宋曉婉， 梁 璐

［1漢氏聯(lián)合（天津）干細胞研究院有限公司，天津301700；2天津百恩生物科技有限公司，天津300318］

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是再生醫(yī)學領域中應用最廣泛的干細胞［1］。MSC 具有抗炎、免疫調節(jié)、損傷修復、促血管新生及抗纖維化等生物學特性。目前MSC在肺損傷疾病中的治療研究越來越多，實驗數(shù)據(jù)表明MSC 能夠明顯降低肺部炎癥反應，減少肺組織損傷［2］。越來越多的研究表明MSC 發(fā)揮治療作用的主要機制是旁分泌作用，間充質干細胞來源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-EXOs）作為其主要的旁分泌組分，是其發(fā)揮生物學功效的關鍵。本文就MSC-EXOs的生物學特性及其對急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和其他肺損傷疾病的治療作用和潛在機制做一綜述。

1 MSC-EXOs的生物學特性

外泌體是一種胞外脂質雙層膜囊泡，直徑為40～100 nm，密度為 1.10～1.18 g/mL，表達特異膜蛋白CD9、CD63 和 CD81［3］，電鏡下觀察呈典型杯狀形態(tài)。外泌體廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁和汗液中，是介導旁分泌效應的重要信使［4］。外泌體主要通過3種方式作用于靶細胞，從而實現(xiàn)胞間通訊進而發(fā)揮生物學效應：（1）直接與靶細胞膜融合，將內容物蛋白質、mRNA、miRNA 和siRNA釋放到細胞質中；（2）通過胞吞作用被靶細胞攝?。唬?）外泌體辨別并結合靶細胞表面上的特異性受體。此外，不同細胞來源的外泌體參與不同的生理病理過程，如處理廢棄蛋白質、呈遞抗原、交換遺傳信息、免疫應答、組織修復再生以及代謝，參與血管生成、炎癥、腫瘤轉移等。這些功能的發(fā)揮取決于外泌體中的活性組分，尤其是RNA 和蛋白質?，F(xiàn)有手段很難獲得純的外泌體成分，多是以外泌體為主的胞外微囊泡。胞外囊泡根據(jù)尺寸大小可分為凋亡小體、微泡和外泌體。除凋亡小體直徑大于1 μm 外，微泡和外泌體都屬于納米級別，但兩者產生的途徑不同。微泡是由質膜脫落產生的，而外泌體的產生則是通過胞內體途徑，即早期內體膜凹陷形成具有許多腔內囊泡的多泡體，多泡體與質膜融合釋放出外泌體，因此外泌體也是從內體分泌的唯一一類細胞外囊泡［5］。

目前，MSC-EXOs 已成研究熱點，MSC-EXOs 攜帶豐富的親本細胞來源的蛋白質、RNA 等生物活性物質，發(fā)揮類似于MSC 的生物學功能，其運輸、保存的條件與蛋白質類似，相比MSC 更具成藥優(yōu)勢。研究表明MSC-EXOs 具有免疫調節(jié)、抗炎、抗纖維化、抑制氧化應激、增強血管生成等作用。MSC-EXOs富含糖酵解相關酶，可增加ATP 的產生，減少組織細胞死亡［6］；MSC-EXOs 含有血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10 和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等細胞因子，有利于血管生成和免疫調節(jié)［7］；此外，外泌體中的miRNA 可調控基因表達，參與多種生理病理過程，如外泌體釋放的miR-125b-5p能夠促進心肌梗死區(qū)的功能恢復［8］。

2 MSC-EXOs對ALI的治療作用及其潛在機制

ALI 是指肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭肺損傷。根據(jù)發(fā)病原因分為：（1）直接肺損傷因素：嚴重肺部感染，胃內容物吸入，肺挫傷，吸入有毒氣體，淹溺、氧中毒等；（2）間接肺損傷因素：嚴重感染，嚴重的非胸部創(chuàng)傷，急性重癥胰腺炎，大量輸血，體外循環(huán)，彌漫性血管內凝血等［9］。ALI 發(fā)展至嚴重階段（氧合指數(shù)＜200）被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ARDS 致死率高且無特效藥，幸存活下來也多伴有后遺癥，影響長期生活質量。大量臨床前研究表明MSC-EXO對ALI引起的肺泡上皮及內皮細胞損傷、肺泡液清除率下降、肺纖維化等具有治療作用。以下就MSC-EXOs 對ALI 的可能作用機制進行了歸納和總結。

2.1 免疫調節(jié)/抗炎特性 炎癥失調是ALI/ARDS的一個關鍵病理學特征。MSC 對固有免疫反應和適應性免疫反應均具有免疫調節(jié)作用，在ALI 動物模型的治療中發(fā)揮抗炎作用［10-12］。

在不同的ALI 動物模型中，MSC-EXOs 均能降低炎癥因子表達水平并改善肺功能［13-16］。MSC-EXOs能抑制B 細胞增殖分化，并呈劑量依賴關系［17］。MSC-EXOs 能誘導 Th 細胞向 Th2 細胞而不是 Th1 細胞轉化，能抑制T細胞向Th17細胞分化，增加調節(jié)性T 細胞水平［18］。Del Fattore 等［19］和 Frvaro 等［20］證明，MSC-EXOs 能增加調節(jié)性T 細胞和效應性T 細胞比例，抑制T 細胞釋放促炎細胞因子如干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及 IL-1β，促進抗炎細胞因子如 TGF-β、IL-10及前列腺素E（2prostaglandin E2，PGE2）表達。多項研究結果表明，MSC-EXOs 能將促炎M1 型巨噬細胞極化為抗炎M2 型巨噬細胞。Ti 等［21］的研究表明，經脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）預處理的MSC 釋放的外泌體能促進巨噬細胞向M2型極化，進一步研究結果顯示此效應機制是由外泌體轉運microRNA let-7b 激活 TLR4/NF-κB/STAT3/AKT 調節(jié)的信號通路所介導的。在LPS誘導的ALI小鼠模型中，MSC 可通過外泌體介導線粒體轉移，促進巨噬細胞向抗炎表型轉化，從而有效緩解肺損傷［22］。在小鼠缺血再灌注肺損傷模型中，MSC-EXOs 能顯著降低M1 型巨噬細胞相關因子 IL-8、IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表達，增加M2 型巨噬細胞免疫抑制細胞因子IL-10 和 TGF-β 的表達［23］。近來 Huang 等［24］研究表明，與年輕MSC-EXOs相比，衰老MSC-EXOs不能成功誘導炎癥肺組織中M2型巨噬細胞的產生，提示外泌體的功能與其親本細胞的功能狀態(tài)直接相關。

2.2 對肺泡上皮和內皮細胞的保護作用 MSCEXOs能抑制肺泡上皮的凋亡，起到保護作用。MSCEXOs 能夠增加內毒素損傷性的Ⅱ型肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AECs）內ATP 的水平，提高AECs 存活率［25］。Yi 等［26］將 LPS 處理的Ⅱ型 AECs 與過表達miR-30b-3p 的MSC-EXOs 共培養(yǎng)，結果顯示MSC-EXOs 有效抑制AECs 凋亡，促進其增殖。除了保護效應外，MSC-EXOs可能通過調節(jié)炎癥肺組織中蛋白酶/抗蛋白酶平衡來保護肺上皮細胞。Harrell等［27］的研究表明，α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）聚集吸附于 MSC-EXOs 表面（AAT 的天然載體），促進外泌體的穩(wěn)定及體內活性。AAT 是中性粒細胞源蛋白水解酶的一個潛在抑制劑，能保護肺上皮細胞并發(fā)揮抗炎免疫調節(jié)效應。經IL-1β 預處理的MSC-EXOs，其AAT 基因表達更高，且與非IL-1β預處理的MSC-EXOs 相比具有更高的抗彈性蛋白酶活性。

MSC-EXOs 對肺血管內皮也具有保護作用。Li等［23］證明，MSC-EXOs對氧化應激誘導的肺內皮細胞凋亡具有保護作用，該作用依賴于外泌體中miR-21-5p 的抗凋亡特性。氣管內給予MSC-EXOs 能抑制肺內皮細胞內源和外源凋亡途徑，用miR-21-5p拮抗劑對MSC 進行預處理則完全消除了MSC-EXOs 介導的caspase-3、-8 和-9 抑制效應，降低了保護作用。人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）和程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）是 miR-21-5p的主要靶點，經miR-21-5p 拮抗劑處理的MSC-EXOs治療缺血再灌注損傷小鼠時，其PTEN 和PDCD4 的表達沒有減少，肺內皮細胞持續(xù)凋亡，表明miR-21-5p 抑制PTEN 和PDCD4 表達進而保護肺內皮細胞是外泌體治療缺血再灌注肺損傷小鼠的作用機制。

2.3 改善肺泡液清除率 體內外研究證明注射MSC 能恢復LPS 誘導的ALI 及嚴重性細菌性肺炎導致的肺泡液清除率下降，部分機制是MSC 通過分泌角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）和血管生成素 1（angiopoietin-1，Ang-1），恢復Ⅱ型AECs 中關鍵的鈉離子通道ENaCα，并防止肺上皮肌動蛋白應力纖維形成［28-29］。Li 等［30］也證明 MSC 通過分泌 KGF 上調 Na+-K+-ATP 酶 α1 亞基的表達，進而恢復Ⅱ型肺泡上皮細胞肺泡液的轉運功能。

MSC-EXOs 改善肺泡液清除率的機制與MSC 相似。MSC-EXOs 通過將KGF mRNA 轉運至靶細胞，恢復其肺泡液清除率，進而對大腸桿菌感染性肺炎小鼠模型和大腸桿菌感染性損傷的人肺組織的肺泡上皮細胞起到了保護作用［25，31］。MSC-EXOs 通過將Ang-1 mRNA 轉運至靶細胞，阻止肌動蛋白應力纖維的形成，進而恢復損傷的人肺微血管內皮細胞的蛋白通透性［32］。

2.4 抗菌活性 研究表明MSC能分泌抗菌因子，如脂蛋白2 或IL-37，直接參與抗菌；或者通過調節(jié)單核/巨噬細胞來增加對細菌的吞噬作用，進而間接參與抗菌。此外，MSC 還可以抑制中性粒細胞的凋亡，延長白細胞存活，增加抗菌活性，減少免疫細胞向受損肺泡轉運［33-34］。

MSC-EXOs 可以通過轉運線粒體至損傷肺泡單核/巨噬細胞，增加其氧化磷酸化，從而誘導巨噬細胞吞噬作用增強［22］。MSC-EXOs 還可通過促進白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）的合成增加肺部浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬作用和抗菌活性［35］。MSC-EXOs 中的miR-145 能降低肺泡巨噬細胞中多藥抗性相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）的表達，進而導致肺泡巨噬細胞LTB4釋放增加，提高了抗菌活性和細菌清除率，減輕了小鼠細菌性肺炎的嚴重程度［35］。有趣的是，用TLR3 激動劑或 IFN-γ 預處理 MSC 能增強 MSC-EXOs的抗菌效應［25，36］。

MSC-EXOs 也有助于病毒清除。Qian 等［37］的研究表明，臍帶來源的MSC-EXOs 能將miRNA（包括let-7f、miR-145、miR-199a 及 miR-221）轉運至宿主細胞，進而抑制丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV）復制，且與干擾素α 或者特拉普韋聯(lián)合用藥時能增強其抗HCV能力。

2.5 對肺纖維化的抑制作用 肺纖維化是肺部嚴重纖維增生失調，其特征是成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞［38］。在特發(fā)性肺纖維化小鼠模型中，MSC-EXOs可減少膠原沉積和炎癥反應，進而改善肺纖維化［39］。單純靜脈注射人骨髓來源MSC-EXOs 顯著地緩解了博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，MSC-EXOs 治療后，肺組織中Ashcroft 評分得到改善，膠原沉積減少；其主要作用機制是通過調節(jié)巨噬細胞表型和功能來實現(xiàn)的［40］。MSC-EXOs 顯著減少了表達 TGF-β1、精氨酸酶1（arginase-1，ARG-1）和 CD206 的肺泡巨噬細胞的數(shù)目，提示巨噬細胞可能是外泌體的主要細胞靶標。給予成纖維細胞來源的外泌體治療時無抗纖維化療效，表明外泌體的療效與其親本細胞性質有關。

用MSC來預防二氧化硅誘導肺炎小鼠的肺部炎癥和纖維化時，Phinney 等［41］研究表明 MSC-EXOs 含有大量的miR-451（一種TNF及巨噬細胞遷移抑制因子），miR-451 可以調節(jié)巨噬細胞Toll 樣受體信號及相關細胞因子分泌。MSC-EXOs 可能通過轉運miR-451增加其在巨噬細胞中的表達來抑制TNF的分泌，以此應答二氧化硅的刺激。

3 MSC-EXOs對其他肺損傷疾病的治療作用

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種進行性疾病，其特征是肺動脈重塑、肺浸潤增加、血管腔橫截面積減少及肺血管阻力增加。前期誘因導致的免疫失調、促炎性巨噬細胞活化和炎癥介質升高對于PAH 的后期發(fā)展至關重要。研究表明，MSC-EXOs能夠介導促炎性與抗炎性巨噬細胞之間的平衡，維持了免疫穩(wěn)態(tài)，緩解了PAH的惡性發(fā)展［42］。除了免疫調節(jié)作用，MSC-EXOs對線粒體功能也具有保護作用，進而能夠緩解PAH。MSC-EXOs 通過抑制人組蛋白脫乙酰酶sirtuin-4 的表達，增加了肺動脈平滑肌細胞中丙酮酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶的表達，恢復肺動脈平滑肌細胞的能量平衡，提高耗氧量，從而改善了疾病相關的線粒體功能［43］。

在高氧誘導的支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）大鼠模型實驗研究中，通過氣管內給予MSC 或MSC-EXOs 來對比兩者效果，結果表明兩者對BPD 都有緩解作用，且MSC-EXOs 改善肺泡化及肺血管化參數(shù)的效果更好，表明MSCEXOs 是一種有效的治療 BPD 的方法［44］。在新生兒高氧性BPD 模型中，MSC-EXOs 治療改善了肺泡化、纖維化和肺血管重塑的情況，進而增強了肺功能。MSC-EXOs能顯著激活骨髓來源的巨噬細胞，降低了TNF-α、IL-6等巨噬細胞M1表型標志物的表達水平，提高了Arg1、CD206 等M2 表型標志物的表達。這表明MSC-EXOs 通過調節(jié)巨噬細胞免疫表型，抑制促炎性 M1 表型，增強抗炎 M2 表型從而改善 BPD［45］。在另一項高氧誘導的BPD 小鼠模型研究中，腹腔注射MSC-EXOs 可以減輕肺部炎癥，改善肺泡-毛細血管滲透性，抑制肺組織形態(tài)學改變。研究者認為MSC-EXOs 中的腫瘤壞死因子刺激基因6（tumor necrosis factor-stimulated gene-6，TSG-6）對BPD 治療至關重要。TSG-6沉默的MSC 分泌的MSC-EXOs 不具有治療BPD的效果，證明MSC-EXOs中的TSG-6是治療BPD的關鍵蛋白［46］。

MSC-EXOs 對過敏性氣道炎癥具有修復作用。在曲霉菌絲提取物誘導的ALI 模型中，MSC-EXOs 減緩了氣道高反應性，肺部炎癥，抑制了支氣管肺泡灌洗液中可溶性Th2/Th17 相關細胞因子表達，這表明MSC-EXOs 通過將Th2/Th17 炎癥反應轉化為反調節(jié)性Th1 反應，減輕炎癥，緩解了Th2/Th17 介導的氣道高反應性［47］。

4 結論與展望

綜上所述，大量臨床前研究已證明MSC-EXOs對各種肺損傷病理進程均具有一定治療緩解作用，其作用機制主要是通過將生物活性成分，如蛋白因子、miRNA、mRNA 等轉運至靶細胞中發(fā)揮其類似于親本細胞的免疫調節(jié)，損傷修復等治療作用。這為MSC-EXOs 作為一種無細胞療法治療肺損傷提供了理論依據(jù)。目前動物實驗中應用的MSC-EXOs 的組織來源基本都是小鼠或者大鼠的骨髓［13，41］；人源的MSC-EXOs 的組織來源主要是骨髓［25，31-32，47］，也有研究者使用的是臍帶［16］或脂肪［24］來源的。而 MSCEXOs 的培養(yǎng)方法沒有統(tǒng)一標準，或使用無血清培養(yǎng)基［15，26，47］，或使用化學限定培養(yǎng)基［6］，或使用去外泌體血清培養(yǎng)基［24］；培養(yǎng)時長也各異，過夜、24 h、48 h或72 h 的報道均有。MSC-EXOs 對保存條件要求不高，重懸于PBS 中置于-80 ℃保存是常見的保存方式［15，24，26］。

MSC-EXOs 與 MSC 相比更具治療優(yōu)勢：（1）降低了干細胞治療的致瘤風險；（2）可在無二甲亞砜的情況下凍存于-80 ℃而不失活；（3）體積小，易于在血液系統(tǒng)中循環(huán)，不易造成微血管阻塞。雖然MSC-EXOs在治療應用方面很有潛力，但是大都還只停留在臨床前階段，還需要更多的臨床數(shù)據(jù)來驗證其療效。截至到2020 年8 月3 日在clinicaltrial 網站上注冊的關于MSC-EXOs的臨床試驗有9例，用于治療急性缺血性中風、難治性黃斑裂孔、移植物抗宿主病干眼癥及阿茲海默癥等。在MSC-EXOs 向臨床轉化的過程中仍有許多難題亟需解決：（1）亟需建立外泌體質量體系標準：不同來源，不同培養(yǎng)條件，不同預處理以及細胞老化等問題都會影響到外泌體的質量和效力；（2）亟需規(guī)?；苽涔に嚭图兓夹g：如何通過大規(guī)模生產獲得足量的原液，和規(guī)模化的分離提純方法獲得高純度的MSC-EXOs 來滿足臨床需求，是目前MSC-EXOs 生產制備中亟需解決的問題；（3）亟需最適的臨床應用方式：目前動物實驗中的給藥方式主要是局部氣管內給藥［44］和靜脈給藥［47］，兩種治療方式均有效［25］。治療的效果和MSC-EXOs 的給藥濃度呈正相關，但如何確定最佳給藥劑量、濃度及給藥途徑還需要更深入的研究。隨著研究的深入和全面，MSC-EXOs作為一種基于干細胞的無細胞治療方法未來將有可能成為替代干細胞治療的有效手段，將獲得更長足的發(fā)展。