張智慧,李想,黎昱江,吳云飛,吳旭

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院惠僑醫(yī)療中心胸外科(廣東廣州 510515)

呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率和病死率的上升已成為全球性的公共問題之一。呼吸系統(tǒng)持續(xù)暴露在各種各樣的刺激物中，比如有毒氣體、碳顆粒、病原體及其產物，急性或慢性的肺疾病主要由創(chuàng)傷、空氣污染、吸煙以及不同的致病病原體引起，肺泡上皮細胞和肺內免疫細胞之間相互作用維持了肺內環(huán)境的穩(wěn)定，并且這些細胞不斷地監(jiān)測肺內微環(huán)境，誘導對無害的吸入顆粒的耐受，提供有效的免疫反應來對抗入侵的微生物。一旦肺內微環(huán)境被破壞，將會多多少少引起肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)被認為是最嚴重的急性肺損傷疾病，它能引起頑固且致命性的低氧血癥，雙側胸片肺部實變。相關的研究表明炎癥免疫失調、失控的凝血途徑激活和肺泡上皮及毛細血管內皮損傷引起的通透性增加共同發(fā)揮了重要作用。盡管現(xiàn)代醫(yī)學的支持治療有很大的進步，但是此病的病死率仍然高達30%～40%[1]。慢性肺損傷代表的疾病有特發(fā)性肺纖維化(IPF)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。在急性或慢性肺組織損傷后，呼吸道上皮的修復靠上皮細胞、肺免疫細胞、成纖維細胞和軟骨細胞產生的細胞因子和生長因子。不恰當?shù)拿庖叻磻彤惓５男迯瓦^程會對肺組織造成不可逆的損害，通常會導致肺纖維化，隨后肺功能下降。吸入性糖皮質激素對炎癥性肺部疾病患者非常有效[2]，但它們的長期應用會增加肺炎、口腔念珠菌病、骨質疏松、股骨頭壞死、皮膚瘀傷和肺結核患病風險[3]。因此，我們急需新的方法來減輕炎癥反應，防止纖維結締組織的堆積，同時促進受損肺泡上皮細胞的再生。間充質干細胞(MSCs)由于具有抑制肺泡有害免疫和向Ⅱ型肺泡上皮分化的能力，因此可以用來作為治療急慢性肺損傷疾病的一種手段。它可以從許多組織比如骨髓、脂肪組織、羊水、胎盤、臍帶、外周血、肺、牙髓中獲得[4]，因此，在這篇文章中，我們總結了MSCs在治療肺部疾病方面的作用及未來的發(fā)展前景。

1 MSCs及其衍生物的治療機制

MSCs具有以下幾個特點[4-6]：(1)在標準培養(yǎng)條件下具有黏附性；(2)具有以下標記物CD105、CD73、CD90，缺少CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19和HLA-DR的標記物；(3)在體外具有能夠分化為軟骨細胞、脂肪細胞、成骨細胞的潛能。MSCs能夠調節(jié)增殖、活化免疫細胞，這些細胞包括抗原提呈細胞(樹突狀細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞)、中性粒細胞、調節(jié)性T細胞。他們在肺損傷疾病發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，MSCs能使Th1、Th2和Th17細胞失活，同時MSCs與抑制分子PD-1及其配體PD-L1和PD-L2共同抑制了T細胞的增殖[7]。MSCs可使細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1上調和細胞周期蛋白D2的抑制。通過這種方式，移植的MSCs可以顯著減少受損肺中效應T細胞的總數(shù)，并減弱Th1、Th2或Th17驅動的炎癥反應。MSCs可以通過分泌可溶性的免疫分子前列腺素2(PGE2)、轉化生長因子-β(TGF-β)、吲哚2-3雙加氧酶(IDO)和一氧化氮(NO)來抑制持續(xù)性T細胞依賴的炎癥反應[8]。有不同損傷和炎癥刺激的MSCs比如脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、γ干擾素(IFN-γ)以及ARDS的血清能夠引導多種抗炎因子的釋放[9-10],MSCs功能的另一個引人注目的方面在于其內在的抗菌特性，這已在體外和小動物模型中得到證實，MSCs對細菌的直接清除已被證明是通過Toll樣受體介導的，MSCs分化為受損的肺泡細胞來修復細胞還能改變巨噬細胞向M2表型發(fā)展進一步提高吞噬細菌的能力[11]。,有關研究表明MSCs具有抗細胞凋亡作用，這種抗凋亡作用不是單一的，而是通過分泌血管內皮生長因子、胰島素生長因子、肝細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及通過抗凋亡基因上調或凋亡基因下調、線粒體和微囊泡轉移來調節(jié)[5,12]。

近年來研究表明MSCs也可通過分泌可溶性的因子和胞外囊泡(EVs)來發(fā)揮治療作用，可溶性因子包括細胞因子、趨化因子、生長因子和血管生成因子等[13]，胞外囊泡根據(jù)其細胞來源、分泌機制、大小和表面標記，EVs主要分為3類:(1)外泌體;(2)微囊泡;(3)凋亡小體。外泌體大小約40～100 nm，富含 CD63、CD9、CD81和腫瘤易感基因(Tsg 101)。這些外泌體還富含網(wǎng)格蛋白、膜聯(lián)蛋白和熱休克蛋白，細胞骨架的激活需要他們的釋放。微囊泡大小80～1 000 nm，由磷脂雙層膜包圍的納米結構，能夠保護內在因子的生物活性。具有CD40配體，它們的釋放依賴于細胞骨架的激活和鈣內流。凋亡小體來源于凋亡細胞的破裂，大小約1 000～5 000 nm，富含磷脂酰絲氨酸、豐富的細胞核和細胞器[14-16]。

大多數(shù)真核生物和原核生物已被證明可分泌異源性EVs，在血漿、尿液、腦脊液、牛奶以及體外培養(yǎng)的細胞上清液中均可檢測到這些囊泡的存在[14]，相關文獻證明[15-16]有B淋巴細胞分泌的EVs可以在體外誘導抗原特異性T淋巴細胞應答。關于EVs的綜合研究表明這些物質釋放到細胞外環(huán)境后，可通過配體-受體相互作用或通過內吞作用、吞噬作用和直接膜融合與受體細胞相互作用，嵌入在脂質雙鏈分子中的幾種膜分子促進了EVs對特定細胞或組織的靶向傳遞，他們通過將含有多種介質如蛋白質、脂質和核酸轉移到靶細胞來調節(jié)多種生理反應[17]。

到目前為止，微囊泡(MSC-MC)能夠像MSCs一樣有效地顯著降低肺損傷的嚴重程度，這已經(jīng)在一些體外和體內的臨床前動物模型中得到了證實[18]。Roura等[19]證明了微囊泡抑制了內皮細胞的通透性，恢復了細胞膜黏附分子的正常狀態(tài)，同時還能誘導白細胞與內皮細胞的黏附，提示微囊泡可通過保護血管屏障的完整性，防止炎癥細胞與內皮細胞結合，從而調節(jié)受損內皮細胞的炎癥反應。Park等[16]認為MSCs和MSC微囊兩種治療方法都能改善了肺內皮屏障的完整性和肺泡液的輸送速度，認為角質細胞生長因子(KGF)在肺泡液的運輸中起了關鍵作用，經(jīng)過利用KGF干擾RNA預處理MSCs能夠降低微囊泡的肺泡液清除率，相反加入重組的KGF能夠恢復清除率。Ionescu等[20]的研究表明，氣管內給予MSCs或微囊泡可減少內毒素誘導ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中浸潤的新中性粒細胞總數(shù)。值得注意的是，給予成纖維細胞或成纖維細胞微囊泡并沒有產生同樣的效果，因此顯示了MSC的特異性。Shen等[21]在博萊霉素誘導的慢性肺損傷模型中檢微囊泡的抗凋亡和抗纖維化作用。組織學分析微囊泡處理的大鼠損傷后28 d肺纖維化和細胞凋亡明顯減少。微囊泡在體外能夠促進人非小細胞肺癌上皮細胞的增殖和防止細胞凋亡。一系列的研究表明[22-24]來自MSC的微囊泡能夠明顯降低細胞死亡率和炎癥反應，同時能夠提高改善各種肺損傷模型的組織愈合和內源性再生。然而，關鍵的介質和誘導產生最佳效果的的最佳條件仍然是未知的。

2 MSCs治療呼吸系統(tǒng)疾病研究現(xiàn)狀

2.1 MSCs治療ARDS和肺炎 最近研究表明[25-26]MSCs及其衍生物能夠作為治療ARDS及肺炎的新的方向，MSCs在LPS誘導的ARDS小鼠模型能明顯改善肺泡損傷和炎癥反應，此外，通過KGF、血管內皮生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子(HGF)的產生，MSCs促進了肺泡Ⅱ型細胞再生，阻止內皮細胞凋亡，促進了ARDS損傷肺的肺泡-上皮屏障的修復[27]。MSCs通過增加巨噬細胞產生抗炎IL-10的能力來保護膿毒癥相關的ARDS[28]。除了再生和免疫抑制作用外，MSCs還能通過產生促分解介質脂素A4 (LXA4)來促進炎癥的消退，從而減輕肺水腫，提高LPS誘導的ARDS小鼠的存活率[16]。肺泡巨噬細胞在細菌性肺炎的清除和衰減中起著至關重要的作用。而細菌性肺炎是全世界最常見的感染死亡原因，最近有研究發(fā)現(xiàn)[24,29]，MSCs產生微泡，促進肺泡巨噬細胞的吞噬活性，從而減輕革蘭陰性大腸桿菌引起的細菌性肺炎，而且MSCs產生抗菌蛋白，能夠直接抑制肺部的細菌生長。氣管內注射MSCs可顯著減輕肺損傷和炎癥反應，并通過以脂質-2依賴的方式促進細菌清除，提高實驗動物細菌性肺炎的存活率，LPS誘導的MSCs中TLR-4的激活增強了脂鈣素-2的分泌，而脂鈣素-2可以結合細菌的鐵載體，減少鐵的吸收，抑制細菌的生長[30]。Wilson等[31]在臨床試驗中(NCT01775774)驗證了骨髓MSCs的治療ARDS的潛力，9名異體骨髓MSCs移植的患者均未觀察到不良反應或劑量毒性。大規(guī)模多中心的臨床試驗 (NCT02097641)招募了60例成年ARDS患者，他們通過靜脈接受單劑量的同種異體血BM-MSCs,目前結果尚未發(fā)表。

2.2 MSCs治療哮喘的現(xiàn)狀 哮喘的慢性氣道炎癥可導致反復發(fā)作的氣流阻塞和支氣管高反應性[32]，這可能導致永久性的結構改變。MSCs可抑制CD4介導Th2細胞的增殖及血漿中IgE的產生，一些科學家已經(jīng)證明了MSCs能夠減輕氣道炎癥和重塑，改善哮喘動物的肺功能，通過靜脈注射MSCs減少了肺中嗜酸性細胞的浸潤和黏液的產生，并降低了Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的水平，因此在經(jīng)MSCs處理的哮喘小鼠可以明顯觀察到IL-4、IL-5和Il-13生成Th2細胞的數(shù)量減少，血清IgE水平下降，肺浸潤嗜酸細胞數(shù)量減少，黏液分泌減少[32-34]。Hall等[33]用小鼠MSCs預處理哮喘小鼠可增加肺中調節(jié)性T細胞(Tregs)，而當淋巴細胞已經(jīng)被過敏原誘導時，MSC不能誘導Treg的擴增，這說明Treg沒有參與到治療哮喘的關鍵作用中，相反，Du等[35]研究發(fā)現(xiàn)人來源的MSCs改善哮喘大鼠氣道高反應性和炎癥主要是通過增加肺中產生IL-10 Treg的總數(shù)量，然后減少肺中浸潤的Th17細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，因此不同來源的MSCs對免疫細胞有不同的作用。PI3K和Notch信號通路被認為是哮喘肺MSCs的主要分子靶點，MSCs通過阻止Akt磷酸化的表達影響PI3K信號通路，從而抑制哮喘大鼠的肺部炎癥和氣道重塑，在經(jīng)MSCs處理的哮喘大鼠的肺組織中發(fā)現(xiàn)杯狀細胞增生和黏液分泌減少，說明MSCs通過調節(jié)Notch信號抑制哮喘癥狀[36-37]。關于MSCs治療哮喘的臨床試驗(NCT03137199)以及MSCs衍生物治療哮喘的臨床試驗(NCT02192736)都正在研究中。

2.3 MSCs在細胞基礎上應用于治療COPD 肺浸潤免疫細胞功能的改變、氧化應激和蛋白酶及其抑制因子活性的失衡是COPD患者主要病理改變的原因[38]，由于MSCs具有抑制有害免疫反應、維持氧化平衡和調節(jié)基質降解酶活性的能力，MSCs被認為是COPD細胞基礎治療的潛在方法。MSCs移植可顯著減輕肺泡損傷和肺泡數(shù)目的減少，減少肺氣腫的影響。在經(jīng)MSCs處理的COPD動物模型中，肺功能[通過肺活量(VC)、100 ms用力呼氣容積(FEV100)、動態(tài)順應性(Cdyn)和平均用力呼氣流量]在統(tǒng)計學上有明顯差異，組織學結果和肺功能的改善伴隨著肺泡間隔、支氣管周和血管周圍間質炎癥細胞的減少[39]。在肺浸潤免疫細胞中，MSCs在COPD動物中的主要細胞靶向為巨噬體，MSCs以旁分泌的方式分泌IL-10、TGF-β和HGF抑制肺泡巨噬細胞中環(huán)氧合酶-2 (COX-2)的表達和PGE2的產生[40]，在炎性M1巨噬細胞中，MSCs介導的COX2/PGE 2通路的下調通過p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)發(fā)生，導致巨噬細胞向M2抗炎表型極化[6,41-42]。MSCs明顯改善COPD患者的肺結構通過減少巨噬細胞的產生基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-12介導降解肺實質中彈力蛋白結締組織纖維的分布引起組織重塑。基于MSCs治療COPD的臨床試驗[43](NCT00683722)，62位COPD患者被隨機分組并靜脈注射MSCs，COPD患者接受骨髓MSCs治療時，未觀察到嚴重不良事件、COPD加重頻率增加或病情惡化，這說明系統(tǒng)應用異體骨髓MSCs是安全的，雖然COPD治療組血清C-反應蛋白水平下降明顯，COPD治療至少有可能抑制炎癥反應，但肺功能測試和生活質量指標在COPD治療組和未治療組之間沒有顯著差異，可能由于MSCs治療的濃度及劑量目前尚未取得明顯進展。

2.4 MSCs在細胞基礎上應用于治療特發(fā)性肺纖維化(IP) 反復性肺損傷、Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡增多、上皮-間質相互作用異常、凝血功能改變與成纖維細胞增殖增強相關的有害免疫反應、細胞外基質過度沉積是IPF患者的主要病理改變[44]。MSCs在體外可分化為Ⅱ型肺泡上皮細胞，抑制降解酶的產生，抑制肺浸潤免疫細胞中促纖維化因子的分泌[44-45]，因此治療IPS有一定潛力。移植MSCs防止博來霉素導致的肺損傷和纖維化，減毒肺部炎癥，減少肺水腫，減少膠原蛋白沉積，從而提升小鼠的成活率[46]。Mansouri等[47]在MSCs衍生的外泌體中也證明了其可減輕纖維化，恢復肺功能，增強內源性肺修復。一項單中心非隨機化臨床研究[48](NCT01385644)在澳大利亞完成了，遺憾的是MSCs治療的IPF在隨訪6個月后與對照組的IPF相比，肺功能改變上沒有顯著差異，但是在安全性上面至少證明了氣管內移植MSCs的安全性。

3 MSCs臨床應用的挑戰(zhàn)

(1)MSCs的最佳數(shù)目應加以明確，以便在其有益作用和因免疫抑制而可能產生的不良影響之間找到適當?shù)钠胶鈁49]。(2)MSCs移植的局部微環(huán)境中存在著誘導移植的骨髓MSCs向腫瘤發(fā)展的可能性，(3)MSCs能夠分泌多種促血管生成因子(VEGF、HGF、血小板衍生生長因子、血管生成素-1、胎盤生長因子)，因此需要對MSCs治療患者進行長期隨訪和觀察，以明確可能帶來的潛在性疾病[50]。(4)不同捐獻者、 不同批次的 MSCs 存在差異，致使這些干細胞在有效性、安全性方面不盡相同，隨之的治療效果也不盡相同，因此還需要更深入的研究驗證。

4 結論

大量臨床研究表明，MSCs可抑制肺內有害的免疫反應，并能分化為肺泡上皮細胞參與修復，其衍生物如微囊泡或外泌體也能通過釋放因子參與到抗炎、抗纖維化中，從而降低ARDS、急性肺損傷、哮喘、COPD、IPF對肺造成的傷害。雖然在動物實驗中取得了一定的進展，但是在臨床試驗方面還需要更多的投入及研究。干細胞外泌體具有更低的免疫原性、易保存、不致瘤，并具有抗纖維化、抗凋亡、免疫調節(jié)等功能。在肺損傷疾病的治療中目前也越來越占有重要的地位。MSCs可能在細胞類型中出現(xiàn)異常分化，并可能以內分泌的方式促進腫瘤生長和轉移，未來的研究必須集中在解決這些問題上，隨著科技發(fā)展，這些問題相信會依次解決，MSCs及其衍生物在未來的治療上肯定有廣闊前景。