岳榮川 盧圣忠 羅瑜 楊小利 王小波 秦丹 鄭在勇 呂明明 胡厚祥

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 南充 637000；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科， 重慶 400042)

急性心肌梗死病情兇險，常危及患者生命，及時的血運重建可挽救缺血心肌，但同時造成的心肌缺血/再灌注損傷影響了再灌注治療的療效[1-2]。既往研究[2-3]中分別給予清除自由基、減輕鈣超載、抗炎等措施減少心肌細(xì)胞凋亡或調(diào)節(jié)自噬的策略在臨床治療中未見明顯的療效。鑒于心肌缺血/再灌注損傷防治中遇到的瓶頸，人們意識到可能還存在其他形式的心肌損傷。焦亡以細(xì)胞膜的快速破裂和胞內(nèi)炎性內(nèi)容物的釋放為主要特點，是區(qū)別于凋亡和壞死的一種獨特的程序性細(xì)胞死亡[4]。Caspase-1對細(xì)胞焦亡的形成具有決定性作用，除此之外其還通過激活pro-IL-1β及pro-IL-18引發(fā)或加重炎性反應(yīng)[5]。相關(guān)研究[6-7]表明，心肌缺血/再灌注損傷可能與細(xì)胞焦亡有關(guān)。同時，NLRP3炎性小體與缺血/再灌-損傷的關(guān)系也引起了大家的關(guān)注[8]。因此，我們推測缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡可能與NLRP3有關(guān)。為了驗證這一假設(shè)，我們通過結(jié)扎和打開SD大鼠冠狀動脈前降支的方法建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷的動物模型，觀察缺血/再灌注后焦亡的發(fā)生情況，并通過抑制焦亡來明確焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中是否發(fā)揮了重要的作用，同時我們通過干預(yù)NLRP3炎癥小體對缺血/再灌注誘發(fā)焦亡的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 小動物呼吸機(jī)(中國，成都泰盟軟件有限公司)，胸腔撐開器(中國，蘇州醫(yī)療器械有限公司多功)，手術(shù)顯微鏡(中國，蘇州六六視覺科技股份有限公司)，脫水儀(中國，湖北慧達(dá)儀器有限公司)，生物組織包埋機(jī)(中國，廣東賽威科技有限公司)，組織切片機(jī)(德國，Leica公司)，恒溫水浴箱(中國，蘇州醫(yī)療器械有限公司)，病理組織漂烘儀(中國，常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(美國，Olympus公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液(中國，碧云天生物技術(shù)研究所)，NLRP3單克隆抗體(美國，Santa公司)，Caspase-1單克隆抗體(美國，Novus公司), IL-1β單克隆抗體(美國，Abcam公司),Z-YVAD-FMK(美國，Santa公司)，Tunel試劑盒(瑞士，Roche公司)，MCC950(美國,MCE公司)，Tropomyosin單克隆抗體(美國，Abcam公司),Cy3標(biāo)記紅色驢抗山羊IgG(中國，武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2 實驗動物 75只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200 g)飼養(yǎng)于定濕、定溫的動物室內(nèi)，由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)和實驗遵守川北醫(yī)學(xué)院實驗動物管理和使用規(guī)定并遵守中國實驗動物管理條例(1998 年衛(wèi)生部第 55 號文件)。實驗前自由飲水，禁食12 h。

1.3 根據(jù)文獻(xiàn)中的方法[9]建立缺血/再灌注模型 腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉，呼吸機(jī)支持呼吸，備皮后用碘酒及酒精消毒手術(shù)區(qū)皮膚，于左側(cè)胸前第四五肋間剪開皮膚(橫向)約3 cm，剪開肋間第一二層肌肉，稍加分離，鈍性分離肋間第三層肌肉，用開胸器暴露心臟，分開心包膜，于左心耳下2～3 mm結(jié)扎(活結(jié))冠狀動脈左前降支(于結(jié)扎線間墊一個小墊以大鼠心肌被撕裂)，結(jié)扎后可見左心室前壁組織由紅色變?yōu)辄S白色證明結(jié)扎成功，關(guān)閉胸腔，30 min后重新打開胸腔，用剪刀將結(jié)扎線剪開，關(guān)閉胸腔，縫合皮膚(24 h后取組織標(biāo)本)。

1.4 實驗分組及干預(yù) 采用抓鬮法將SD大鼠隨機(jī)分為兩組。①對照組：只進(jìn)行手術(shù)操作，不結(jié)扎冠狀動脈。②缺血/再灌注組：進(jìn)行缺血/再灌注處理。③YVAD組：假手術(shù)前8小時和4小時腹腔注射Z-YVAD-FMK(10 mg/kg)[10]。④YVAD+缺血/再灌注組：進(jìn)行缺血/再灌注處理前8小時和4小時腹腔注射Z-YVAD-FMK(10mg/kg)。⑤MCC950組：假手術(shù)前30分鐘尾靜脈注射MCC950(3 mg/kg)[11]。⑥MCC950+缺血/再灌注組：進(jìn)行缺血/再灌注處理前30分鐘尾靜脈注射MCC950。

1.5 Western Blot檢測蛋白水平 各組心肌組織進(jìn)行相應(yīng)處理以后，根據(jù)我們之前的方法[12]提取細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度，取等量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h，分別加入相應(yīng)的抗體和內(nèi)參照蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入與一抗相匹配的二抗，室溫下避光孵育1 h，再次洗膜后利用ODYSSEY-紅外凝膠掃描系統(tǒng)掃描膜顯示條帶，通過條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.6 心肌2,3,5,-氯代三苯基四氮唑(TTC)染色 根據(jù)我們之前的實驗方法[7,13]，先配制1%的TTC溶液備用，將心臟迅速取出放在-80 ℃冰箱中冷凍10 min，然后用刀片自心尖至心底依次垂直于長軸橫切成1 mm左右的心肌片段，接著將心肌片浸入1%TTC溶液中，放入37℃恒溫箱中孵育10 min，再用4%多聚甲醛固定8 h，最后照相統(tǒng)計心肌梗死面積。

1.7 Tunel及心肌組織免疫熒光染色 根據(jù)之前的方法[12]通過Tunel染色來檢測心肌組織中的細(xì)胞焦亡。不同組的大鼠經(jīng)過相應(yīng)處理后，取出心臟進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片、抗原修復(fù)、封閉，然后參照我們之前的實驗方法進(jìn)行Tunel染色，然后孵育tropomyosin抗體及相應(yīng)的熒光二抗進(jìn)行免疫熒光染色，最后進(jìn)行DAPI染色。在雙盲條件下計算各組Tunel陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌梗死面積、心肌細(xì)胞Tunel染色及焦亡蛋白水平 為明確心肌缺血/再灌注損傷時是否有細(xì)胞焦亡存在，我們將對照組與缺血/再灌注組進(jìn)行了比較。與對照組相比，缺血/再灌注組大鼠的心臟梗死面積明顯增加(P<0.05)，見圖1A；與對照組相比，血/再灌注組Tunel染色陽性率明顯增多(P<0.05)，見圖1B。與對照組相比，缺血/再灌注組中NLRP3表達(dá)水平明顯升高，Caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的激活也明顯增加(均P<0.05)，見圖1C。提示缺血/再灌注可以誘導(dǎo)心肌梗死及心肌細(xì)胞調(diào)亡。

圖1 心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生時細(xì)胞焦亡增加

2.2 Caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK通過抑制焦亡減輕心肌缺血/再灌注損傷 YVAD+缺血/再灌注組Tunel染色陽性率高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組(均P<0.05)，見2A；YVAD+缺血/再灌注組梗死面積高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組(均P<0.05)，見2B；YVAD+缺血/再灌注組caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的表達(dá)水平高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組，見2C～F(均P<0.05)。說明caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK可以抑制焦亡并減輕心肌缺血/再灌注損傷。

2.3 NLRP3炎癥小體的活化介導(dǎo)了缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞焦亡 為了明確缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡是否是由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的，我們用NLRP3抑制劑MCC950抑制NLRP3炎癥小體的活化來進(jìn)一步檢測。結(jié)果表明，MCC950成功抑制了缺血/再灌注組NLRP3蛋白的表達(dá)(圖3A、B)；MCC950還顯著地降低了缺血/再灌注所致的心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-1(圖3C)、IL-1β(圖3A、D)及GSDMD-N(圖3A、E)的蛋白表達(dá)水平的升高。同時，可以看到MCC950有效抑制了缺血/再灌注所致的Tunel染色陽性率的升高(圖3F)和心肌梗死面積的增加(圖3G)。表明缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞焦亡與NLRP3炎癥小體有關(guān)，抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減少細(xì)胞焦亡從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

圖2 抑制焦亡對心肌缺血/再灌注損傷的影響

圖3 NLRP3炎癥小體對缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的影響

3 討論

細(xì)胞焦亡是最近定義的一種細(xì)胞死亡形式，與其他的細(xì)胞死亡形式不同，其特點包括Caspase-1活化、細(xì)胞膜孔的形成和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。近年來焦亡在心血管疾病中的作用得到廣泛的關(guān)注。焦亡不僅可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，還可以導(dǎo)致組織損傷的級聯(lián)反應(yīng)。有研究[14-15]表明心肌細(xì)胞焦亡在心衰的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。還有研究[16]發(fā)現(xiàn)腎臟缺血/再灌注引起的急性腎功衰與腎小管上皮細(xì)胞的焦亡有關(guān)。我們在前期研究[17]中也發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷與心肌NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。另外，相關(guān)的研究[18]也表明，NLRP3與細(xì)胞焦亡有關(guān)。然而，焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中是否同樣發(fā)揮了作用仍然不清楚。在本研究中，我們建立了心肌缺血/再灌注損傷的動物模型，發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后心肌細(xì)胞中Tunel染色陽性率明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體、caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的表達(dá)也顯著升高，說明缺血/再灌注可以引起心肌焦亡性細(xì)胞死亡；還發(fā)現(xiàn)caspase-1特異性抑制劑Z-YVAD-FMK抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡可以減輕心肌缺血/再灌注損傷；最后發(fā)現(xiàn)NLRP3抑制劑MCC950可以抑制缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞焦亡。

正常的細(xì)胞受到死亡性刺激后會啟動一系列的分子機(jī)制最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。除了常見的凋亡和壞死之外，還有很多其他形式的細(xì)胞死亡，如自噬、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞脹亡、焦亡性壞死和壞死性凋亡等[20-21]。目前，心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制主要集中在鈣超載、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞的凋亡和壞死和自噬。細(xì)胞焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中的作用鮮有研究。我們的研究結(jié)果表明，心肌的缺血/再灌注損傷部分是由其誘導(dǎo)的焦亡引起的。這一發(fā)現(xiàn)拓展了我們目前對心肌缺血/再灌注損傷的認(rèn)識，并為以后制定減輕心肌缺血/再灌注損傷提供新的靶點依據(jù)。

炎癥反應(yīng)在許多疾病，尤其是動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著極其重要的作用。缺血/再灌注可引起許多細(xì)胞和組織產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。然而缺血/再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制目前尚不完全清楚。根據(jù)我們的研究可知，缺血/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能是其促炎性反應(yīng)的重要內(nèi)在機(jī)制。與Caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡不同的是，細(xì)胞焦亡依賴于一種重要的促炎性絲氨酸蛋白酶Caspase-1的活化。一旦Caspase-1活化，便會裂解促炎性細(xì)胞因子的前體(如pro-IL-1β和pro-IL-18)為其成熟體(IL-1β和IL-18)，并將其釋放到細(xì)胞外[22-23]。另外，細(xì)胞焦亡過程中細(xì)胞膜孔的形成將泄露胞質(zhì)內(nèi)容物(如DAMPs)，進(jìn)而伴隨大量促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。我們設(shè)想，細(xì)胞焦亡可能是缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡和心肌組織炎癥反應(yīng)機(jī)制之一。

細(xì)胞焦亡依賴于炎癥小體調(diào)控的caspase-1的活化。根據(jù)亞基組成的不同，炎癥小體可分為多種，其中，NLRP3炎癥小體最具特色，并且研究得最為廣泛[25-26]。缺血/再灌注可以引起心肌細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化從而激活caspase-1，但是，是否缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡就是由NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)的還尚需進(jìn)一步證實。因此，我們通過MCC950來抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)后進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3表達(dá)可以有效抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的caspase-1的活化、細(xì)胞膜孔的形成以及心肌壞死。這一結(jié)果充分說明，NLRP3炎癥小體在缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的過程中發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié)論

心肌細(xì)胞焦亡在心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，其與NLRP3炎癥小體有關(guān)；抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減少細(xì)胞焦亡，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。