劉垠澤，李沛檑，喬連成，吳恒梅*

（1. 佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2. 樺南縣林草事業(yè)發(fā)展中心，黑龍江佳木斯 154007）

紅 松（Pinus koraiensisSieb. et Zucc.）為松 科（PinaceaeLindl.）松屬（PinusL.）常綠喬木，始載于《名醫(yī)別錄》，又名紅果松、朝鮮松、海松等。耐寒性強，常見于我國小興安嶺至長白山一帶［1］，生于海拔150～1 800 m 的棕色森林土中，是東北地區(qū)特有的果材兼用型植物，也是我國重要的經濟型林木，于1999 年被國務院立為國家二級重點保護野生植物。國外僅在日本、朝鮮和俄羅斯的小部分地區(qū)有分布［2］。紅松樹干常因結構細膩且耐腐蝕性強而被用作工業(yè)原料，早在古希臘時期，松樹皮就被歐洲人用作治療外傷，也可從中提取松節(jié)油、栲膠。紅松球果中松籽被開發(fā)、出口為滋養(yǎng)食用品，《本草綱目》紀錄了松塔、松針的醫(yī)藥價值，可磨粉入藥，醫(yī)咳喘、濕氣、炎癥、心神不安等病癥。

多糖是維持生命活動所必需的四大基本物質之一。隨著國際分子水平研究的進步，各國對多糖的研究愈發(fā)重視，認為二十一世紀將是多糖的世紀［3］?，F代研究表明，紅松中含有萜類、多糖、多酚等有效化學成分，其不同部位的水提物具有抗氧化、抗病毒和降血脂等藥理活性。該文對紅松多糖的提取工藝及生物活性進行簡要綜述，以期為紅松資源的合理開發(fā)利用提供參考。

1 紅松多糖的提取工藝

多糖的提取技術是天然產物研究中不可或缺的分支，植物多糖的毒副作用極低，應用領域寬泛。目前成熟的提取技術繁多，針對紅松多糖提取層面，國內研究多集中于提取條件的優(yōu)化。不同方法提取出的多糖構象、提取量和藥理活性有差別，紅松各部分均含有一定量的多糖，提取時應先將材料粉碎烘干，根據提取原料部位的不同，酌情考慮是否進行預處理溶解脂類物質。

1.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法即根據相似相溶原理，按照生物活性成分的溶解度不同選擇合適的溶劑，將胞內有效物質遷徙至溶劑中，再進行分離純化。水、酸堿溶液等是常用于提取多糖的溶劑。

水提法是傳統(tǒng)的多糖提取方法。相較于冷水提取，溶劑溫度的提升可使分子移速加快，顯著增加多糖提取得率。水提法簡單經濟、干擾成分少、可工業(yè)化應用，但得率低且耗時，不能確定高溫下是否改變多糖的化學結構。在水提法中，提取參數決定了最后的多糖得率，因此控制適宜的提取條件顯得大有可觀。當提取物中含糖醛酸或酸性多糖時，可選用堿提取法。通過控制濃度，使細胞在堿性條件下破裂，釋放內容物從而進行提取，提取速度和效率比水提法要略高，但操作繁瑣、易產生雜質，堿濃度過高時將會損害多糖結構［4］。

曲航［5］先對影響松仁多糖提取率的因素進行參數優(yōu)化，以多糖得率為響應值，進行響應面分析實驗考察最優(yōu)提取參數，得到最優(yōu)工藝方案為：固液比1：40 g·mL-1，溫度95℃，時間1.5 h，提取3 次，提取率為9.26%±0.10%。丁寧［6］采用水提醇沉法，將料液比、提取時間、提取次數選為實驗條件，設置單因素試驗并確定因素適宜范圍，在此基礎上設置三因素三水平正交試驗進行提取工藝的優(yōu)化，結果表明影響紅松松籽殼多糖得率的強弱順序為：固液比>提取次數>提取時間，最佳提取參數為：固液比1：15 g·mL-1，提取時間2 h，提取3 次，在此條件下多糖平均得率為2.9%。楊鑫等［7］在單因素考察的基礎上進行正交試驗，將松塔多糖提取率作為評價指標，通過其方差分析結果可知，浸提溫度和固液比對多糖得率呈顯著性影響，主次順序為：固液比>浸提溫度>浸提時間，當料液比為1：12 g·mL-1，浸提溫度100℃，浸提時間4 h 時多糖得率最高，為1.52%。紅松提取物內含水溶性酸性多糖的比例約16%～23%［8］，因此也可選用堿提取法進行多糖提取。

1.2 超聲輔助提取法

利用聲波的振動傳播改變細胞外壓力，溶液內產生微氣核空化泡，這些空化泡在壓縮到極限時會崩潰釋放能量，形成局部的高溫高壓環(huán)境，有助于加速溶質擴散，細胞瞬時破裂釋放出多糖等化學物質。此法適應性強，在常溫下即可操作，過程中產生的熱效應會使溶液溫度基本維持在57℃，有水浴加熱作用，極大提高了多糖提取效率。與傳統(tǒng)的水提取相比，超聲輔助法的材料損失率更低、提取時間短、得率和質量有所增加。當超聲功率、時間等因素設置不當時，也存在多糖結構被改變的可能性，且由于設備受限問題，大規(guī)模的工業(yè)化生產還需要一定時間。

李明謙［9］選用超聲輔助水提法提取紅松松籽殼多 糖（Pinus koraiensis pinon shell polysaccharides，PPSP），設計正交試驗優(yōu)化提取工藝，從固液比、提取溫度、浸提時間和提取次數四因素層面考察，分析各因素對多糖提取率的影響，得到如下順序：提取溫度>浸提時間>浸提次數>固液比，其中溫度和時間對多糖含量的影響呈極顯著差異。提取最優(yōu)參數為：固液比1：6 g·mL-1，溫度85℃，時間45 min，提取2次，此時PPSP總含量達最高值54.41%。李桂娟等［10］在超聲功率恒定450 W 條件下，通過改變固液比、提取時間、提取溫度和提取次數，設計正交試驗以確定最佳提取工藝，在該研究中提取時間對得率影響最低，影響順序依次為：提取溫度>浸提次數>固液比>浸提時間，當固液比為1：50 g·mL-1，溫度60℃，時間30 min，提取1 次時多糖得率最高，為44.26%。在原料、提取次數和料液比相同的情況下，超聲輔助比水提多糖得率高9.94%，所需溫度更低，在節(jié)能的同時更能保障多糖活性結構的穩(wěn)定。

1.3 微波輔助提取法

利用電磁波透過細胞壁輻射溶劑和細胞液，使細胞內極性物質吸能產熱汽化膨脹，細胞內外產生壓力差，導致細胞壁破裂，有效成分流出溶解。此法節(jié)能、高效、重現性好，但也需嚴格把控功率的設定，若時間過久或功率較高，將會導致多糖浸出率低、糖苷鍵斷裂等缺陷。

王振宇等［11］在單因素考察的基礎上，以松籽多糖含量為考察指標進行正交試驗，分析固液比、微波功率、處理時間和浸提時間對提取率的影響，結果表明固液比和微波功率對多糖得率有顯著性影響，其余因素的影響不顯著，當固液比為1：15 g·mL-1，功率320 W，處理時間5 min，浸提時間60 min時達到最優(yōu)提取條件，多糖得率為6.01%。與傳統(tǒng)水提法相比，微波輔助在用料相同的情況下，所需溶劑減少了1/4、時間節(jié)省一半、多糖得率升高0.1%。

1.4 生物酶提取法

酶解法是多糖提取中較為溫和高效的方法，其原理是根據多糖化合物的化學組成特性差異，在溶劑中選擇性的加入生物酶，降低活化能，軟化水解細胞壁，增大細胞通透性，促使胞內活性成分流于溶劑中［12］。對于植物性多糖，通常選用木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等生物酶進行提取，在提取多糖的過程中，多酚等物質也會被分離提取，部分提取物的質量還會在酶的作用下增加。此法在溫和條件下即可操作，提取率高、能有效避免降解多糖的生物活性且易除雜質，但在操作時要確保條件適宜、酶活性穩(wěn)定不失活，由于酶解法成本較高、提取條件嚴格，工業(yè)化應用不太現實。

賀便等［13］采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助酶解法提取松針多糖，在提取中以1：1 的比例加入果膠酶和纖維素酶，各因素對多糖得率影響順序為：酶添加量>提取溫度>超聲時間>固液比>酶解時間，當固液比為1：25 g·mL-1，超聲時間25 min，酶解時間2 h，提取溫度60℃，酶添加量5% 時為最佳提取工藝，此時松針多糖提取率為3.97%。

1.5 超臨界流體萃取法

超臨界流體的密度相似于液體且擴散系數遠大于液體，有較強的滲透溶解力，能夠迅速滲透進入細胞內，適合作為溶劑進行萃取實驗。對于某些特定物質來說一般存在一個臨界點，當處于超臨界狀態(tài)下，提取物被隔段萃取，恢復正常氣壓后，提取物與氣體分離溶于溶劑中，達到萃取效果［14］。此法工藝簡便、過程易調控、萃取效率高且無溶劑殘留，能夠確保多糖生物活性穩(wěn)定。王振宇等［15］將紅松籽殼磨粉、過40～60 目篩，以過氧化值為參考設計正交試驗，得出最佳萃取參數為：提取溫度35℃，萃取壓力40 MPa，提取時間2 h，得率為2.4%。

1.6 陰離子反向膠束體系萃取法

陰離子反向膠束體系萃取技術在多糖提取方面屬于新興技術，用該種方法提取植物多糖是一種協(xié)同過程，即溶液在水相形式下接觸反膠束微粒，此時多糖移入微粒中屬于萃取過程；當該微粒接觸其他水相時多糖會回到水相中，該過程屬于反萃取過程，經過整個萃取與反萃取后，多糖化合物就被分離出來［16］。此法快速高效、能夠保障多糖生物活性不流失，但有關陰離子反向膠束體系萃取法提取紅松多糖的研究報道罕見，需在今后進一步研究試驗，完善相關技術資料。

2 紅松多糖的生物活性

2.1 抗氧化活性

自由基是含有未成對電子的原子基團，具有強氧化性。自由基內的單電子為形成穩(wěn)定結構，常傾向和其他原子結合，因此自由基常處于活潑不穩(wěn)定狀態(tài)。機體內常見自由基有：羥自由基、烷氧基、超氧陰離子等。在正常狀態(tài)下，機體的抗氧化系統(tǒng)會嚴格控制自由基含量，使其處于動態(tài)平衡。當體內自由基累積過多時，會產生氧化脅迫，對各細胞結構和功能造成損傷、導致免疫系統(tǒng)紊亂、加速衰老并且誘發(fā)出多種疾?。?7］。1956 年被提出的自由基學說是目前公認的衰老學說之一，而具還原力的抗氧化物質能夠對多余自由基起到阻斷清除作用，達到延緩衰老的效果。

多糖屬于外源性抗氧化物質，目前已發(fā)現許多藥用植物多糖具有抗氧化活性，植物多糖通過增強機體內抗氧化酶的活性從而阻斷氧化反應過程，利用多糖內的羥基結構絡合氧化必需的金屬離子，也可以直接作用于自由基抑制其增多。

付昊雨等［18］進行小鼠體內抗氧化試驗，結果表明高濃度的松籽殼多糖提高了肝臟血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，呈極顯著性影響；從總體數據來看，在低濃度下多糖依然提高了小鼠的抗氧化活性。通過進行體外抗氧化實驗測定松塔多糖的抗氧化活性，以抗壞血酸的清除率作為對照，結果顯示當多糖濃度為15 mg·mL-1時，對ABTS?+的清除率達到80%；當濃度持續(xù)升高到30 mg·mL-1時，ABTS?+的清除率升高幅度趨于平緩，羥基自由基清除率達80%［19］。劉超［20］在測定松塔粗多糖還原能力和DPPH自由基清除率的研究中發(fā)現，不同組分的粗多糖都具有一定的體外抗氧化活性，且抗氧化能力與多糖濃度呈正相關。沈巳焱［21］在對比紅松不同部位多糖的半最大效應濃度（Concentra?tion for 50% of maximal effect，EC50）值時認為，多糖分子量、單糖組分的區(qū)別會影響清除自由基的能力。由于松針多糖分子量小、D-葡萄糖和D-木糖含量多，因此羥基自由基清除率最高，在8 mg·mL-1時就達到了67.72%；而松塔多糖中糖醛酸和D-甘露糖含量高，ABTS?+清除力和還原力強于其他部位的多糖。

2.2 抗腫瘤活性

腫瘤是機體局部細胞在刺激因素的作用下，增生與異常分化形成的新生物，會嚴重威脅到機體正常生命活動。目前已有多種植物多糖化合物被證實有抗腫瘤活性，這些多糖大都有硫酸基。植物活性多糖對機體正常細胞的毒副作用很小，能夠通過增強機體免疫系統(tǒng)活性對抗腫瘤細胞，或者抑制腫瘤細胞周期、誘導其凋亡［9］。

呂永俊等［22］選用三種腫瘤細胞分別給小鼠接種0.2 mL，以此考察紅松多糖的抗腫瘤活性，結果表明60 mg·kg-1的松塔多糖對鼠肉瘤細胞的抑制率達48.9%，有極顯著性影響；60 mg·kg-1的松籽殼多糖對宮頸癌細胞平均抑制率為38.2%，對肝癌腹水型小鼠的生命延長率有21.4%。有研究顯示，100 mg·kg-1的松塔多糖對荷瘤小鼠的毒副作用小，抑瘤率為33.07%，有顯著性影響；當濃度達到200 mg·kg-1時，抑瘤率升高至48.33%，但毒副作用也隨之加強［23］。

2.3 免疫調節(jié)活性

免疫調節(jié)是機體執(zhí)行免疫應答過程中維持自身穩(wěn)定的生理功能。植物多糖能夠作為免疫調節(jié)劑以多種途徑參與生理活動，增強巨噬細胞吞噬作用、結合壞死細胞清除病原體；促進T 淋巴細胞免疫；激活補體系統(tǒng)；促進細胞因子的生成。

有研究者運用酶聯(lián)免疫吸附測定法對松籽殼多糖進行免疫調節(jié)研究，結果顯示：100 mg·kg-1的多糖對小鼠臟脾中T細胞生長因子蛋白含量有升高作用；200 mg·kg-1的多糖使血清干擾素蛋白含量比對照組增加了54.56 ng·L-1，使腫瘤壞死因子上調，較對照升高了30.67 ng·L-1；該實驗證實紅松多糖能夠間接活化某些細胞以達到調節(jié)免疫功效，具有免疫調節(jié)活性［9］。T Baba 等［24］證明松籽殼多糖能增強激活小鼠腹腔內巨噬細胞的吞噬能力，隨之激活T 細胞對異體抗原的反應性。孫芳［25］采用遲發(fā)型變態(tài)反應和碳廓清試驗對松仁多糖的免疫功能進行測定，結果顯示250 mg·kg-1的多糖對小鼠足跖厚度和吞噬指數有顯著性增加效果，松仁多糖能夠使免疫器官增重，提高機體免疫力。

2.4 抗菌活性

有關多糖抑菌活性的研究，多數集中在植物多糖和微生物多糖上。馮雪［26］采用牛津杯法，測定抑菌圈以考察松塔多糖的抑菌情況，結果顯示隨多糖濃度增加，抑菌效果越好；對大腸桿菌、青霉的抑制作用較強，抗菌能力是有選擇性的；最小抑菌濃度分別為：大腸桿菌0.5 mg·mL-1，青霉0.25 mg·mL-1，釀酒酵母0.25 mg·mL-1；用不同分子量的多糖抑制不同菌種，各菌種間抑制強弱效果不同。在蒙琦［27］的研究中，松塔多糖濃度和對沙門氏菌、大腸桿菌的抑制作用呈正相關，當濃度為0.5% 時即可對沙門氏菌產生抑制效果，各菌種抑制強弱為：沙門氏菌>大腸桿菌>志賀氏菌。

2.5 其他活性

通常，內含硫酸基的多糖具有抗病毒活性，微生物細胞壁具β-1，3 葡聚糖結構，而這種結構屬于機體防御誘發(fā)基因［28］。多糖通過抑制逆轉錄酶活性、增強機體免疫等途徑，對皰疹病毒、登革熱病毒、甲型肝炎病毒等病毒有抑制作用，且對宿主細胞無毒副作用［29］。 此外，紅松多糖還具有降血脂［30］、降血糖［31］、抗輻射［32］等多種生物活性。

3 問題與展望

我國紅松資源豐富，但松塔、松針等常作為加工副產品丟棄，以至于資源轉化率較低。有關多糖的研究是21世紀的熱點問題，已有研究證實紅松多糖具有多種生物活性，提取方法的差異會導致多糖中單糖組成不同，進而影響生物活性效果。今后可以從紅松多糖構象等分子方面進行后續(xù)深入探索，為紅松資源的合理開發(fā)提供多種可行方案。