劉宇陽(yáng)，陳 茶，黃 彬

(1. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510080； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120； 3. 廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是引起醫(yī)院感染的主要條件致病菌[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，PA耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重，常常出現(xiàn)多重耐藥和泛耐藥PA，導(dǎo)致嚴(yán)重且難以治療的醫(yī)院獲得性感染[2]。免疫力低下患者對(duì)PA具有較高的易感性，PA引發(fā)的感染在該類(lèi)人群中可導(dǎo)致較高的病死率[3]。

異質(zhì)性耐藥(heteroresistance, HR)現(xiàn)象在1947年首次被發(fā)現(xiàn)于革蘭陰性細(xì)菌流感嗜血桿菌[4]中，20年后在革蘭陽(yáng)性細(xì)菌葡萄球菌中再次被觀察到，但直至1970年“異質(zhì)性耐藥”的概念才明確被提出。臨床上常根據(jù)微生物自動(dòng)化檢測(cè)儀的藥敏結(jié)果選擇抗菌藥物治療病原菌感染。HR菌株因難以被常規(guī)方法檢出而漏檢，在抗菌藥物的選擇壓力下可能導(dǎo)致高水平亞群的出現(xiàn)，造成臨床治療失敗和感染復(fù)發(fā)。隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素應(yīng)用增加，其相關(guān)的HR日益增多。目前，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和大腸埃希菌等臨床常見(jiàn)病原菌[5-11]對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的異質(zhì)性耐藥已有較多研究[12]，但關(guān)于碳青霉烯類(lèi)異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-heteroresistantPseudomonasaeruginosa, CHPA)的相關(guān)報(bào)道較少。嚴(yán)格控制碳青霉烯類(lèi)藥物的使用對(duì)于減少PA感染者CHPA的發(fā)生至關(guān)重要。研究[13]表明，2011—2015年CHPA的分離率呈逐年上升趨勢(shì)，我國(guó)西南地區(qū)已廣泛發(fā)現(xiàn)CHPA菌株，在侵襲性PA中，CHPA的檢出率高達(dá)84.9%。CHPA的耐藥機(jī)制至今尚未得到充分研究，CHPA的檢測(cè)和鑒定也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文對(duì)CHPA的研究現(xiàn)狀包括HR定義、檢測(cè)方法、CHPA耐藥機(jī)制、臨床及流行病學(xué)特征進(jìn)行綜述，為臨床診斷與治療CHPA感染提供新思路。

1 HR的定義

HR指同一克隆菌株中同時(shí)存在對(duì)某種抗菌藥物耐藥及敏感亞群的現(xiàn)象，即體外藥敏試驗(yàn)如K-B法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物的敏感性時(shí)，在抑菌圈內(nèi)有相同種屬的菌落生長(zhǎng)[14]。有臨床意義的表型主要體現(xiàn)為大部分亞群敏感，但有一小部分亞群耐藥，極少數(shù)亞群甚至出現(xiàn)高水平耐藥。常規(guī)劑量抗菌藥物作用下，這部分耐藥亞群不能被殺死，可能導(dǎo)致臨床應(yīng)用抗菌藥物治療失敗[14-15]。

在研究PA的HR過(guò)程中，需要考慮以下幾點(diǎn)：第一，耐藥亞群的耐藥水平。大多數(shù)研究采用最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)與最高不抑菌濃度(the highest noninhibitory concentration, HNIC)的比值表示耐藥亞群的耐藥水平[16]。研究顯示，不同細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥水平略有差異。例如，鮑曼不動(dòng)桿菌、PA和肺炎克雷伯菌的MIC和最高不抑菌濃度的比值>8時(shí)，判定為HR[1,17]；陰溝腸桿菌的MIC和最高不抑菌濃度的比值>2時(shí)，判定為HR[18]。第二，耐藥亞群頻率。耐藥亞群頻率常用耐藥亞群細(xì)菌數(shù)占細(xì)菌總數(shù)的百分比表示，即大于8倍MIC濃度的抗菌藥物平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)占無(wú)抗菌藥物平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌總數(shù)的百分比。耐藥亞群頻率的檢測(cè)極限在10-7甚至更低，不同檢測(cè)方法的敏感性有所差異[19]。因此，有必要報(bào)告大于8倍MIC濃度抗菌藥物平板的耐藥亞群頻率。第三，HR的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是指異質(zhì)性耐藥亞群在無(wú)抗菌藥物培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后恢復(fù)親代菌株耐藥水平的能力。穩(wěn)定性直接關(guān)系到HR的檢測(cè)水平。在Wong等[20]的研究中耐萬(wàn)古霉素葡萄球菌HR是穩(wěn)定的，而部分研究[21]中HR是不穩(wěn)定的。CHPA通常表現(xiàn)為穩(wěn)定的HR[22-23]。

綜上所述，在HR中，除了關(guān)注耐藥亞群的存在，還應(yīng)關(guān)注耐藥水平、耐藥頻率和HR穩(wěn)定性。

2 HR的檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的微生物藥敏試驗(yàn)不能識(shí)別出具有HR的菌株，導(dǎo)致HR漏檢并可能導(dǎo)致抗菌藥物治療的失敗。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)HR菌株對(duì)于其所致感染的治療非常重要。然而，HR的檢測(cè)至今沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化方法，各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法也各有差異。常規(guī)的HR檢測(cè)方法有改良K-B法、E-test法和菌群譜型分析法[24]三種。近年來(lái)也開(kāi)發(fā)出一些新的檢測(cè)和輔助檢測(cè)方法，如PAP曲線(xiàn)下面積法(PAP-AUC)[25]、時(shí)間殺傷試驗(yàn)法[26]、毛細(xì)管電泳法[27]以及全基因組測(cè)序法[28]等。

2.1 改良K-B法和E-test法 K-B法和E-test法常用于臨床藥敏試驗(yàn)，分別檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抑菌圈直徑和MIC值。采用這兩種方法在抑菌圈內(nèi)通常可直觀發(fā)現(xiàn)可能存在的HR菌落，但假陰性概率較高。為了增加HR的檢出率，Andersson等[29]對(duì)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)公布的藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了適當(dāng)修改，即將菌液接種濃度從0.5增加到2.0麥?zhǔn)蠁挝?，并將溫箱孵育時(shí)間從24 h增加到48 h。具體方法為：將菌液調(diào)至2.0麥?zhǔn)蠁挝缓螅鶆蛲坎加贛-H平板，貼相應(yīng)的藥敏紙片或E-test試條，37℃孵育48 h后觀察結(jié)果[25]。該方法有效降低了HR檢測(cè)的假陰性率。研究[21]表明，改良K-B法和E-test法仍存在較高的假陰性，只能用于HR的初篩。

2.2 菌群譜型分析法 菌群譜型分析法(population analysis profiling, PAP)被認(rèn)為是HR檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)節(jié)至1.0×107CFU/mL，取20 μL涂布于梯度抗菌藥物(具體濃度根據(jù)細(xì)菌MIC而定，如PA對(duì)美羅培南MIC折點(diǎn)值為2～8 mg/L[30]，則可選擇梯度抗菌藥物板濃度為0.5～32 mg/L)平板上，37℃孵育48 h后計(jì)數(shù)菌落，其HNIC與MIC濃度比值大于8，則判定為HR。PAP結(jié)果可以提供耐藥亞群頻率和MIC等信息，但過(guò)程非常繁瑣，通常只用于實(shí)驗(yàn)室研究和一些特殊臨床病例。改良PAP方法采用微量稀釋滴定[31](取微量菌液滴定于抗菌藥物滴度平板，不涂布均勻，觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng))，在節(jié)約成本的基礎(chǔ)上，提高了HR的檢出效率，但由于滴定的菌量相對(duì)較小，也可能存在假陰性。PAP是檢測(cè)異質(zhì)性耐藥最可靠的方法，但由于其高成本和低效率的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中難以實(shí)施。

2.3 PAP-AUC PAP-AUC是一種改良的PAP，有研究將PAP-AUC作為檢測(cè)異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌(heteroresistant vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus, hVISA)的金標(biāo)準(zhǔn)[32]。具體操作如下：將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液調(diào)節(jié)至1.0×107CFU/mL，取100 μL涂布于含有0.5、1、2、2.5和4 mg/L萬(wàn)古霉素的腦心浸液(brain heart infusion, BHI)平板上。在37℃孵育48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并使用GraphPad Prism軟件將存活細(xì)菌數(shù)與萬(wàn)古霉素濃度作AUC曲線(xiàn)圖，計(jì)算曲線(xiàn)下面積[25]。與PAP相比，PAP-AUC操作更為繁瑣，成本主要由篩選試驗(yàn)后所需的PAP-AUC檢測(cè)次數(shù)決定。

2.4 時(shí)間殺傷試驗(yàn)法 在時(shí)間殺傷試驗(yàn)(time-killing assay)中，細(xì)菌在抗菌藥物作用下，敏感菌群被殺死，但耐藥亞群不斷繁殖，會(huì)出現(xiàn)菌落數(shù)先下降后增加的現(xiàn)象[33]。將過(guò)夜菌培養(yǎng)液濃度調(diào)節(jié)至大于1.0×105CFU/mL，在0.5～4倍MIC值梯度抗菌藥物濃度作用下，通過(guò)記錄2、4、6、8、10、12、24和48 h抗菌藥物作用下細(xì)菌數(shù)量的變化作時(shí)間殺傷曲線(xiàn)來(lái)判讀結(jié)果。時(shí)間殺傷曲線(xiàn)法可以作為HR的驗(yàn)證方法，但其靈敏度和準(zhǔn)確度不及PAP，過(guò)程也相對(duì)繁瑣，不適用于臨床檢測(cè)。此外，時(shí)間殺傷曲線(xiàn)法還可以用于檢測(cè)抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的療效，評(píng)估聯(lián)合用藥的協(xié)同作用[34]。

2.5 毛細(xì)管電泳法 有研究表明毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis, CE)可快速檢測(cè)革蘭陰性細(xì)菌對(duì)粘菌素的HR亞群。研究表明，CE法可以根據(jù)細(xì)菌的表面特性分離不同的菌株。通過(guò)簡(jiǎn)單的CE運(yùn)行，只需幾分鐘，便能清楚地檢測(cè)出細(xì)菌亞群是否共存[27]。這種新興的細(xì)菌亞群檢測(cè)技術(shù)尚未成熟，有待研究并應(yīng)用于HR的檢測(cè)。

2.6 全基因組測(cè)序法 全基因組測(cè)序法(whole genome sequencing, WGS)已應(yīng)用于細(xì)菌亞群的分析。通過(guò)分析耐藥亞群基因型的變化，檢測(cè)出HR。研究[28]表明在金黃色葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌中，WGS的準(zhǔn)確度高于傳統(tǒng)表型檢測(cè)，但在耐藥亞群頻率小于10-2時(shí)靈敏度不高。也有研究[35]表明WGS不能準(zhǔn)確檢測(cè)出腸道沙門(mén)氏菌的HR亞群。全基因組測(cè)序的分析相對(duì)復(fù)雜，對(duì)生物信息學(xué)有較高的依賴(lài)性，尚未應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

綜上所述，為了防止CHPA的臨床治療失敗和耐藥菌株的傳播，有必要規(guī)范PAP的操作流程，并發(fā)展出更高敏感性、更高重復(fù)性和簡(jiǎn)便的新興檢測(cè)技術(shù)(例如，在同一M-H平板中設(shè)置不同抗菌藥物梯度形成梯度抗菌藥物平板等[29])用于臨床試驗(yàn)。

3 CHPA的異質(zhì)性耐藥機(jī)制

HR菌株難以被臨床微生物自動(dòng)化儀器檢出，長(zhǎng)期用藥可能導(dǎo)致高水平耐藥亞群的出現(xiàn)，造成臨床治療失敗和感染復(fù)發(fā)。因此，研究HR機(jī)制對(duì)耐藥性監(jiān)測(cè)和患者預(yù)后至關(guān)重要。自1947年首次發(fā)現(xiàn)HR現(xiàn)象以來(lái)，幾乎在所有革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了HR。臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物均具有明顯的異質(zhì)性耐藥；但只有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了可能與CHPA相關(guān)的耐藥機(jī)制，例如，生物膜形成、外排泵MexAB、MexCD的高表達(dá)和膜孔蛋白OprD的缺失等[36-38]。AmpC過(guò)表達(dá)與CHPA的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，Cabot等[37]認(rèn)為AmpC過(guò)表達(dá)是CHPA最主要的機(jī)制，而He等[13]則認(rèn)為AmpC可能不參與PA的HR。

機(jī)制研究表明，外排泵系統(tǒng)的過(guò)表達(dá)和膜孔蛋白的表達(dá)下調(diào)可能是PA對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素異質(zhì)性耐藥的主要機(jī)制。PA通過(guò)阻止抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌或增加抗菌藥物的排出，以達(dá)到對(duì)抗菌藥物耐藥的目的。

3.1 外排泵系統(tǒng)的過(guò)表達(dá) Ikonomidis等[36]指出CHPA的機(jī)制與外排泵基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。與親代菌株相比，HR菌株外排泵相關(guān)基因包括mexB、mexC、mexE和mexX的表達(dá)都出現(xiàn)上調(diào)。值得注意的是，亞胺培南異質(zhì)性耐藥(imipenem heteroresistance, IPM-HR)菌株中mexB和mexE均表現(xiàn)出明顯上調(diào)，美羅培南異質(zhì)性耐藥(meropenem heteroresistance, MPM-HR)菌株中mexE表現(xiàn)為明顯上調(diào)，而mexB與親代菌株水平無(wú)明顯差異。這一現(xiàn)象可能是由于亞胺培南的化學(xué)結(jié)構(gòu)中缺乏一個(gè)可以被MexAB-OprM系統(tǒng)識(shí)別的雜環(huán)側(cè)鏈[38]。

3.2 膜孔蛋白OprD基因表達(dá)下調(diào) PA的HR亞群還表現(xiàn)出OprD基因和蛋白的表達(dá)顯著降低[36]。外排泵的上調(diào)和OprD基因的下調(diào)在一定程度上都促進(jìn)了CHPA對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素HR的產(chǎn)生[38-39]。

3.3 生物膜的形成 大量研究[13]表明，所有CHPA的生物膜都明顯增加。生物膜延緩了抗菌藥物的滲透，降低了微生物的生長(zhǎng)速度，從而促進(jìn)了具有不同抗性水平的亞群在細(xì)菌群體中的出現(xiàn)。生物膜的檢測(cè)一般分為定性法和定量法兩種，定性法是指利用熒光顯微鏡、相差顯微鏡或者掃描電鏡觀察細(xì)菌生物膜形態(tài)，定量法指半定量結(jié)晶紫法或者生物膜內(nèi)的活菌計(jì)數(shù)法等。前者較后者更為直觀。

另外，He等[13]通過(guò)PCR檢測(cè)CHPA分離株是否產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase, MBLs)，發(fā)現(xiàn)CHPA中MBLs基因型陰性[5]，與一般耐藥機(jī)制不同。這與吳婷婷關(guān)于銅綠假單胞菌亞胺培南異質(zhì)性耐藥機(jī)制的研究結(jié)果一致[34]。因此，CHPA的耐藥機(jī)制可能與外排泵系統(tǒng)、膜孔蛋白以及生物膜的產(chǎn)生有關(guān)，與MBLs的產(chǎn)生無(wú)關(guān)。

4 CHPA的臨床及流行病學(xué)特征

盡管CHPA在世界范圍內(nèi)已被觀察到，但其流行病學(xué)資料不多[40]。在我國(guó)CHPA感染患者中，IPM-HR(41.9%，189/451)和MPM-HR(72.5%，327/451)分離株所致感染比例較高。IPM-HR分離株的分離率2011年為41.7%，2015年增加至62.1%，MEM-HR分離率也出現(xiàn)了上升趨勢(shì)[13]。馬幸延等[41]檢測(cè)了169株臨床分離的 PA對(duì)多種抗菌藥物的藥敏情況，檢出并確認(rèn)了50株CHPA菌株，檢出率為29.59%。其中MPM-HR株和IPM-HR株的檢出率分別為26.04%(44/169)和13.02%(22/169)，同時(shí)對(duì)這兩種抗菌藥物均異質(zhì)性耐藥的菌株檢出率為 9.47%(16/169)。如前所述，常規(guī)臨床藥敏試驗(yàn)難以檢測(cè)出HR的存在，HR菌株通常被判定為敏感菌株[42]。在PA的感染中，這將導(dǎo)致HR亞群用常規(guī)劑量碳青霉烯類(lèi)抗生素治療失敗。

5 小結(jié)與展望

目前，碳青霉烯類(lèi)抗生素已成為治療PA感染的主要抗菌藥物，隨著用藥率的增加HR亞群頻率也出現(xiàn)上升。為控制CHPA的感染和傳播，使用抗菌藥物應(yīng)遵循以下兩種方式：第一，換用無(wú)HR現(xiàn)象的敏感抗菌藥物，以較低的劑量達(dá)到抗菌目的；第二，聯(lián)合用藥，利用協(xié)同效應(yīng)達(dá)到治療效果。兩種方式中應(yīng)優(yōu)先考慮前者。

HR機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未明確。HR可能是細(xì)菌自然進(jìn)化的工具，因?yàn)槠錇榧?xì)菌提供了在抗菌藥物壓力下繼續(xù)生存的機(jī)會(huì)[43]。深入和全面地了解CHPA耐藥機(jī)制，將有助于指導(dǎo)臨床合理用藥，減少臨床碳青霉烯類(lèi)抗生素治療PA感染的失敗。PAP作為檢測(cè)HR的金標(biāo)準(zhǔn)，有必要簡(jiǎn)化其檢測(cè)流程，例如，采用微量稀釋滴定PAP或者設(shè)計(jì)梯度抗菌藥物PAP平板，標(biāo)準(zhǔn)化PAP操作流程。同時(shí)，發(fā)展高效快速的新興檢測(cè)技術(shù)，為臨床診斷和治療CHPA感染提供參考，減少住院患者CHPA的感染和傳播。