劉星，秦楠，李銘柔，王小敏，郭麗麗

山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院（晉中 030619）

隨著人們生活壓力的增大及社會(huì)節(jié)奏的加快，我國(guó)的失眠人群數(shù)量不斷擴(kuò)大，改善睡眠的產(chǎn)品開發(fā)與研究備受消費(fèi)者及科研工作者的關(guān)注。酸棗仁是一種常見的藥食兩用中藥，為鼠李科植物酸棗的種子，主要功能為調(diào)節(jié)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜催眠、滋養(yǎng)肝臟，在臨床及生活中多用于調(diào)節(jié)失眠[1]。酸棗仁是改善睡眠類產(chǎn)品中較為常見的一種原料，現(xiàn)代研究已表明其所含的皂苷類化合物是其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的主要有效成分。越來越多的相關(guān)產(chǎn)品趨向于以酸棗仁提取物為原料來開發(fā)功能食品，而不是采用簡(jiǎn)單的原藥材打粉的初加工形式。然而，酸棗仁水提物或醇提物顏色較深，大量色素的存在會(huì)影響最終產(chǎn)品的感官及后續(xù)的質(zhì)量分析，有必要對(duì)酸棗仁提取物進(jìn)行脫色。

活性炭吸附是常見的、較為成熟的一種脫色方法。活性炭表面積大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、吸附性高，能與溶液中的色素和雜質(zhì)分子充分接觸，從而達(dá)到脫色的目的[2]。試驗(yàn)采用活性炭吸附法對(duì)酸棗仁水提物的脫色工藝進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，以期為酸棗仁及其組方方劑在功能食品開發(fā)與研究中的精深應(yīng)用奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

酸棗仁（產(chǎn)地山西，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定，亳州成源中藥飲片有限公司）；川芎、茯苓、甘草、知母（經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定，河北藥香商貿(mào)專業(yè)中藥材批發(fā)部）；酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)181205，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；粉末活性炭（濟(jì)南恒晟環(huán)?？萍加邢薰荆?；甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純。

ULTRA-3600紫外-可見分光光度計(jì)（北京普源精電科技有限公司）；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；KW-1000DC數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AR223CN分析天平（美國(guó)奧豪斯儀器有限公司）；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁水提物的制備[3]

稱取適量酸棗仁，加10倍量水浸泡50 min，煎煮40 min，煎煮2次，合并煎煮液得酸棗仁水提液。

1.2.2 酸棗仁總皂苷含量的測(cè)定

以酸棗仁皂苷A為對(duì)照品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法測(cè)定酸棗仁總皂苷的含量[4]。準(zhǔn)確吸取20，50，100，150，200，250和300 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.8 mg/mL）或100 μL樣品溶液于10 mL具塞試管中，加熱揮盡溶劑，分別加入1 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和4 mL高氯酸，混勻后于65 ℃水浴中加熱20 min，冰浴冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)吸光度，由回歸方程求得酸棗仁總皂苷的含量。

1.2.3 脫色工藝的單因素試驗(yàn)

取若干小錐形瓶，分別向其中加入20 mL酸棗仁水提液，在一定的活性炭用量（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%）、脫色溫度（20，30，40，50和60℃）、脫色時(shí)間（5，10，15，20和25 min）和攪拌速度（90，120，150，180，210和240 r/min）下對(duì)酸棗仁水提液進(jìn)行脫色，抽濾得濾液后分別測(cè)定皂苷保留率和脫色率，并計(jì)算綜合評(píng)分，其中各因素固定水平為活性炭用量0.8%、脫色溫度20 ℃、脫色時(shí)間15 min、攪拌速度120 r/min。

脫色工藝中所用的活性炭預(yù)處理方法[5]：將活性炭用5%鹽酸溶液浸泡過夜，沸煮30 min，用去離子水洗至中性，于120 ℃烘干備用。

1.2.4 脫色工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究活性炭用量（A）、脫色溫度（B）和脫色時(shí)間（C）3個(gè)因素之間的交互作用，以由脫色率和皂苷保留率組成的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用Design-Expert軟件，應(yīng)用Box-Behnken原理進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)（共17組），從而確定最優(yōu)的脫色工藝。響應(yīng)面因素水平編碼表如表1所示。

綜合評(píng)分采用加權(quán)法，總分100分，將脫色率和皂苷保留率兩者的權(quán)重值均設(shè)為50，按照式（1）計(jì)算綜合評(píng)分。

1.2.5 脫色效果指標(biāo)的測(cè)定

通過測(cè)定脫色率和皂苷保留率綜合評(píng)價(jià)脫色效果。脫色率的測(cè)定方法：取20 mL酸棗仁水提液加入適量活性炭進(jìn)行脫色，抽濾分離活性炭后得脫色后濾液，在410 nm處分別測(cè)定脫色前后水提液的吸光度，按式（2）計(jì)算脫色率[6]：

皂苷保留率的測(cè)定方法：取20 mL酸棗仁水提液加入適量活性炭進(jìn)行脫色，抽濾分離活性炭后得脫色后濾液，將該濾液置于水浴鍋中濃縮10倍后作為脫色后樣品溶液。同理，從等量酸棗仁水提液中制得脫色前樣品溶液，然后按1.2.2小節(jié)測(cè)定脫色前后水提液中的總皂苷含量，并按式（3）計(jì)算皂苷保留率[6]。

1.2.6 脫色工藝的初步應(yīng)用

鑒于采用組方方劑是開發(fā)功能保健食品的一種有效途徑，該部分將優(yōu)化出的脫色工藝用于重用酸棗仁的方劑酸棗仁湯[7]中（組方包含酸棗仁15 g、川芎6 g、茯苓6 g、知母6 g、甘草3 g，用于去心火、治失眠），通過比較脫色前后提取液的色澤，評(píng)價(jià)脫色工藝的實(shí)際應(yīng)用效果。按規(guī)定用量將酸棗仁湯各味藥材浸泡50 min后煎煮40 min，煎煮2次，將煎煮液進(jìn)行抽濾，得一定體積脫色前水煎液。然后按前述脫色工藝將22.5 g單味中藥酸棗仁水提物脫色，將此脫色液與其余中藥煎煮液（甘草、知母、茯苓、川芎）混合制成等體積脫色后水煎液。將上述脫色前及脫色后水煎液分別在410 nm處測(cè)定吸光度，采用1.2.5小節(jié)公式計(jì)算得出脫色率，從而評(píng)價(jià)脫色工藝的應(yīng)用效果。

需要說明的是，為保證活性成分的含量不變，此處以脫色前后酸棗仁皂苷的含量相等為依據(jù)，按脫色后66.70%的皂苷保留率計(jì)。經(jīng)計(jì)算可知，脫色后的22.5 g酸棗仁用量相當(dāng)于原方中的15 g酸棗仁用量，因此脫色前后方劑中酸棗仁原料用量有所不同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，結(jié)果以3次平行的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2所述，酸棗仁皂苷A的線性回歸方程為y=0.024 3x+0.034 2（R2=0.993 3），結(jié)果表明酸棗仁皂苷A在質(zhì)量濃度范圍3.20～48.00 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 脫色工藝的單因素試驗(yàn)

2.2.1 活性炭用量對(duì)脫色工藝的影響

如圖1所示，活性炭用量在0.2%～1.0%范圍內(nèi)，脫色率與活性炭用量呈明顯的正比關(guān)系，同時(shí)皂苷保留率與活性炭用量呈反比。這是由于活性炭用量的增加會(huì)增大吸附比表面積，相應(yīng)的吸附量也逐漸升高[8]，使得溶液中的色素分子及皂苷類物質(zhì)越來越多地被吸附，從而出現(xiàn)脫色率不斷上升、皂苷保留率不斷下降的現(xiàn)象。

圖1 活性炭用量對(duì)酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

圖2為活性炭用量對(duì)脫色效果的影響，隨著活性炭用量的增加，脫色效果綜合評(píng)分總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中0.8%活性炭用量下的綜合評(píng)分最高。綜合考慮脫色效果與皂苷保留情況，選取活性炭用量0.6%，0.8%和1.0%作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

圖2 活性炭用量對(duì)酸棗仁水提物脫色效果綜合評(píng)分的影響

2.2.2 脫色溫度對(duì)脫色工藝的影響

如圖3所示，脫色率隨脫色溫度的提高呈先上升后基本不變的趨勢(shì)，這是由于溫度升高，體系的黏度減小，增強(qiáng)了分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)從而加強(qiáng)了色素顆粒與活性炭之間的吸附傳質(zhì)，使脫色率不斷上升[9]。當(dāng)著色物質(zhì)與活性炭的吸附達(dá)到平衡時(shí)，脫色率不再升高。皂苷保留率隨脫色溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是由于20 ℃的較低溫度比較有利于酸棗仁皂苷分子的吸附，使得皂苷保留率較小；隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，其他分子不斷被競(jìng)爭(zhēng)吸附的同時(shí)促進(jìn)了酸棗仁皂苷的解吸，因此30 ℃時(shí)皂苷保留率升高且達(dá)到最大；此時(shí)溶液中皂苷濃度的增大又會(huì)促進(jìn)正吸附，使得溫度繼續(xù)升高時(shí)酸棗仁皂苷保留率發(fā)生下降。

如圖4所示，隨著脫色溫度的提高，脫色效果綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，且脫色溫度為30 ℃時(shí)綜合評(píng)分最高，說明脫色溫度確實(shí)不宜過高，否則在影響脫色效果的同時(shí)還可能引起皂苷類活性物質(zhì)的變化。綜合考慮，選取脫色溫度20，30和40 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

圖3 脫色溫度對(duì)酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

圖4 脫色溫度對(duì)酸棗仁水提物脫色效果綜合評(píng)分的影響

2.2.3 脫色時(shí)間對(duì)脫色工藝的影響

如圖5所示，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率總體呈上升趨勢(shì)，而皂苷保留率呈下降趨勢(shì)。這可能是由于活性炭脫色是一個(gè)動(dòng)態(tài)的吸附與解吸過程，而吸附平衡的達(dá)到需要一定的時(shí)間[10]，在試驗(yàn)所用的25 min脫色時(shí)間范圍內(nèi)，尚未到達(dá)完全吸附平衡，而是處于吸附大于解吸的過程，因而脫色率不斷升高、皂苷保留率不斷下降。

圖5 脫色時(shí)間對(duì)酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

如圖6所示，以脫色時(shí)間20 min的綜合評(píng)分較其他時(shí)間略高，因此將脫色時(shí)間15，20和25 min作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個(gè)水平。

圖6 脫色時(shí)間對(duì)酸棗仁水提物脫色效果綜合評(píng)分的影響

2.2.4 攪拌速度對(duì)脫色工藝的影響

如圖7所示，隨著攪拌速度的逐漸加快，脫色率逐漸增加，當(dāng)攪拌速度達(dá)到150 r/min時(shí)，脫色率大幅提高，之后繼續(xù)增加攪拌速度，脫色率也基本保持不變；皂苷保留率的變化與脫色率正好相反，呈先逐漸下降后基本不變的趨勢(shì)。這可能是由于攪拌速度的增加可以促進(jìn)分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而加快活性炭的吸附作用[11]，使得脫色率不斷上升、皂苷保留率不斷下降；但是當(dāng)吸附接近平衡時(shí)，即使繼續(xù)增大攪拌速度，脫色率和皂苷保留率也無明顯變化。

圖7 攪拌速度對(duì)酸棗仁水提物脫色率與皂苷保留率的影響

如圖8所示，不同攪拌速度對(duì)綜合評(píng)分的影響不是很大，基本都在87分左右，因此在響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)將攪拌速度固定為150 r/min，不再作進(jìn)一步考察。

圖8 攪拌速度對(duì)酸棗仁水提物脫色效果綜合評(píng)分的影響

2.3 脫色工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果及方差分析

表2為17組試驗(yàn)的結(jié)果。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸模型方程：綜合評(píng)分Y=93.47-2.57A+2.24B+1.97C-3.33AB-0.60AC-1.00BC-6.23A2-2.59B2-5.48C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3的回歸模型方差分析可知，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2以及交互項(xiàng)AB對(duì)脫色效果有極顯著的影響（p＜0.01）。F值反映出各因素對(duì)響應(yīng)值影響強(qiáng)弱的順序：A＞B＞C。方程的模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 5，說明模型可解釋97.55%的響應(yīng)值變化，表明模型成立。變異系數(shù)為1.04%，信噪比為22.630＞4，表明試驗(yàn)本身精確度高，結(jié)果可靠性大，回歸方程擬合度良好。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析

通過響應(yīng)面圖可更直觀分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及各因素間的交互效應(yīng)。響應(yīng)面的坡度反映各因素變化對(duì)響應(yīng)值的影響，坡度越陡峭，則響應(yīng)值對(duì)該因素的變化越敏感；坡度越平緩，說明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越小。等高線的形狀及疏密程度則反映了兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，等高線呈橢圓形且曲線密集體現(xiàn)其互作效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，若為圓形且曲線稀疏則影響不顯著[12]。如圖9所示，活性炭用量與脫色溫度的等高線（圖9a）呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著；圖9（b）和圖9（c）的等高線呈圓形，說明活性炭用量與脫色時(shí)間兩因素、脫色溫度與脫色時(shí)間兩因素之間的交互作用不明顯，結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)二次多元回歸方程的擬合，得到最佳脫色工藝的預(yù)測(cè)值：攪拌速度150 r/min、活性炭用量0.72%、脫色溫度36.58 ℃、脫色時(shí)間20.71 min。此時(shí)最佳綜合評(píng)分為94.84分。

2.3.2 最佳工藝條件的驗(yàn)證

根據(jù)最佳工藝預(yù)測(cè)值將試驗(yàn)條件確定為活性炭用量0.70%，脫色溫度36.50 ℃、脫色時(shí)間20.7 min，攪拌速度150 r/min。重復(fù)3次，計(jì)算平均值，此時(shí)脫色率為91.08%，皂苷保留率為66.70%，綜合評(píng)分為94.21分，接近預(yù)測(cè)值，說明得到的最佳工藝條件可靠。

圖9 脫色工藝優(yōu)化的響應(yīng)面圖

2.4 脫色工藝的初步應(yīng)用

以經(jīng)典的酸棗仁湯為例，利用上述優(yōu)化后的脫色工藝將當(dāng)量的單味酸棗仁水煎液進(jìn)行脫色后，再將脫色液與其他藥材煎煮液混合，得到如圖10（b）所示的煎煮液。與圖10（a）的傳統(tǒng)煎煮液相比，采用脫色工藝后的水煎液顏色明顯減淡，綜合脫色率為63.73%，脫色效果顯著。此時(shí)酸棗仁總皂苷含量相當(dāng)，約為20 μg/mL，說明該脫色工藝可在保證產(chǎn)品功效成分基本不受影響的前提下，擺脫傳統(tǒng)中藥水煎提取液在應(yīng)用于新型食品研究與開發(fā)過程中顏色過深的問題，從而促進(jìn)以酸棗仁為主藥的經(jīng)方與名方在功能食品開發(fā)中的應(yīng)用，在延伸中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的同時(shí)促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展。

圖10 酸棗仁湯脫色前后效果比較

3 結(jié)論

活性炭吸附可用于酸棗仁水提物的脫色，以由脫色率和皂苷保留率所組成的脫色效果綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法得到酸棗仁水提物的最佳脫色工藝：活性炭用量0.7%，脫色溫度36.5℃，脫色時(shí)間20.7 min，攪拌速度150 r/min。最佳工藝下脫色率為91.08%，皂苷保留率為66.70%，綜合評(píng)分為94.21分。所得脫色工藝在酸棗仁湯的脫色應(yīng)用中效果顯著，組方水提液顏色明顯減淡，為酸棗仁及其組方方劑在功能食品中的精深開發(fā)和有效應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)與實(shí)踐基礎(chǔ)。