文│余愛英（河南省鄭州種畜場）

一、前言

亞硝酸鹽（NO2-）主要在食品保鮮、化肥等方面廣泛應(yīng)用，但目前已成為環(huán)境、食品以及生理系統(tǒng)中普遍存在的污染物。過高的亞硝酸鹽濃度對人體健康可造成傷害，特別是嬰幼兒和孕婦群體，由于人體攝入一定量的亞硝酸鹽（NO2-）可發(fā)生高鐵血紅蛋白癥，而且亞硝酸鹽容易與人體內(nèi)的仲胺、叔胺和酰胺發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有致癌作用的亞硝胺化合物，為防止上述現(xiàn)象發(fā)生，應(yīng)限制食品中亞硝酸鹽的含量，特別是乳及乳制品中亞硝酸鹽的含量。

近年來，亞硝酸鹽的測定方法主要有分光光度法、色譜法、化學(xué)發(fā)光法等，基于分光光度法操作簡便、成本較低等優(yōu)點，目前是牛奶中亞硝酸鹽測定常用的方法之一。常用的分光光度法主要是基于格里斯試劑比色法，格里斯反應(yīng)由約翰·彼得·格里斯于1879年首次提出，主要用重氮化反應(yīng)測定唾液中的硝酸鹽。格里斯法用于泌尿生殖道細(xì)菌感染的檢測已有相當(dāng)長的時間。格里斯法是亞硝酸鹽將芳香伯胺轉(zhuǎn)化為重氮離子，重氮離子隨后與另一種芳香化合物偶聯(lián)生成偶氮燃料。常用的目標(biāo)胺是磺胺酸、硝基苯胺和對氨基苯乙酮，而苯酚、1-萘酚、1-萘酚-4-磺酸等為偶聯(lián)劑，無論采用哪種試劑，其都存在樣品適應(yīng)性問題。在GB5009.33—2016中采用的目標(biāo)胺是對氨基苯磺酸，偶聯(lián)劑是鹽酸萘乙二胺。本文介紹了鹽酸萘乙二胺分光廣度法檢測亞硝酸鹽的原理以及檢測過程中的注意事項，以期提高分光光度法檢測亞硝酸鹽的準(zhǔn)確度，保證牛奶以及乳制品中亞硝酸鹽污染物的有效控制。

二、鹽酸萘乙二胺分光光度法主要檢測原理

GB5009.33-2016第二法采用的是鹽酸萘乙二胺分光光度法，主要檢測原理是樣品經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀、脂肪去除后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量，測得亞硝酸鹽含量。

三、樣品提取、過濾澄清原理介紹及注意事項

1.硼砂的作用。在GB5009.33-2016第二法樣品亞硝酸的提取過程中，樣品中加入硼砂，使亞硝酸鹽的總量不會因為加熱分解而減少，硼砂的主要作用是吸收亞硝酸鹽分解。硼砂溶液呈堿性，堿性條件下，能夠有效利用鋅鹽沉淀蛋白質(zhì)。另外在堿性條件下，亞硝酸根以離子形式存在，易溶且穩(wěn)定，如溶液偏酸性，則形成亞硝酸，在加熱條件下容易揮發(fā)，也易分解，導(dǎo)致提取效果不佳。

2.乙酸鋅與亞鐵氰化鉀沉淀澄清劑。作為沉淀澄清劑，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀用來去除牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪等影響亞硝酸鹽測定的物質(zhì)。操作過程中，亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液要嚴(yán)格按照測定方法的量和次序來添加，添加亞鐵氰化鉀溶液搖勻后再添加乙酸鋅溶液，在添加過程中應(yīng)邊搖邊添加。

3.過濾。由于分光光度法對樣品溶液的澄清度要求較高，但食品基質(zhì)復(fù)雜，牛奶樣品經(jīng)提取并澄清后，脂肪浮于上層，若用濾紙過濾后仍不澄清，樣品溶液可經(jīng)4℃冷凍高速離心后再進(jìn)行濾紙過濾，濾液能夠進(jìn)一步澄清。

為驗證濾液澄清度、提取過程、提取試劑對后續(xù)測定的影響，可向濾液中加標(biāo)，然后測定加標(biāo)后濾液的亞硝酸鹽含量，如果測定值與加標(biāo)量差異不大，可認(rèn)為濾液的澄清度、提取過程、提取試劑對后續(xù)測定過程無影響。

4.試劑對測定過程的影響。在實際檢測工作中發(fā)現(xiàn)，不同廠家、不同純度、不同保質(zhì)期的試劑會影響加標(biāo)樣品的回收率，在日常檢測中應(yīng)做試劑空白試驗，以消除試劑對測定的影響。

5.測定過程中的試驗儀器。試驗儀器有亞硝酸鹽殘留或其他物質(zhì)殘留，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。有文獻(xiàn)指出，洗滌劑殘留可影響偶氮化反應(yīng)，從而影響顯色反應(yīng)及分光光度計測定值。

6.顯色反應(yīng)過程。澄清后的濾液要進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后進(jìn)行分光光度計測定。顯色測定過程中要嚴(yán)格按照反應(yīng)時間操作，加完每個試劑后，要輕輕搖勻后再加下一個試劑。加完對氨基苯磺酸溶液后要靜置3～5分鐘，保證重氮化反應(yīng)充分，所有試劑添加并定容后應(yīng)在15～60分鐘內(nèi)進(jìn)行比色。

四、總結(jié)

鹽酸萘乙二胺分光光度法檢測亞硝酸鹽主要依據(jù)重氮偶合反應(yīng)進(jìn)行測定，在測定過程中對重氮偶合反應(yīng)有影響的因素都會對測定值有影響，如各種試劑、提取澄清過程、試驗儀器、顯色反應(yīng)時間等因素，在日常檢測過程中應(yīng)避免這些因素的影響，以提高牛奶中亞硝酸鹽測定的準(zhǔn)確性。