劉 濤,李 晶,鮑翠玉

(湖北科技學院1. 附屬第二醫(yī)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

有研究報道，棕櫚酸(palmitic acid，PA)通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號通路相關蛋白PERK、ATF4、CHOP表達水平誘導H9c2心肌細胞凋亡[1]。普伐他汀(pravastatin)屬于他汀類調(diào)脂藥物，可減輕心臟微血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，有效降低心血管疾病死亡率[2-3]，但pravastatin以何種途徑參與心肌細胞脂毒性損傷的調(diào)控機制研究較少。本研究將探討Pravastatin 對高脂造成心肌細胞凋亡的保護作用及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中PERK/ATF4/CHOP途徑的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2心肌細胞系購于上海通派生物有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自維格拉斯生物技術公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT檢測試劑盒購自眾一生物科技有限公司；Pravastatin、PA購自美國Sigma公司；一抗購自英國abcam公司；二抗購自美國Abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1細胞增殖率檢測 將盛有細胞的96孔板置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱24 h，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗設計，分組給藥繼續(xù)孵育。每孔加入20 mL MTT，孵育4 h。棄去孔內(nèi)原液體，避光環(huán)境下，加入150 mL DMSO。在570 nm處檢測OD值。

1.2.2ROS水平檢測 向載有玻片的6孔板內(nèi)加入細胞，在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h，待細胞貼壁后，分組給藥繼續(xù)孵育，DMEM培養(yǎng)基洗滌2遍后，加入1 ∶500 ROS工作液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，PBS液洗滌3遍、加入適量DAPI，室溫避光孵育10 min，洗滌封片后用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光。

1.2.3免疫印跡法檢測 測定各組細胞裂解后蛋白濃度，在槽內(nèi)加入每組蛋白樣品，進行蛋白電泳、轉模、封閉后，用下列一抗孵育過夜:GRP78、CHOP、p-PERK、PERK、ATF4、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。隨后孵育二抗1 h，用增強化學發(fā)光試劑、凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白。

1.3 統(tǒng)計學方法使用GraphPad Prism5進行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 Pravastatin 對高脂誘導的心肌細胞增殖率低下的影響MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)PA刺激心肌細胞后，細胞的增殖率隨著濃度和時間的增加，細胞增殖率逐步降低，為了實驗的便利性，我們將PA的有效預處理濃度設定為0.4 mmol·L-1，預處理時間設定為24 h。Pravastatin 在10 μmol·L-1預處理時，心肌細胞增殖率明顯升高(P<0.05)，而20 μmol·L-1組10 μmol·L-1與對心肌細胞增值率差異無顯著性(P>0.05)。所以選擇了10 μmol·L-1的pravastatin進行下一步實驗。

2.2 Pravastatin對高脂誘導的細胞內(nèi)氧化應激的影響ROS用紅色熒光標記，DAPI用藍色熒光標記，PA組紅色和藍色熒光強度明顯增強，出現(xiàn)形態(tài)學改變，說明細胞內(nèi)ROS水平增加，并表現(xiàn)出凋亡特征。Pravastatin預處理后，細胞內(nèi)ROS水平較PA組明顯降低，表明pravastatin能降低高脂所致細胞氧化應激損傷作用。

2.3 Pravastatin 對高脂誘導的心肌細胞凋亡蛋白的影響PA 組 Bax/Bcl-2比值明顯升高、 cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，Pravastatin預處理后，明顯改善上述變化(P<0.05)。

2.4 Pravastatin對高脂誘導的心肌細胞PERK/ATF4/CHOP通路的影響PA組p-PERK/PERK、ATF-4、GRP78、CHOP表達均明顯增加，pravastatin預處理后，上述蛋白表達明顯下降。Pravastatin預處理后，明顯改善上述變化(P<0.05)。

3 討論

本研究結果證實棕櫚酸能抑制H9c2心肌細胞的生長、增加細胞內(nèi)ROS水平，并上調(diào)促凋亡相關蛋白表達水平，pravastatin預處理后可以明顯改善上述變化，有效抑制H9c2心肌細胞凋亡。

本研究重點分析了pravastatin與PERK/ATF4/CHOP信號通路作用機制的相關性。有研究報道，PERK/ATF4/CHOP信號通路的活化，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起細胞凋亡[4]。本研究結果提示，高濃度的棕櫚酸顯著上調(diào)H9c2心肌細胞細胞內(nèi)PERK/ATF4/CHOP信號通路相關蛋白表達水平，而pravastatin預處理可以明顯改善上述變化。

綜上，pravastatin能逆轉PA所致的H9c2心肌細胞增殖力下降，改善心肌細胞氧化應激損傷。其作用機制可能通過調(diào)控PERK/ATF4/CHOP信號通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，減輕高脂誘導心肌細胞氧化應激損傷。