趙孟良，任延靖，田閔玉，鐘啟文

(1青海大學(xué) a農(nóng)林科學(xué)院/青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,b三江源生態(tài)和高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜、鬼子姜、姜不辣，屬菊科(Composite)向日葵屬(Helianthus)多年生草本植物[1]，其起源于北美中部地區(qū)，在美國、加拿大和墨西哥等國家分布較多，我國大部分省區(qū)也都有分布[2]。菊芋通常以野生形式存在，是自然的同源或者異源六倍體，染色體數(shù)2n=102，具有天然的抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄等優(yōu)良特性。菊芋塊莖富含菊粉(果聚糖)，占干物質(zhì)含量的80%以上，是一種良好的加工利用作物，其莖葉富含纖維素等營養(yǎng)物質(zhì)，可作為家畜飼料的優(yōu)質(zhì)原料[3-4]。

倍性育種是利用人工誘發(fā)植物染色體數(shù)目變異的材料選育新品種或新種質(zhì)的育種技術(shù),可大大縮短育種年限。染色體作為遺傳物質(zhì)的載體，其重組常常會導(dǎo)致新種的出現(xiàn)并在一定程度上能夠反映生物的本質(zhì)[5]。倍性鑒定是倍性育種及其應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)[6]。傳統(tǒng)的倍性鑒定方法主要依靠染色體計(jì)數(shù)法。楊柳慧等[7]采用染色體計(jì)數(shù)法對5個(gè)芍藥屬伊藤雜種進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明5個(gè)芍藥屬伊藤雜種均為三倍體(2n=3x=15)，核型不對稱系數(shù)為61.02%～62.41%，核型均屬于2A型。何業(yè)華等[8]以根尖細(xì)胞為材料對5個(gè)黃皮品種實(shí)生苗進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果顯示它們均為二倍體(2n=2x=18)，未發(fā)現(xiàn)隨體、多倍和混倍現(xiàn)象。韓毅科等[9]采用染色體計(jì)數(shù)法對黃瓜的研究發(fā)現(xiàn)，與葉芽、莖尖相比，卷須更適合作為倍性鑒定的材料。郭啟高等[10]以西瓜離體培養(yǎng)過程中的不定芽葉尖為材料，在顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)早期可100%檢測倍性。梁森林等[11]通過流式細(xì)胞術(shù)和染色體制片確定枇杷天然實(shí)生篩選株系B431為四倍體。染色體計(jì)數(shù)法操作過程比較復(fù)雜，工作量大，且本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用該方法對菊芋進(jìn)行倍性檢測效果并不明顯。流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選的裝置，自20世紀(jì)80年代以來得到較為廣泛的應(yīng)用，近幾年來被普遍用于測試基因組大小和染色體倍性，是目前最高效、快速的倍性鑒定方法。其原理是根據(jù)物理、化學(xué)及生物學(xué)特性對細(xì)胞群進(jìn)行定量分析、分選，將檢測樣本與標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞的熒光值相比較，進(jìn)而推算出待檢測樣本的染色體倍性水平[12]。呂順等[13]利用流式細(xì)胞儀快速準(zhǔn)確地鑒定了169份香蕉種質(zhì)資源的倍性。田路明等[14]利用流式細(xì)胞儀對260份梨種質(zhì)資源染色體倍性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明供試的21份多倍體材料的倍性與前人鑒定結(jié)果一致，同時(shí)新發(fā)現(xiàn)9份三倍體種質(zhì)。菊芋由于自交不親和性，結(jié)實(shí)率低，實(shí)際生產(chǎn)中主要采用塊莖進(jìn)行無性繁殖。目前國內(nèi)針對菊芋種質(zhì)資源倍性的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。本研究建立了基于流式細(xì)胞儀的菊芋倍性鑒定的方法，并用該方法對302份菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，以期為從細(xì)胞學(xué)層面了解菊芋及其遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料 2個(gè)向日葵(HelianthusannuusL.，2n=2x=34)、18-c7和pL3白菜(Brassicarapa，2n=2x=20)、302份倍性未知的菊芋(見表1)，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心提供。302份菊芋種質(zhì)的來源為：中國140份、法國25份、美國45份、丹麥14份、泰國27份、以色列3份、加拿大1份，另外47份來源未知。將上述材料種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院菊芋種質(zhì)資源圃內(nèi)，在盛花期取老葉、嫩葉、塊莖和根等樣品，備用。老葉選取距離頂端10片葉左右生長良好的葉片，沿葉脈處撕取葉片下表皮，備用；嫩葉選取部位為植株頂端頂芽處的幼嫩葉片；塊莖選取頂芽下端3 cm處薯肉；根選取光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)中產(chǎn)生的根尖。每個(gè)部位取3個(gè)混合樣。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分析純級，天津市博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；CyStain UV Precise P試劑盒，型號05-5002。Cyflow Plody Analyser型流式細(xì)胞儀(簡稱Cyfiow PA)，希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測方法的建立

1.2.1 材料處理與檢測方法 取0.1 g新鮮樣品置于直徑6 cm的一次性培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的核裂解液200 μL，用鋒利的雙面刀片快速將樣品切碎(5～10個(gè)樣品后更換雙面刀片)，切碎過程中樣品始終浸于核裂解液中。樣品切碎后加入800 μL染色緩沖液孵育20 s，留樣后加入40 g/L的PVP溶液1 mL，搖勻。將加PVP前后的樣品用48 μm的細(xì)胞過濾器過濾至上樣管中，用Cyflow Plody Analyser型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品收集3 000個(gè)以上細(xì)胞核。以細(xì)胞核DNA相對含量的熒光強(qiáng)度(RED-A)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞核數(shù)量為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.2 電壓的確定 根據(jù)流式細(xì)胞儀推薦的菊芋檢測電壓(340～440 V)，設(shè)定不同梯度的電壓(340，365.3和422 V)對加PVP前后的菊芋嫩葉進(jìn)行檢測，以確定菊芋檢測的最適電壓。

1.2.3 檢測部位的確定 倍性鑒定過程中材料選擇十分重要，不同部位材料的倍性檢測效果不同。利用已篩選出的最優(yōu)電壓，對菊芋塊莖、根、老葉、嫩葉加PVP的樣品進(jìn)行倍性檢測，確定菊芋最適檢測部位。

1.2.4 體系的穩(wěn)定性試驗(yàn) 利用已經(jīng)優(yōu)化的菊芋倍性檢測體系，分別以JA005菊芋、JA185菊芋、白菜18-c7、白菜pL3及2個(gè)向日葵的嫩葉為材料，進(jìn)行體系穩(wěn)定性檢測。

1.3 菊芋倍性的鑒定

利用建立的方法對302份菊芋種質(zhì)進(jìn)行檢測，以二倍體的向日葵作為對照，將待測樣品與之比較，根據(jù)它們之間的關(guān)系，得出相應(yīng)的菊芋染色體倍數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)置3組重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Flowjo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，參考Dole?el等[15]的方法進(jìn)行菊芋染色體倍數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀倍性檢測方法的優(yōu)化

2.1.1 檢測電壓的篩選 由圖1可以看出，在電壓為422 V時(shí)，檢測圖譜無明顯主峰，且雜峰較多；在340 V電壓下，檢測圖譜雜峰減少，但主峰偏離檢測系統(tǒng)界面；調(diào)整電壓為365.3 V時(shí)，檢測圖譜主峰能全部呈現(xiàn)，但伴有不顯著的雜峰。由于菊芋組織中富含多酚類物質(zhì)及多糖，僅通過調(diào)整電壓無法完全排除雜峰的干擾，而PVP的作用主要是防止植物細(xì)胞中多酚類物質(zhì)氧化，故本研究分析了樣品處理時(shí)添加PVP對檢測效果的影響，結(jié)果(圖2)表明，添加PVP后在3種不同電壓下雜峰均很大程度減少，其中以365.3 V下效果最優(yōu)，主峰單一且無雜峰，便于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果說明，365.3 V是流式細(xì)胞儀檢測菊芋的合適電壓。

圖1 不同電壓下流式細(xì)胞儀法對菊芋倍性分析的檢測效果

圖2 添加PVP后不同電壓下流式細(xì)胞儀法對菊芋倍性分析的檢測效果

2.1.2 菊芋不同部位材料的篩選 利用已篩選出的最優(yōu)電壓，對添加PVP的菊芋塊莖、根、老葉、嫩葉4個(gè)部位樣品進(jìn)行倍性檢測，結(jié)果(圖3)表明，菊芋不同部位樣品檢測圖譜均可出現(xiàn)主峰，且無明顯雜峰。對比不同部位樣品的倍性檢測效果發(fā)現(xiàn)，菊芋塊莖中雖然細(xì)胞含量較高，但塊莖中富含糖類及酚類物質(zhì)，在主峰兩邊出現(xiàn)低微雜峰；菊芋根有主峰出現(xiàn)，但主峰位置偏移，且細(xì)胞含量較少；菊芋老葉中細(xì)胞新陳代謝速率緩慢，死亡細(xì)胞較多，同樣在主峰兩邊出現(xiàn)不規(guī)律的輕微雜峰，且細(xì)胞含量較低；新鮮幼嫩菊芋葉片細(xì)胞含量較高，主峰單一且無雜峰。因此，菊芋新鮮幼嫩的葉片是倍性測定的理想材料。

圖3 流式細(xì)胞儀法對菊芋不同組織倍性的檢測效果

2.1.3 優(yōu)化體系的穩(wěn)定性驗(yàn)證 利用已經(jīng)優(yōu)化的菊芋倍性檢測體系，分別以菊芋JA005、JA185，白菜18-c7、pL3及向日葵的嫩葉為材料，進(jìn)行體系穩(wěn)定性檢測，結(jié)果見圖4。圖4表明，該體系對菊芋倍性的檢測效果穩(wěn)定可靠；對已知倍性的白菜檢測時(shí)出現(xiàn)了2個(gè)峰值，說明該體系并不適合白菜倍性的檢測；對向日葵的倍性檢測效果也較穩(wěn)定。結(jié)果表明，針對不同科屬的作物采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定時(shí)，需要提前優(yōu)化鑒定體系。

圖4 流式細(xì)胞儀法檢測菊芋倍性體系的穩(wěn)定性評估

2.2 菊芋種質(zhì)資源倍性檢測

基于已優(yōu)化出的菊芋倍性檢測體系，以已知的二倍體向日葵為參照，對302份菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行倍性檢測及篩選。結(jié)果(表1)表明，302份菊芋資源倍性的整體變異系數(shù)為2.17～9.74，推導(dǎo)的倍性有二倍體、四倍體和六倍體，其中二倍體共3份，僅占資源總數(shù)的0.99%；四倍體共25份，占資源總數(shù)的8.28%；六倍體共274份，占資源總數(shù)的90.73%。

表1 流式細(xì)胞儀法對302份菊芋種質(zhì)資源倍性的檢測結(jié)果

3 討 論

流式細(xì)胞儀能夠?qū)?xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、染色體、RNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行快速檢測并可分類收集。然而針對不同作物采用不同型號的流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測時(shí)，需要對樣品處理?xiàng)l件、儀器參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，建立相應(yīng)的檢測體系。本研究采用Cyflow Plody Analyser型流式細(xì)胞儀，對菊芋倍性檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同電壓處理對檢測結(jié)果影響較大，電壓過大主峰容易跑出檢測界面，又可成為偏鋒現(xiàn)象。偏鋒現(xiàn)象是流式細(xì)胞儀檢測中一種常見現(xiàn)象，屬于檢測誤差。Farnham等[16]認(rèn)為，樣品熒光染色后放置的時(shí)間太長會導(dǎo)致偏鋒現(xiàn)象出現(xiàn)，這種現(xiàn)象通過重復(fù)檢測和縮短樣品熒光染色后放置的時(shí)間有時(shí)可以消除[17]。

針對不同檢測樣品特性，為排除樣品內(nèi)源物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，首先應(yīng)明晰檢測樣本的特性，如菊芋組織富含酚類及糖類物質(zhì)，對檢測結(jié)果影響較大，而PVP是乙烯基吡咯烷酮通過自由基乙烯聚合反應(yīng)得到的高分子均聚物，可用作片劑和顆粒劑藥物的穩(wěn)定劑。在菊芋倍性檢測中添加PVP溶液，可有效抑制菊芋組織內(nèi)干擾物質(zhì)對檢測效果的影響。

通過對比菊芋不同部位樣品的倍性檢測效果可知，不同部位樣品在已優(yōu)化的電壓及添加PVP試劑下均能出現(xiàn)較好的結(jié)果，說明取材部位的不同對檢測結(jié)果無顯著影響，但考慮到菊芋塊莖富含糖類及多酚類物質(zhì)、老葉中死亡細(xì)胞較多、根中細(xì)胞數(shù)量較少等因素易對檢測結(jié)果造成影響，故推薦選用幼嫩菊芋葉片作為菊芋倍性檢測的首選材料。

在流式細(xì)胞儀實(shí)際操作過程中還應(yīng)考慮到儀器型號及電壓閾值的設(shè)定。電壓閾值不是一個(gè)非常精確的數(shù)據(jù)，雖有經(jīng)驗(yàn)值，但實(shí)際過程中應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)節(jié)[18]。本研究按照流式細(xì)胞儀使用說明推薦的電壓閾值進(jìn)行設(shè)定后，發(fā)現(xiàn)對檢測結(jié)果影響不大，故未再對電壓閾值進(jìn)行優(yōu)化。流式細(xì)胞分析的對象是活細(xì)胞，若檢測樣品中死亡細(xì)胞較多，檢測時(shí)儀器會將死亡細(xì)胞計(jì)入細(xì)胞總數(shù)，從而影響檢測結(jié)果的可靠性。因此在樣品實(shí)際處理過程中應(yīng)盡可能縮短上樣時(shí)間，研磨時(shí)要輕，以減少死亡細(xì)胞數(shù)量。

本研究選用向日葵和白菜對建立的菊芋倍性檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，選用向日葵是考慮到菊芋與向日葵同屬于菊科向日葵屬，親緣關(guān)系較近，能夠反映該方法在同科屬作物中是否穩(wěn)定；選用白菜主要是考慮在其他已知倍性的蔬菜作物上再次驗(yàn)證該方法的可靠性。

Georgiev等[19]認(rèn)為，流式細(xì)胞儀檢測的變異系數(shù)在9%以內(nèi)，其檢測結(jié)果比較可靠。本研究中302份資源的變異系數(shù)有291份均在9%以內(nèi)，即97%的資源檢測結(jié)果是有效的，也說明建立的菊芋倍性檢測體系是可靠的。另外有9份菊芋資源倍性的變異系數(shù)在9%～10%，且部分2倍體的變異系數(shù)大于4倍體及更高倍性的變異系數(shù)，這與柳青慕等[20]的研究結(jié)果不同，推測認(rèn)為菊芋種質(zhì)資源中可能存在混倍體現(xiàn)象，這有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

建立了菊芋種質(zhì)資源倍性流式細(xì)胞儀檢測方法，該法檢測條件為：選取幼嫩葉片為樣品，樣品處理時(shí)添加PVP溶液以消除多酚及多糖等物質(zhì)的干擾，檢測電壓選用365.3 V；該法檢測效果較好，準(zhǔn)確性較高。302份菊芋種質(zhì)資源倍性整體變異系數(shù)在2.17～9.74，二倍體共3份，僅占資源總數(shù)的0.99%；四倍體共25份，占資源總數(shù)的8.28%；六倍體共274份，占資源總數(shù)的90.73%。該體系的建立及菊芋種質(zhì)資源倍性的明確為后續(xù)菊芋倍性育種奠定了理論基礎(chǔ)。