盧羿同 王 亮 馬鵬飛 白 健 秦鴻雁

（空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)教研室，西安710032）

近年來，基于免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞療法已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，包括應(yīng)用于癌癥治療的免疫激活嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞治療，以及應(yīng)用于炎癥性腸炎和嚴(yán)重肢體缺血治療的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchy‐mal stromal cells，MSCs）治療［1-4］。巨噬細(xì)胞是人體重要的天然免疫細(xì)胞，從巨噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)后的100多年里，人們對其的研究就一直熱情不減［5-6］。巨噬細(xì)胞對疾病的治療最早可以追溯到FIDLER博士的研究工作，早在1974年，他利用預(yù)激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行回輸，觀察到其對B16細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用［7］。之后，國內(nèi)外學(xué)者包括本課題組紛紛開啟了自體巨噬細(xì)胞回輸治療組織損傷、退行性病變、器官纖維化及腫瘤等多種疾病的基礎(chǔ)和臨床研究［8-11］。然而，由于巨噬細(xì)胞具有活化、起源和功能的異質(zhì)性，探討不同巨噬細(xì)胞亞群在疾病中的作用是將其有效用于疾病治療的前提［12］。因而課題組結(jié)合巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的研究，綜述了目前國內(nèi)外利用不同類型巨噬細(xì)胞治療炎癥相關(guān)疾病的研究進(jìn)展。

1 巨噬細(xì)胞發(fā)育和起源異質(zhì)性

對于巨噬細(xì)胞（macrophages，Mφ）起源的探索，最早可追溯到1968年VAN FURTH等［13］提出的單核巨噬系統(tǒng)（mononuclear phagocyte system，MPS），該系統(tǒng)最初包括組織定居Mφ、循環(huán)的單核細(xì)胞和Mφ，后來也包括樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）。然而，隨著細(xì)胞命運圖譜研究的深入及譜系示蹤技術(shù)的出現(xiàn)，研究者們對組織定居Mφ的起源有了新的發(fā)現(xiàn)，其中最重要的兩個發(fā)現(xiàn)是大部分的組織定居Mφ起源于胚胎時期，且在整個生命周期中具有自我更新能力［14］。研究顯示，Mφ的發(fā)育分為3個連續(xù)的造血波，第1波即原始造血從E7.0天開始，在胚胎卵黃囊血島中產(chǎn)生紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和Mφ祖細(xì)胞。隨后Mφ祖細(xì)胞會在腦內(nèi)產(chǎn)生Mφ前體，進(jìn)而分化為小膠質(zhì)細(xì)胞。第2波即暫時定向造血，發(fā)生在卵黃囊的造血內(nèi)皮細(xì)胞中，在E8.25天時形成血管系統(tǒng)，并產(chǎn)生紅細(xì)胞髓樣祖細(xì)胞（erythro-myeloid progenitors，EMPs），這些祖細(xì)胞將產(chǎn)生第一個胚胎單核細(xì)胞。隨后，胚胎單核細(xì)胞會滲透到除大腦外的每一個組織，并分化成大多數(shù)組織的定居Mφ［15-17］。第3波開始于E10.5天，在主動脈-性腺-中腎區(qū)胚胎固有造血內(nèi)皮處產(chǎn)生造血干細(xì)胞（hemato‐poietic stem cells，HSC）。E10.5天后，HSC也會出現(xiàn)于臍動脈和卵黃動脈以及胎盤和卵黃囊。EMPs、淋巴髓系祖細(xì)胞和HSC隨即進(jìn)入胎肝，使其成為主要的造血器官，直到妊娠晚期［18］。在圍產(chǎn)期，HSC也能產(chǎn)生胚胎單核細(xì)胞，生成少量的定居Mφ。成體造血是從骨髓中開始，僅少量的組織定居Mφ在出生后由骨髓單核細(xì)胞分化而來，如腸道組織定居Mφ等。

目前公認(rèn)的是，大多數(shù)組織定居巨噬細(xì)胞是來自暫時定向造血波時卵黃囊中出現(xiàn)的EMPs。在Mφ發(fā)育過程中，至少有兩條調(diào)控EMPs分化的信號通路。第一種是不依賴c-Myb表達(dá)的卵黃囊Mφ，也稱為原始巨噬細(xì)胞，它繞過了經(jīng)典的單核細(xì)胞中間體，最終在腦內(nèi)產(chǎn)生小膠質(zhì)細(xì)胞并迅速被血腦屏障隔離［19］。第二種依賴c-Myb表達(dá)，一旦EMPs在胎肝中出現(xiàn)，就開始產(chǎn)生胚胎單核細(xì)胞。EMPs來源的胚胎單核細(xì)胞迅速進(jìn)入其他組織，分化成成體組織定居Mφ［20］。

2 Mφ活化和功能異質(zhì)性

正常生理功能下，Mφ具有吞噬和抗原提呈能力。然而，在局部組織炎性微環(huán)境的刺激下會呈現(xiàn)出不同的極化狀態(tài)，并具有相應(yīng)的基因表達(dá)譜［21］。目前根據(jù)其表面受體和功能特征，Mφ被分為兩種極化類型，即經(jīng)典活化的M1型Mφ和替代活化的M2型Mφ。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）被用來誘導(dǎo)M1型Mφ極化。M1型Mφ通過釋放大量促炎因子，如白介素12（interleukin-12，IL-12）、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（tu‐mor necrosis factor-α，TNF-α）等，促進(jìn)Ⅰ型輔助T（type 1 T helper，Th1）細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮組織破壞和抗腫瘤功能。M1型Mφ的極化由JAK-STAT、NF-κB和TLR4信號和轉(zhuǎn)錄因子IRF5/IRF8介導(dǎo)。相對于M1型Mφ，M2型Mφ則由IL-4誘導(dǎo)，通過上調(diào)甘露糖受體的表達(dá)，釋放免疫調(diào)節(jié)因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，參與Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤生長和擴散［22］。而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）在許多惡性腫瘤中表現(xiàn)為M2樣Mφ表型，與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，STAT6和IRF4均可介導(dǎo)M2型Mφ的極化［23］。

3 回輸不同類型Mφ對炎癥相關(guān)疾病的治療

3.1 肝臟相關(guān)疾病治療在肝纖維化領(lǐng)域，Mφ根據(jù)疾病分期和Mφ極化類型發(fā)揮促纖維化或抗纖維化作用。THOMAS等［24］的研究表明回輸骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）對四氯化碳誘發(fā)的慢性肝纖維化具有治療作用。然而，由于Mφ在起源、極化和功能上具有復(fù)雜的異質(zhì)性，我們有理由認(rèn)為，Mφ的不同亞群對同種疾病可能發(fā)揮不同作用。因此，課題組進(jìn)一步探討了不同極化類型的Mφ在小鼠肝纖維化細(xì)胞治療中的精準(zhǔn)作用，發(fā)現(xiàn)與M0或M2型Mφ相比，回輸M1型BMDMs對肝纖維化治療效果最好。進(jìn)一步的機制研究表明：回輸M1型Mφ減少了肝星形細(xì)胞的數(shù)量和活性，促進(jìn)內(nèi)源性Mφ向纖維化肝臟的募集，并產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶和肝生長因子促進(jìn)膠原降解和肝細(xì)胞增殖。同時，M1型Mφ也增加了纖維化肝臟中自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量，釋放了腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，誘導(dǎo)肝星形細(xì)胞凋亡［10］。最近，MORONI等［25］對9例肝硬化晚期患者進(jìn)行了自體Mφ回輸治療的首次臨床試驗，結(jié)果表明，所有受試者在一年內(nèi)均存活且未進(jìn)行肝移植，達(dá)到了安全性和可行性的初步結(jié)果。這項研究為肝硬化和其他纖維化疾病的Mφ治療提供了依據(jù)，也為進(jìn)一步使用M1型Mφ治療提供了基礎(chǔ)。此外，其他研究也表明可利用更明確的亞群來挖掘Mφ的治療潛力。例如，MELIN等［26］報道移植肝臟定居MφKupffer細(xì)胞對對乙酰氨基酚誘發(fā)的急性肝損傷或肝臟缺血再灌注損傷具有治療作用。提示，終末分化的或不同來源的巨噬細(xì)胞均可能成為治療肝臟相關(guān)疾病的候選細(xì)胞。

3.2 肺臟相關(guān)疾病治療肺泡蛋白沉積癥是由肺泡Mφ表面GM-CSF受體信號缺陷引起的肺表面活性脂蛋白清除不良，進(jìn)而導(dǎo)致患者低氧性呼吸衰竭［27］。肺泡Mφ由于可吞噬肺表面活性物質(zhì)，降低肺泡張力、維持肺泡容量的穩(wěn)定，在肺泡蛋白沉積癥中發(fā)揮重要調(diào)控作用，因而重塑Mφ功能成為治療肺泡蛋白沉積癥的新策略。SUZUKI等［28］利用GM-CSF受體（csf2rb基因）敲除小鼠建立肺泡蛋白沉積癥模型，發(fā)現(xiàn)將BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠的肺中，不僅可有效治療小鼠的肺泡蛋白沉積癥，而且移植的BMDMs能在肺臟內(nèi)增殖，在移植后1年仍可在肺臟中發(fā)現(xiàn)，并且沒有引起免疫排斥反應(yīng)。進(jìn)而，該團(tuán)隊將慢病毒介導(dǎo)的csf2rb基因表達(dá)糾正后的csf2rb+/+BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)也可消除小鼠肺泡蛋白沉積。而且，移植后野生型和csf2rb基因糾正型的Mφ都失去了BMDMs的特征，獲得了肺泡Mφ的特征［29］。令人感興趣的是，LACHMANN等［30］的研究表明，給罹患肺泡蛋白沉積癥小鼠回輸骨髓前體細(xì)胞同樣能定植在肺泡，并且可獲得肺泡Mφ表型，發(fā)揮療效。這一發(fā)現(xiàn)與SU‐ZUKI等［28］的觀察結(jié)果相一致，即肺臟微環(huán)境在決定Mφ的表型和功能方面起至關(guān)重要的作用。且自體BMDMs回輸對遺傳性肺泡蛋白沉積癥患者具有潛在的治療作用。

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征是呼吸衰竭的主要原因，但目前尚無有效的藥物治療［31］。肺泡巨噬細(xì)胞在ALI的急性期、初始期、慢性期和緩解期均發(fā)揮重要作用，是潛在的治療靶點。LIU等［8］構(gòu)建了分泌IL-4的Mφ，并通過肺臟Mφ移植治療ALI。結(jié)果表明，肺臟巨噬細(xì)胞移植后通過減輕ALI小鼠的肺部炎癥、減輕組織損傷、減少肺泡Mφ死亡、降低死亡率等改善了ALI。上述結(jié)果提示：不同極化類型的肺臟Mφ移植可治療ALI。

3.3 腎臟相關(guān)疾病治療腎臟的再生能力有限，而在慢性腎病中誘導(dǎo)腎修復(fù)的療法很少［32］。因此，細(xì)胞療法等干預(yù)措施正在廣泛發(fā)展，成為預(yù)防終末期腎衰竭的替代治療方式［33］。在許多慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）小鼠模型中，M2型Mφ具有抗炎和修復(fù)活性，被用于細(xì)胞治療。但研究結(jié)果卻并不一致［34-35］。DAVID教授的研究小組研究了在急性腎衰竭和CKD動物模型中輸入M2型Mφ的作用。該團(tuán)隊利用阿霉素腎病小鼠模型證明，與IL-4/IL-13誘導(dǎo)的M2a型Mφ相比，靜脈回輸IL-10/TGF-β誘導(dǎo)的M2c型脾臟來源CD11b+細(xì)胞，可增強對腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的保護(hù)作用。在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的阿霉素腎病小鼠模型中，回輸脾臟來源的M2a型Mφ與腎損傷的惡化有關(guān)。這些M2c型Mφ高表達(dá)B7-H4，而M2a型Mφ則不表達(dá)。因此，作者認(rèn)為M2c型Mφ能發(fā)揮腎臟保護(hù)作用是由于表達(dá)了共同刺激分子B7-H4，進(jìn)而抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生。同時，也證明輸入M2c型Mφ在疾病過程中并沒有改變自身的表型。相比之下，CAO等［34］和WANG等［35］研究表明，使用相同的小鼠模型，可能由于Mφ表型的改變，從骨髓中獲得的M2型BMDMs未能減少蛋白尿和維持腎功能。進(jìn)一步研究表明，輸注M2型BMDMs可能在體內(nèi)失去了抑制功能，而脾臟來源的M2型Mφ保持了其抑制功能。上述研究提示，在應(yīng)用Mφ進(jìn)行疾病治療時，其來源是一個需要考慮的關(guān)鍵問題。

此外，RAQUEL等［36］也研究了回輸單核/巨噬細(xì)胞對糖尿病腎病大鼠的治療作用。通過利用鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型，4周后經(jīng)頸靜脈回輸BMDMs后，作者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性給予糖尿病大鼠BMD‐Ms通過減少腎內(nèi)TGF-β和聚集在腎小球內(nèi)的精氨酸酶陽性Mφ，改善了Ⅰ型糖尿病大鼠模型的腎小球功能和形態(tài)。上述研究均表明：針對不同的腎臟疾病，選擇不同來源或極化的Mφ進(jìn)行回輸具有不同的效果。

3.4 腫瘤相關(guān)治療早在1974年，F(xiàn)IDLER等［7］報道將黑色素瘤（B16）培養(yǎng)基激活的Mφ輸注到荷瘤小鼠體內(nèi)可以減少腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。1990年AN‐DREESEN等［37］首次報道了IFN-γ 激活的自體TAMs的體外獲得及再輸注的首次臨床試驗。其研究表明：體外共培養(yǎng)的Mφ能夠識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，但利用轉(zhuǎn)移瘤模型卻不能產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。之后，隨著大規(guī)模血液單核細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的成熟，來自癌癥患者的臨床試驗證明了注射IFN-γ或LPS激活的自體單核細(xì)胞分化的Mφ在治療上的可行性和安全性。人類Mφ過繼免疫治療的給藥方式可通過多種途徑實現(xiàn)：如經(jīng)靜脈、腹腔、胸膜內(nèi)或選擇性肝動脈灌注。通過回輸銦111標(biāo)記Mφ進(jìn)行體內(nèi)分布研究時顯示，腹腔注射的Mφ可定位于腹腔腫瘤包塊處，而在經(jīng)體循環(huán)回輸后則定位于肝臟、脾臟［38］。值得注意的是，在這些研究中，所有類型的Mφ靶向免疫治療僅在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面有效，而很少觀察到腫瘤原發(fā)灶的消退，原因可能為回輸后的Mφ不能到達(dá)腫瘤原發(fā)灶內(nèi)或被腫瘤微環(huán)境重新誘導(dǎo)為TAMs，不能發(fā)揮抗腫瘤作用。

由于回輸Mφ并未起到治療腫瘤的作用，研究者們提出了更多靶向TAMs的治療策略，包括：抑制Mφ在腫瘤中的募集和存活；TAMs功能再教育，即將M2樣TAMs再教育為M1樣的TAMs，發(fā)揮抗腫瘤作用；Mφ介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)；以及應(yīng)用基因工程修飾Mφ，如CAR-Mφ靶向殺傷腫瘤等［39］。

4 展望

總之，上述研究均顯示：Mφ不僅在先天免疫中發(fā)揮重要作用，在急慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。利用Mφ回輸治療在肝纖維化、肺泡沉積癥、糖尿病腎病、腫瘤中的相關(guān)研究中均取得了一定的進(jìn)展。然而，由于Mφ具有起源、活化和功能的異質(zhì)性，因而，深入研究Mφ異質(zhì)性在不同疾病中的作用和機制，是將來實現(xiàn)臨床靶向Mφ治療疾病的前提。而且我們有理由相信，在分子機制揭示的前提下，利用基因編輯技術(shù)體外改造Mφ可能是未來靶向Mφ治療疾病的重要途徑之一。把Mφ這一古老的細(xì)胞用多種手段改造武裝后，有望成為治療人類多種疾病的候選明星細(xì)胞。其也將成為繼干細(xì)胞療法、DC療法和CAR-T療法后的另一種強大的細(xì)胞治療技術(shù)，為治愈疾病提供新策略。