邵思邁,史 洺,余姊陽,原 野,游言文,郝 莉,張紫娟,張振強(qiáng)*
(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的兩個典型病理特征分別是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP) 的水解產(chǎn)物 β 淀粉樣肽(amyloid-beta protein,Aβ)組成的胞外老年斑(senile plaque,SP)和微管穩(wěn)定蛋白質(zhì)(Tau)病理性磷酸化改變組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)[1]。 越來越多來自遺傳代謝、體內(nèi)成像和生化研究的證據(jù)表明,寡聚、可擴(kuò)散的Aβ 肽組合體的累積是AD 發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件,甚至是啟動病理性級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵[2]。
當(dāng)氧化還原平衡被打破, 過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在腦內(nèi)產(chǎn)生、蓄積,使腦細(xì)胞膜系統(tǒng)的蛋白、脂質(zhì)和DNA 等大分子發(fā)生氧化,即氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)。 研究表明Aβ淀粉樣聚集會使線粒體氧化還原活性降低,引發(fā)ROS 累積[3]。 毒性Aβ 誘導(dǎo)的受損線粒體能通過觸發(fā)N-甲基-d-天冬氨酸受體依賴的Ca2+流,導(dǎo)致大量ROS 的產(chǎn)生,而ROS 增加引起的氧化應(yīng)激和許多抗氧化酶系統(tǒng)功能損傷與AD 發(fā)展有著重要聯(lián)系[4]。此外,氧化應(yīng)激會進(jìn)入惡性循環(huán),因?yàn)檠趸a(chǎn)物ROS 會造成生物大分子的破壞,進(jìn)一步導(dǎo)致更高水平的ROS 積累。 故下文重點(diǎn)論述了AD 中毒性Aβ的產(chǎn)生機(jī)制,大分子氧化及Aβ 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的過程,希望闡明AD 發(fā)生發(fā)展過程中淀粉樣肽與氧化應(yīng)激的關(guān)系,希望對今后阿爾茨海默病抗氧化劑靶向研究有所幫助。
Aβ 是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶切產(chǎn)生的肽片段,也是AD 患者腦組織內(nèi)老年斑的主要成分。 淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說認(rèn)為,Aβ 沉積不僅會形成老年斑,而且沉積后纖維化且有神經(jīng)毒性的Aβ 是AD 產(chǎn)生的重要原因[5]。
APP 是一種特別存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中的大分子跨膜糖蛋白,其表達(dá)可因氧化應(yīng)激而增強(qiáng)。 在APP 結(jié)構(gòu)中存在多種特異性的水解位點(diǎn),β/γ 位點(diǎn)的裂解酶切可產(chǎn)生有神經(jīng)毒性的、具有 40 或 42 個氨基酸的肽段:Aβ1-40/42(Aβ40/Aβ42)[6],而 γ-酶切位點(diǎn)的水解產(chǎn)物含有完整 Aβ 序列,可產(chǎn)生 Aβ1-42[7]。 APP 水解的發(fā)生主要通過Aβ 生成途徑與非Aβ 生成途徑[8]。其中Aβ 生成途徑是一個連續(xù)兩步的蛋白水解步驟:首先由β-位點(diǎn)APP 裂解酶1(BACE1)通過切割A(yù)PP 產(chǎn)生含有99 個氨基酸殘基的羧基末端片段(CTF-β),再經(jīng)γ-分泌酶作用產(chǎn)生由39~43 個氨基酸組成的毒性 Aβ 和 CTF-γ[9]。 該途徑的主要分泌產(chǎn)物為40-氨基酸形式的Aβ(Aβ1-40)和羧基端含有兩個殘基的次要42-氨基酸形式,即Aβ1-42,而后者也被認(rèn)為是阿爾茨海默病發(fā)病的起始分子[10]。
Aβ1-42二聚體是Aβ 蛋白寡聚體中最小的聚合單位,也是最小的毒性單位。 Aβ1-42在磷酸鹽緩沖液中稀釋后能迅速形成纖維,而Aβ1-40孵育48 h 后才能形成纖維且不能形成雜亂肽(雜亂肽即亂序重排肽,是將自然肽氨基酸序列打亂重排產(chǎn)生的新肽,其氨基酸組成與自然肽相同但序列不同,是缺陷產(chǎn)物的一種)[11-12],所以 Aβ1-42比 Aβ1-40更易聚集,沉積時間也更早、更穩(wěn)定。 在單體和纖維結(jié)構(gòu)的直接激發(fā)下,可溶性β-構(gòu)象誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的研究結(jié)果表明只有寡聚體物會對神經(jīng)元有損傷。 也有研究表明氧化應(yīng)激不僅會引發(fā)神經(jīng)毒性,而且會增強(qiáng) Aβ 的寡聚化程度[13]。 螺旋 Aβ1-42的長度更長、偶極矩更大,所以與Aβ1-40相比具有更高的螺旋穩(wěn)定性。 高穩(wěn)定性為自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化提供了更多時間,也為Aβ1-42是肽最重要的氧化應(yīng)激位點(diǎn)的觀點(diǎn)提供了證據(jù)[14]。
除病理狀態(tài)下腦部出現(xiàn)的神經(jīng)原纖維增粗雙螺旋纏繞扭曲狀態(tài), 即神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)外,AD 患者腦中氧化還原平衡狀態(tài)也會發(fā)生改變[15]。 ROS 是氧被部分還原的衍生物,包括氧自由基及其歧化產(chǎn)物[16]。 神經(jīng)元細(xì)胞新陳代謝活躍,在代謝過程中的耗氧量約占人體總量的四分之一,其含有的抗氧化分子水平也更低,所以神經(jīng)元細(xì)胞受 ROS 超負(fù)荷的影響最大[17-18]。 ROS 會隨著時間的推移逐步累積,并導(dǎo)致過度暴露于ROS 及累積效應(yīng)的細(xì)胞受損退化[18],這也是氧化應(yīng)激誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病假說的依據(jù)。研究表明神經(jīng)元易受細(xì)胞衰老微環(huán)境影響,Aβ 沉積可通過產(chǎn)生過量的ROS 來誘導(dǎo)細(xì)胞老化[19]。 呼吸爆發(fā)也稱氧化爆發(fā),是免疫系統(tǒng)中的一種氧依賴性殺菌途徑,這一途徑會生成大量自由基,進(jìn)一步加劇Aβ 的沉積,形成惡性循環(huán)。 在ROS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的過程中,有神經(jīng)毒性的ROS 會攻擊蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)膜,使細(xì)胞的功能和完整性遭到破壞。這一過程也使氧自由基大量形成,并與鄰近脂肪酸鏈的氫分子不斷結(jié)合形成脂氫過氧化物,使脂質(zhì)過氧化過程不斷循環(huán)。 所以氧化應(yīng)激多表現(xiàn)為蛋白質(zhì)過氧化、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物和神經(jīng)毒性物質(zhì)(如Aβ1-42)的形成及核酸的過氧化修飾[20]。 Aβ1-40和Aβ1-42水平的升高也與海馬和皮質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的氧化產(chǎn)物水平增加有關(guān)[21]。
AD 中的蛋白質(zhì)氧化主要可分為羰基化和硝基化。 在APP / PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)的原代神經(jīng)元對外源Aβ1-42誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與亞硝化應(yīng)激的敏感性增加[22]。 在早發(fā)性AD 病人額葉皮質(zhì)中觀察到蛋白質(zhì)羰基水平增加引起了酶的誘導(dǎo)反應(yīng),同時脂質(zhì)過氧化物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)等水平升高[23]。 另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中檢測到AD 腦中蛋白質(zhì)硝基化、 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)水平均顯著增加,這兩者的一致上調(diào)表明硝基化在AD 發(fā)生發(fā)展中起作用[23]。
過度的脂質(zhì)過氧化是大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志。 脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide,LPO)是不飽和脂肪酸與ROS 結(jié)合的產(chǎn)物,會通過非酶解作用產(chǎn)生有強(qiáng)毒性的4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)。 用與AD 患者腦組織類似濃度的4-HNE 誘導(dǎo)神經(jīng)元觀察到神經(jīng)元內(nèi)的 Aβ 明顯增加2~6倍[24]。 胚胎成纖維細(xì)胞被過氧化氫誘導(dǎo)可引起細(xì)胞中4-HNE 水平增加,γ-分泌酶活性上調(diào),從而加劇APP 的裂解。 過氧化的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)能使Aβ 被清除能力下降,導(dǎo)致 Aβ 聚集。而與此結(jié)論一致,4-HNE 綁定跨膜的LRP1 后,AD患者腦中Aβ 含量在海馬區(qū)顯著增加[25]。
在AD 發(fā)病所涉及的機(jī)制中,氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的細(xì)胞成分的破壞是關(guān)鍵因素。 核酸的氧化標(biāo)記物為定位在Aβ 聚集形成的SP 和NFT 上的8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)和 8-羥基鳥苷 (8-hydroxy-guanosine,8-OHG)。 8-OHG 在早發(fā)性AD 病人海馬和額葉皮層中表達(dá)的增加證實(shí)了核酸過氧化與Aβ 聚集相關(guān)[26]。 有臨床實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了80例患者DNA 的氧化產(chǎn)物,其中8-OHdG 和8-OHdG/2dG 的比值在AD 和健康者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,可推測 DNA 氧化是 AD 的早期分子途徑[27]。RNA 氧化,尤其是額葉皮質(zhì)的mRNA 氧化也會在AD 中發(fā)生[28]。 同時 Nunomura 等[29]也提出,盡管神經(jīng)元RNA 氧化基本上是與年齡相關(guān)的現(xiàn)象,但RNA 損傷與 AD 前驅(qū)階段認(rèn)知障礙的發(fā)作明顯相關(guān)。
Aβ 是AD 發(fā)生發(fā)展中神經(jīng)元損傷與氧化應(yīng)激之間的橋梁。 桑德斯-布朗衰老研究中心發(fā)現(xiàn):在AD 中,富含Aβ1-42的腦區(qū)氧化應(yīng)激和大分子過氧化水平升高,而在 Aβ1-42較少的腦區(qū)則相反[30]。 Aβ會導(dǎo)致蛋白質(zhì)被氧化修飾、功能降低并使其發(fā)揮作用的關(guān)鍵生化和代謝途徑受損:包括葡萄糖代謝途徑、mTOR 激活途徑、蛋白質(zhì)平衡網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)磷酸化等[30]。 在 AD 發(fā)展過程中,APP 產(chǎn)生 Aβ 時會產(chǎn)生大量自由基;Aβ 也可以直接誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生自由基;氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生脂質(zhì)過氧化,并由它們的降解產(chǎn)物進(jìn)一步氧化修飾亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),影響神經(jīng)元的功能和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性,導(dǎo)致AD 一系列病理變化的產(chǎn)生[31]。 關(guān)于Aβ 的硫磺素染色實(shí)驗(yàn)也表明,在AD 早期即9 周齡時,5×FAD 小鼠腦內(nèi)已出現(xiàn)Aβ 沉積陽性結(jié)果并伴有工作記憶的下降,提示淀粉樣斑塊在形成初期即已導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[32]。 Murakami 等[33]的實(shí)驗(yàn)證明,氧化應(yīng)激會加速AD 轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ 寡聚體的形成和記憶缺失,而Aβ42突變體能誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS 大量生成并進(jìn)一步對神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞毒性。 在Li 等[1]研究中發(fā)現(xiàn),E22P-Aβ42促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi) ROS 的生成,說明毒性Aβ42的形成對細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生起關(guān)鍵作用,而且E22P-Aβ42比 Wt-Aβ42更快形成了聚集物的毒性中間體,表明胞漿內(nèi)自由基過多可直接導(dǎo)致Aβ42的寡聚。 連續(xù)兩周對大鼠注射Aβ1-42,會使其腦內(nèi)海馬、皮質(zhì)等部位的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)生成減少,由此引起大鼠學(xué)習(xí)能力與記憶功能障礙,表明Aβ1-42能損傷體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)[34]。
另一方面,Aβ 同時在線粒體中起作用。 Fran?a等[35]的實(shí)驗(yàn)分析了氧化應(yīng)激是淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)的原因還是后果,以及抗氧化防御系統(tǒng)在這一過程中的作用。 體外細(xì)胞研究結(jié)果表明,Aβ 的存在提高了細(xì)胞內(nèi)氧化水平,誘導(dǎo)了過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和烏頭酸酶等的活性。 Aβ 還改變了耗氧量和復(fù)合體III 和IV 的活性,表明Aβ 的毒性機(jī)制是通過增加線粒體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的。 在Aβ 高表達(dá)期間,線粒體中的ROS 濃度更高,以維持細(xì)胞器內(nèi)氧化還原平衡,而這種防御系統(tǒng)正是淀粉樣蛋白Aβ 表達(dá)過程中維持線粒體完整性的基礎(chǔ)。
在無外界影響的條件下,腦內(nèi)Aβ 沉積是不可逆的過程。 但最新研究發(fā)現(xiàn),有靶向的抗氧化藥物可能實(shí)現(xiàn)這一過程的逆轉(zhuǎn),說明氧自由基的代謝過程是一個動態(tài)調(diào)節(jié)過程。
神經(jīng)退行性疾病的致病因素大都涉及到氧化應(yīng)激,目前淀粉樣β 蛋白的毒性和氧化應(yīng)激是中心假說之一。 抗氧化劑是發(fā)揮延遲或抑制底物氧化作用的內(nèi)源或外源性分子,有清除ROS、抑制ROS生成和內(nèi)源性抗氧化劑的再生等多種機(jī)制[36]。 有證據(jù)表明抗氧化劑和自由基清除劑可通過抵抗Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和體內(nèi)外脂質(zhì)過氧化來保護(hù)神經(jīng)元[37]。 核因子 E2 相關(guān)因子 2/血紅素加氧酶-1( nuclear factor erythroid-2-related factor2/heme oxygenase 1,Nrf2/ HO-1)信號通路是一條針對應(yīng)激環(huán)境的多臟器保護(hù)通路,該通路通過調(diào)控抗氧化劑表達(dá)水平及表觀遺傳發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,可將內(nèi)源性應(yīng)激拒于機(jī)體外,延緩疾病進(jìn)展[38]。
NXPZ-2 是一種直接抑制Kelchlike ECH 相關(guān)蛋白1(Keap1)-Nrf2 相互作用的化合物,用NXPZ-2 處理注射Aβ 寡聚體建立的小鼠模型,小鼠全細(xì)胞裂解產(chǎn)物檢測中Nrf2 上調(diào)、核移位增加、靶向抗氧化酶HO-1 和NQO-1 增加,這表明 NXPZ-2 可能是一種很有前途的AD 治療劑,并支持Keap1-Nrf2 相互作用作為AD 中Nrf2 重新激活的有效靶點(diǎn)[39]。 p53凋亡刺激蛋白抑制因子(iASPP)的減少與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織對氧化應(yīng)激的易感性有關(guān)。 抗氧化劑紫丁香素的處理導(dǎo)致iASPP 上調(diào),iASPP 與Keap1 的相互作用增加,其介導(dǎo)的Nrf2 核轉(zhuǎn)位可通過iASPP/Nrf2 軸促進(jìn)Nrf2 下游基因的激活,恢復(fù)細(xì)胞的氧化還原平衡[40]。
總之,氧化應(yīng)激反應(yīng)與AD、Aβ 沉積之間有著密切的關(guān)系。 近年來的諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)論均可表明:具有清除活性氧和抑制氧化酶活性功能的物質(zhì)都可以用來緩解因Aβ 毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。 今后,對于氧化應(yīng)激、Aβ 與AD 之間的關(guān)系進(jìn)行深層次的研究是非常必要的,不論是對闡明阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)理,還是對尋找預(yù)防策略及治療方案都有著非常重要的意義。