AcrAB蛋白，如細菌代謝產物吲哚[30]、苯噻嗪、血清素攝取抑制劑、氯丙嗪等抗精神藥物、生物殺菌劑、某些抗生素和溫度[24]。

4 藥物治療后的細菌外排作用可能更強

Adler等[31]將大腸埃希菌暴露于美羅培南或厄他培南中進行60次傳代，通過基因組測序后發(fā)現(xiàn)，AcrAB-TolC介導的外排作用較前增強。不止體外研究結果如此，臨床中亦有文獻報道，來源于同一患者的沙門氏菌，抗感染治療失敗后的菌株較治療前的菌株外排泵功能更強，AcrB蛋白的表達更多。Blair等[32]進一步對AcrB蛋白基因測序發(fā)現(xiàn)，藥物誘導株中甘氨酸替代了第288位的天門冬氨酸，推測該突變使AcrB蛋白結合位點結構發(fā)生改變。雖然這不能代表此種突變的菌株對所有抗生素的外排功能都增強，但也提示不合理的抗感染治療可能會加重耐藥問題。

5 外排泵抑制劑的研發(fā)意義

在新型藥物的研制中，外排泵是一個有潛力的突破點[33]。經典的抗耐藥菌藥物β-內酰胺酶抑制劑，雖在臨床上應用價值很大，但只針對于產β-內酰胺酶的細菌。而外排泵抑制劑（Efflux pump inhibitors，EPIs）可能同時增加多種細菌對多種抗生素的敏感性，這是因為外排泵絕大多數(shù)是非特異性的，廣泛存在于各種生物體中。EPIs還可以減少細菌篩選耐藥突變體的機會[34]。有實驗[8]證明，EPIs具有阻止藥物排出和干擾生物膜形成的能力，從而增強抗生素作用，逆轉細菌的耐藥性。理想的EPIs能夠抑制存在于各種病原體且來自不同家族的外排泵，但這極具挑戰(zhàn)性。因此，針對特定的外排泵家族來設計窄譜EPIs可能是最佳的選擇。不過，有臨床價值的EPIs除了能有效抑制外排泵的功能，還需滿足毒性低、與抗生素具有協(xié)同作用、不對缺乏外排泵的敏感菌株產生影響等條件。

EPIs可通過干擾外排泵的表達和組裝、阻斷能量來源、阻礙底物通過外排通道等機制發(fā)揮作用。最早研發(fā)的可以對抗革蘭陰性菌中RND家族泵的抑制劑是PAβN（Phe-Arg-β-naphthylamide，又稱MC-207110），其機制是競爭性結合外排泵相應位點以阻止其他底物與該位點的結合，但因毒性問題和低穩(wěn)定性限制了其臨床的應用[7]，與其相同機制的還有喹啉衍生物、MBX2319[34]等;CsrA可以作為抑制劑，使acrAB基因轉錄不穩(wěn)定，影響AcrAB-TolC系統(tǒng)的功能[5];反義技術如肽結合磷酸二胺酯嗎啡低聚物（PPMOs）可以抑制外排泵的表達，可能對大環(huán)內酯類或氟喹諾酮類藥物的治療有利[35];預設計錨蛋白重復蛋白（Designed ankyrin repeat proteins，DARPins）可抑制AcrA和AcrB蛋白的相互作用[11];羰基氰間氯苯腙（CCCP）主要通過阻斷外排泵的能量來源發(fā)揮抗耐藥作用[36];還有一些偶然發(fā)現(xiàn)的天然EPIs，如糖槭中提取的富酚楓糖漿提取物[34]，目前機制不明。此外，已在臨床上應用的藥物也是EPIs的來源。其中，抗癌藥物有望成為EPIs的候選藥物。因細菌細胞和癌細胞均能產生對有毒化合物的抗性，而這種抗性通常是由于外排泵的過表達造成的[37]。盡管發(fā)現(xiàn)了大量潛在的外排泵抑制劑，不幸的是，尚沒有一種被批準用于臨床[38]，故EPIs的研發(fā)工作仍任重而道遠。

需要注意的是外排泵抑制劑不能濫用。Saw等[9]發(fā)現(xiàn)，加入外排泵抑制劑PAβN反而會增加細菌對某些抗生素的耐藥。所以今后臨床上對外排泵抑制劑的合理應用十分重要，應仔細評估后再選擇，以確保不會適得其反。

腸桿菌為適應不良環(huán)境，通過外排泵以排出有毒物質或代謝產物，形成多重耐藥現(xiàn)象。盡管臨床上可使用的抗菌藥物有數(shù)百種，但針對多重耐藥甚至全耐藥菌，仍常面臨著無藥可用的境地，且這種情況隨著抗菌藥物的廣泛使用愈發(fā)常見。眾所周知，一款新型抗菌藥物的研制及推廣需要花費的時間和經費是龐大的。如果換種思路，將研究放在泵抑制劑的研發(fā)上，輔助現(xiàn)有抗生素的抗菌作用，可以恢復多種抗菌藥物的臨床療效，也極大節(jié)省了緊張的醫(yī)療資源。盡管對AcrAB-TolC系統(tǒng)已進行不少的研究，但有價值的臨床應用尚未發(fā)現(xiàn)，故仍需要更多的深入研究。

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（收稿日期：2020-03-02）