蔣玉婷，張 珂，劉唐娟，黃瑩瑩，溫中薇，孔晉亮，陳一強

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530021)

肺炎克雷伯菌是常見的革蘭陰性桿菌，尤其在免疫力低下患者中，是最常見的機會性致病菌之一。根據(jù)毒力特點可將肺炎克雷伯菌分為普通型肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKp)。cKp通常在免疫力低下患者中致病，引起醫(yī)院獲得性感染。而hvKp通常在健康人群中引起社區(qū)獲得性感染，糖尿病和消化系統(tǒng)疾病患者更易感染[1]，且常伴隨多部位侵襲性感染，如化膿性肝膿腫、腦膜炎、眼內(nèi)炎、骨髓炎、脾膿腫和壞死性筋膜炎等，較cKp更具毒性，因此被稱為hvKp[2-3]。起初，人們以高黏液黏度表型定義hvKp，但越來越多研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有hvKp菌株都具有高黏液黏度表型[4]。Zhang等[5]建議hvKp應(yīng)由關(guān)鍵毒力基因型而不是高黏液黏度表型進(jìn)行定義，并認(rèn)為僅通過檢測高黏液黏度表型的拉絲試驗定義hvKp可能會使研究結(jié)果產(chǎn)生偏頗，特別是在小樣本量的研究中。Harada等[6]也指出拉絲試驗性能較差，準(zhǔn)確率僅為90%，而rmpA、rmpA2、peg-344、iroB和iucA等毒力基因，以及鐵載體定量測定≥30 μg/mL，準(zhǔn)確率>95%，可作為準(zhǔn)確區(qū)分hvKp與cKp的生物標(biāo)志物。因此，人們逐漸結(jié)合關(guān)鍵毒力基因型定義hvKp，如采用rmpA和iucA基因陽性，rmpA、iucA和iroB基因陽性，高黏液黏度表型、rmpA基因陽性和K1/K2，高黏液黏度表型、rmpA/rmpA2和magA基因陽性(尤其適用于K1 ST23 hvKp)等組合定義hvKp[7-10]。但至今還未有hvKp定義的國際共識，仍需繼續(xù)探索hvKp的最佳定義標(biāo)準(zhǔn)，以期能盡早發(fā)現(xiàn)hvKp菌株，便于臨床預(yù)防和治療。另外，hvKp菌株可獲得單種或多種耐藥基因，如碳青霉烯酶基因、廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因、粘菌素抗性相關(guān)基因、磺酰胺抗性基因(sul1、sul2和sul3)及甲氧芐啶抗性基因(dfrA1和dfrA12)等，表明部分hvKp菌株已經(jīng)進(jìn)化成既有高毒力表型又有耐藥表型的“超級細(xì)菌”[11-12]。高毒力和耐藥共存的肺炎克雷伯菌近期已增加了約50%[13]，并在多地醫(yī)院引起感染暴發(fā)，導(dǎo)致極高病死率[12, 14]。hvKp耐藥株已經(jīng)出現(xiàn)并越來越多，可能導(dǎo)致嚴(yán)重甚至無法治療的感染，對公眾健康造成極大威脅，因此本文對hvKp菌株的毒力因子和耐藥機制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 hvKp流行病學(xué)

1986年Liu等[15]首次提及hvKp，發(fā)現(xiàn)7例來自中國臺灣的肺炎克雷伯菌化膿性肝膿腫患者均合并眼內(nèi)炎，且同時合并心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎或腎炎之一，此是一種不同于cKp的侵襲性感染。隨后，在韓國、越南及中國出現(xiàn)許多相似報道[16]。中國臺灣研究[17]顯示，肺炎克雷伯菌分離株中，hvKp菌株占54.3%(150/276)。韓國37.4%(155/414)的肺炎克雷伯菌具有高黏液黏度表型[18]。中國大陸研究[19]顯示，230株肺炎克雷伯菌分離株中37.8%為hvKp，且hvKp的檢出率在不同城市之間存在差異，武漢高達(dá)73.9%，而浙江僅8.3%。肺炎克雷伯菌引起的社區(qū)獲得性肝膿腫占所有化膿性肝膿腫病例的80%，而引起化膿性肝膿腫的病原體中90.9%是hvKp菌株[20]。hvKp成為了亞洲化膿性肝膿腫最常見的原因，并開始在全球播散。21世紀(jì)以來，法國、日本、伊朗、美國、埃及、西班牙、英國、加拿大、澳大利亞、印度和新加坡等國家也逐漸出現(xiàn)hvKp相關(guān)報道，但檢出率并不高(3.2%～20.3%)[21-24]。然而近幾年，新的hvKp菌株—耐藥hvKp開始在臨床出現(xiàn)，其表現(xiàn)出高毒力和難治愈性再度引起人們關(guān)注。一份來自溫州某醫(yī)院的報告[14]顯示，2017年3月—2018年1月，該院重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類hvKp暴發(fā)，導(dǎo)致病死率100%(8/8)。類似的報道也曾在中國杭州以及伊朗等地出現(xiàn)[12, 25]。hvKp和耐藥hvKp正在威脅著人類健康，必須加強對hvKp的認(rèn)知及管控。

2 hvKp相關(guān)毒力因子

較cKp菌株而言，hvKp菌株對中性粒細(xì)胞和補體介導(dǎo)的吞噬作用以及中性粒細(xì)胞胞外殺菌作用具有更強的抵抗力[26]。體外試驗[24]也表明，hvKp菌株具有更強的生存能力，且在各種感染模式中表現(xiàn)出更強的毒力。在hvKp菌株中，存在多種與其高毒力相關(guān)的因子，主要包括莢膜多糖、序列類型、毒力質(zhì)粒、整合性接合元件(integrative conjugative elements，ICEs)、鐵載體等。

2.1 莢膜多糖 莢膜多糖由直鏈或支鏈低聚糖組成，其包裹在肺炎克雷伯菌周圍形成一個保護(hù)屏障，使肺炎克雷伯菌能在劣勢環(huán)境(如干燥環(huán)境、宿主免疫吞噬、抗菌藥物攻擊等)中生存。hvKp菌株的莢膜多糖受黏液表型調(diào)節(jié)基因rmpA/rmpA2、rmpC和magA(wzy-k1)的正調(diào)控[10, 27]。根據(jù)K抗原血清學(xué)檢測，莢膜多糖至少可分為78種類型[28]，K1、K2、K5、K20、K54和K57是hvKp菌株最普遍的血清型。其中K1血清型與ST23密切相關(guān)，常引起化膿性肝膿腫，在亞洲占主導(dǎo)地位。而K2血清型在遺傳上呈多樣化，在美國和歐洲更常見，K2血清型的ST65 hvKp菌株與各種侵襲性感染相關(guān)[3, 29]。值得注意的是，K1、K2、K5和K57型莢膜多糖缺乏巨噬細(xì)胞凝集素受體識別的甘露糖或鼠李糖，能逃避凝集素吞噬和巨噬細(xì)胞殺傷，為hvKp存活和繁殖創(chuàng)造了良好環(huán)境[26]。莢膜多糖的厚度決定了其對肺炎克雷伯菌的保護(hù)程度[30]，而hvKp菌株常伴隨較cKp更豐富的莢膜多糖，因此，hvKp菌株更能抵抗各種體液防御(如補體殺傷、人β-防御素)和抗微生物肽(如中性粒細(xì)胞蛋白1和乳鐵蛋白)，有助于其在宿主體內(nèi)播散并產(chǎn)生耐藥性[31]。

2.2 序列類型 多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法，可將細(xì)菌分為不同的序列類型(sequence type，ST)，并確定不同序列類型間的關(guān)系以及與疾病的聯(lián)系。經(jīng)MLST分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)hvKp菌株都是經(jīng)克隆擴(kuò)增的，其核心基因組變異有限且毒力基因高度保守，克隆群CG23與hvKp菌株的高毒力表型密切相關(guān)[29]。在亞洲流行的hvKp菌株中，37%～64%的分離株為克隆群CG23，包括ST23、ST26、ST57和ST163。ST23是hvKp菌株中最普遍的序列類型，并與K1血清型和肝膿腫密切相關(guān)[3]；而ST65、ST66、ST86、ST373、ST374、ST375、ST380和ST434與K2相關(guān)，其中又以ST65(42%)和ST86(46%)更常見[32]。據(jù)不完全統(tǒng)計，2015—2017年中國鑒定的47株耐碳青霉烯類的hvKp分離株，其序列類型分布為 ST11(26株)、ST65(7株)、ST23(5株)、ST1797(3株)、ST268(2株)以及ST25、ST595、ST692和ST1700(各1株)[29,33]，表明我國耐碳青霉烯類的hvKp菌株以ST11為主。中國耐碳青霉烯類cKp以ST11常見，hvKp多見于ST23[34]，提示ST23 hvKp菌株和ST11 cKp耐藥株間存在相互作用，即ST23 hvKp和ST11耐碳青霉烯類cKp間已出現(xiàn)毒力和耐藥相關(guān)遺傳物質(zhì)的交換。

2.3 毒力質(zhì)粒 與cKp相比，hvKp的一個明顯特征是存在毒力質(zhì)粒。該質(zhì)粒通常包含多個毒力編碼基因，并可在菌株間轉(zhuǎn)移，是hvKp菌株呈現(xiàn)高毒力的重要原因。最早被鑒定的兩個毒力質(zhì)粒是pK2044(224 152 bp)和pLVPK(219 385 bp)，兩個毒力質(zhì)粒高度相似，都是IncHI1/IncFIB質(zhì)粒，含黏液表型調(diào)節(jié)基因rmpA/rmpA2、氣桿菌素編碼基因iuc和沙門菌素編碼基因iro[10, 24]；但不含質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移基因，因此，不具有自主接合轉(zhuǎn)移功能，可能與過去很長一段時間內(nèi)，肺炎克雷伯菌中高毒力和耐藥表型不相重疊的現(xiàn)象有關(guān)[35]。隨著研究的深入，越來越多的毒力質(zhì)粒相繼被鑒定出來，甚至發(fā)現(xiàn)了與耐藥基因共存的毒力質(zhì)粒。如Gu等[12]指出，類pLVPK毒力質(zhì)粒pVir-CR-HvKp4(178 154 bp，含rmpA2、iucABCD、iutA，缺rmpA、iroBCDN)可轉(zhuǎn)移到耐碳青霉烯類cKp菌株中，實現(xiàn)與耐藥質(zhì)粒pKPC-CR-HvKP4共存，并形成耐碳青霉烯類hvKp菌株；該耐藥與毒力結(jié)合的hvKp菌株在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院引起感染暴發(fā)，并導(dǎo)致病死率100%。同樣地，將pLVPK毒力質(zhì)粒的100 kb片段整合到接合性IncFIB質(zhì)粒中，形成p15WZ-82-vir毒力質(zhì)粒，可與耐碳青霉烯類cKp接合，并表達(dá)出高毒力和呈現(xiàn)耐藥表型[36]。此外，人們還發(fā)現(xiàn)新的共存形式的毒力質(zhì)?！s交毒力質(zhì)粒，此類質(zhì)粒將耐藥基因重組到毒力質(zhì)粒中，形成既含有毒力相關(guān)基因又含有耐藥相關(guān)基因的新質(zhì)粒。Dong等[37]從臨床hvKp菌株中分離出的雜交質(zhì)粒pKP70-2(240 kb)，同時含毒力基因rmpA2以及碳青霉烯酶基因blaKPC-2和甲氧芐啶抗性基因dfrA。Huang等[38]通過WGS在TVGHCRE225菌株中也檢測出一個雜交毒力質(zhì)粒pVir，該質(zhì)粒第一區(qū)域與pK2044和pLVPK質(zhì)粒有99%的同源性，含毒力基因rmpA和rmpA2；第二區(qū)域則與pPMK1-NDM抗性質(zhì)粒高度相似。這些hvKp耐藥株，同時具有高毒力、耐藥性以及移動性，可在醫(yī)院或社區(qū)引起嚴(yán)重感染[39]。而雜交毒力質(zhì)粒將耐藥和毒力基因融合在同一質(zhì)粒中，其在菌株間轉(zhuǎn)移所帶來的威脅更大。

2.4 ICEs ICEs是細(xì)菌中可自主移動的元件，通常存在于細(xì)菌染色體上，自身即可完成轉(zhuǎn)移的相關(guān)編碼，并攜帶多種功能基因，是毒力和耐藥播散的重要介質(zhì)。肺炎克雷伯菌中的ICEs可依據(jù)其右端攜帶的不同cargo基因簇分為14種類型 (ICEKp1～I(xiàn)CEKp14)，各ICEs間有以下共性：(1)左端有一個整合酶基因int；(2)有編碼耶爾森菌素的29 kb位點；(3)有編碼xis激活酶、virB-IV型分泌系統(tǒng)、oriT轉(zhuǎn)移起點和mobBC蛋白的14 kb序列[40]。hvKp菌株中以ICEKp1和ICEKp10常見。ICEKp1在hvKp菌株NTUH-K2044中被首次發(fā)現(xiàn)，其5’區(qū)域有一個高致病性島(high pathogenicity island, HPI)，編碼耶爾森菌素、沙門菌素和黏液表型調(diào)節(jié)因子rmpA，3’區(qū)域含接合轉(zhuǎn)移基因[41]。ICEKp10編碼耶爾森菌素和基因毒素colibactin，但缺少rmpA和iro基因[42]。ICEs普遍存在于肺炎克雷伯菌中，尤其是hvKp菌株。近90%的CG23菌株和近75%的hvKp菌株均含ICEs[10]。Lam等[40]對肺炎克雷伯菌中ICEs的流行、進(jìn)化和遷移性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ICEs主要通過基因水平轉(zhuǎn)移在肺炎克雷伯菌種群(包括多重耐藥肺炎克雷伯菌)中動態(tài)循環(huán)，極大地促進(jìn)肺炎克雷伯菌間的遺傳物質(zhì)交流。Farzand等[43]發(fā)現(xiàn)，ICEKp2雖與銅綠假單胞菌PAPI高度同源，廣泛分布于銅綠假單胞菌中，但在肺炎克雷伯菌中也有少量分布，當(dāng)ICEKp2和ICEKp1存在于同一肺炎克雷伯菌中，ICEKp2的4型偶聯(lián)蛋白促進(jìn)ICEKp1在肺炎克雷伯菌間轉(zhuǎn)移，此為ICEs促進(jìn)毒力和耐藥性播散提供了新的作用途徑。另外，最近一項研究[44]顯示，ICEKp的缺失可使肺炎克雷伯菌鐵載體分泌減少，抗菌藥物抗性降低，并指出此與ICEkp編碼的耶爾森菌素ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)。

2.5 鐵載體 鐵是細(xì)菌生長所必需的，而鐵載體可在低鐵環(huán)境中(如人類宿主)以極高的鐵親和力為細(xì)菌提供鐵，促進(jìn)細(xì)菌生長和繁殖[10]。hvKp比cKp產(chǎn)生更多的鐵載體，且鐵載體活性提高了6～10倍[1]。hvKp能產(chǎn)生4種鐵載體：腸桿菌素、耶爾森菌素、沙門菌素和氣桿菌素。腸桿菌素普遍存在于肺炎克雷伯菌中，但由于其能被宿主載脂蛋白2滅活，在感染中幾乎不發(fā)揮作用。耶爾森菌素也廣泛存在于肺炎克雷伯菌，但在hvKp中更常見，研究[24]表明，耶爾森菌素與侵襲性感染(菌血癥、肝膿腫等)風(fēng)險增加顯著相關(guān)。編碼耶爾森菌素的ybt基因存在于FIBK質(zhì)粒上。FIBK質(zhì)粒在肺炎克雷伯菌中非常普遍且高度穩(wěn)定，并且許多FIBK質(zhì)粒已獲得AMR轉(zhuǎn)座子，使得AMR與毒力基因的聚合幾乎不存在障礙，可極大地促進(jìn)hvKp菌株的耐藥性[40]。編碼沙門菌素和氣桿菌素的基因存在于毒力質(zhì)粒上，因此沙門菌素和氣桿菌素是hvKp特有的。其中，氣桿菌素占鐵載體總量的80%～90%，對hvKp生長和存活至關(guān)重要，可協(xié)助hvKp從腸道轉(zhuǎn)移到各種組織并在這些組織中繁殖，從而引起嚴(yán)重感染[1, 24]。氣桿菌素由iucABCD操縱子編碼，其同源受體由iutA基因編碼。沙門菌素在hvKp感染中的具體作用還未明確，有研究[45]指出沙門菌素似乎與微球菌素E492一起促進(jìn)hvKp菌株在宿主中定植。

2.6 其他 hvKp菌株的高毒力表型受多種毒力因子的共同作用，除了上述毒力因子外，還有其他可能發(fā)揮作用的毒力因子。一是peg-344，其位于hvKp菌株hvKp1的毒力質(zhì)粒上，可增加hvKp1的毒力，并在hvKp菌株中廣泛流行[46]，用peg-344環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)可快速分辨hvKp和cKp[47]。二是尿囊素，其在肺炎克雷伯菌中既是氮源又是碳源。研究[48]表明，尿囊素在K1 hvKp菌株中更常見，肺炎克雷伯菌對尿囊素的利用能力可能有助于其對氮源的競爭。尿囊素代謝受基因allB(尿囊素酶)、allR(負(fù)調(diào)節(jié)劑)、allS(轉(zhuǎn)錄激活因子)和ybbW(丙氨酸通透酶)調(diào)控。三是Colibactin ，是一種多肽類基因毒素，由位于ICEkp 54 kb位點上的clb基因(也稱pks基因)編碼的非核糖體肽合成酶-聚酮合成酶的合成，并通過ICEkp實現(xiàn)菌株間的基因水平轉(zhuǎn)移[3]。Colibactin可誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，擾亂宿主細(xì)胞周期，還有助于hvKp菌株在宿主體內(nèi)定植，導(dǎo)致小鼠感染K1 ST23肺炎克雷伯菌[49]。四是cAMP受體蛋白，是一種具有多效性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可負(fù)調(diào)控莢膜多糖生物合成，其突變體能產(chǎn)生更高的CPS水平，但會降低肺炎克雷伯菌NTUH-2044生物膜形成能力、生長速率和毒力[50]。因此，cAMP受體蛋白是否具有同時調(diào)控其他毒力因子的功能，以及對hvKp毒力的具體調(diào)控作用仍待明確。最后是hvKp菌株形成生物膜的能力，Wu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，hvKP比cKp產(chǎn)生更多的生物膜。但也有研究[52]提出，hvKp與cKp生物膜形成能力無差異，且生物膜形成能力對hvKp毒力無明顯影響。因此，生物膜形成與hvKp引起的侵襲性感染是否相關(guān)，仍值得進(jìn)一步研究。

3 HvKp相關(guān)耐藥機制

相比于cKp對抗菌藥物的高耐藥率，hvKp對抗菌藥物的耐藥率普遍較低。但近年來隨著可移動遺傳元件在全球的快速傳播，已觀察到兩種融合方式形成耐藥hvKp菌株：獲得毒力基因的cKp菌株和獲得耐藥基因的hvKp菌株。以下就hvKp相關(guān)耐藥機制進(jìn)行闡述。

3.1 基因水平轉(zhuǎn)移 基因水平轉(zhuǎn)移是指在非親子關(guān)系的有機體之間共享遺傳物質(zhì)，通常與細(xì)菌的抗菌藥物耐藥性和致病性相關(guān)，通過質(zhì)粒、ICEs、轉(zhuǎn)座子等移動遺傳元件，以接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等方式播散或獲得耐藥性或毒力。接合是指供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間通過接合菌毛進(jìn)行物理接觸而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)化是指從環(huán)境中攝取外源遺傳物質(zhì)；轉(zhuǎn)導(dǎo)是指外源遺傳物質(zhì)整合到噬菌體基因組中并通過噬菌體傳遞[53]。其中，接合是細(xì)菌中最常見的基因水平轉(zhuǎn)移[54]。接合轉(zhuǎn)移由參與DNA轉(zhuǎn)移和復(fù)制(Dtr)、交配對形成(Mpf)的相關(guān)轉(zhuǎn)移基因調(diào)控。Dtr基因是松弛酶處理DNA所必需的，松弛酶在轉(zhuǎn)移起點的nic位點切割DNA分子，并保持附著在DNA單鏈上；Mpf編碼負(fù)責(zé)合成T4SS的蛋白；松弛酶與DNA鏈相連，通過T4SS形成的孔道轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，最后借助ssDNA結(jié)合蛋白、反限制蛋白和SOS抑制蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定的接合子[55]。一般情況下，轉(zhuǎn)移基因處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)感知到特定信號(如特定受體的存在、高細(xì)胞密度以及氧氣、溫度變化等)時可開啟并誘導(dǎo)基因的接合轉(zhuǎn)移[55]。質(zhì)粒和ICEs通常能自行完成接合轉(zhuǎn)移，或者在其他基因組元件的幫助下進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。如前述cKp耐藥株可獲得ICEs或接合性毒力質(zhì)粒而進(jìn)化為hvKp耐藥株。反之，hvKp菌株亦可獲得耐藥質(zhì)粒而形成hvKp耐藥株。Yang等[56]研究發(fā)現(xiàn)，hvKp菌株(pKpn1693，K1 ST23)可獲得含碳青霉烯酶基因blaCTX-M-24的IncFII型質(zhì)粒；在該菌株的染色體上還發(fā)現(xiàn)了多個外排泵基因和耐藥基因，因此，還對磷霉素、多粘菌素、廣譜β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類等耐藥。Huang 等[38]對hvKp的喹諾酮類耐藥機制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hvKp的耐藥質(zhì)粒上含喹諾酮類耐藥的關(guān)鍵基因qnrA1，此外，gyrA和parC基因的突變也參與了喹諾酮類藥物耐藥。

3.2 AcrB外排泵 在許多革蘭陰性桿菌中，抗性結(jié)瘤細(xì)胞分裂超家族(resistance-nodulation-cell division，RND)是主要的藥物外排泵，可通過三個連續(xù)構(gòu)象(進(jìn)入、結(jié)合和擠出)的循環(huán)將藥物排出。其通常以不對稱的三聚體形式存在，含有12/13/14個跨膜螺旋，位于螺旋1和2以及7和8之間的兩個大的外環(huán)，跨膜域主要作為能量源質(zhì)子的管道，外部環(huán)包含與輸出配體結(jié)合的位點[57]。而三聚體內(nèi)膜成分吖啶黃素抗性蛋白B(acriflavine resistance protein B，AcrB)是藥物/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運過程中的藥物特異性識別和能量轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，與周質(zhì)蛋白AcrA和外膜蛋白TolC作為一個三方系統(tǒng)協(xié)同工作。其在結(jié)構(gòu)上可以分為對AcrB三聚重要的漏斗結(jié)構(gòu)域或?qū)咏Y(jié)構(gòu)域(FD)，負(fù)責(zé)能量轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運的TMD，以及包含結(jié)合位點并介導(dǎo)底物識別、攝取和轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域(PD)[58]。AcrB由acrB基因編碼，可被ramA、soxS、marA、rob和acrA等基因激活而過表達(dá)，進(jìn)而降低肺炎克雷伯菌對藥物，如喹諾酮類藥物(萘啶酸、環(huán)丙沙星)和頭孢西丁、氯霉素、紅霉素、替加環(huán)素等的敏感性[59-60]。但ramR、soxR、acrR等可通過抑制acrB，恢復(fù)細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性[61]。AcrB外排泵介導(dǎo)的耐藥在hvKp菌株中也得到了證實。Srinivasan等[62]在hvKp菌株(NTUH-K2044)中發(fā)現(xiàn)一個新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控蛋白—LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子oxyR，其與acrB表達(dá)正相關(guān)；△oxyR突變株的acrB相對表達(dá)量約降低為原來的1/5，同時阿莫西林、氯霉素、紅霉素、萘啶酸、利福平和甲氧芐啶的最低抑菌濃度也隨之降低。Huang等[38]研究也表明，相對于對照株KP478，hvKp菌株(VGHCRE225)的外排泵基因acrB及其調(diào)控基因ramA過表達(dá)，同時AcrB的負(fù)調(diào)控基因acrR和ramR分別被插入序列ISKpn26，發(fā)生錯義突變，此與替加環(huán)素耐藥性有關(guān)。

3.3 脂多糖修飾 脂多糖是肺炎克雷伯菌細(xì)胞膜的主要成分之一，在結(jié)構(gòu)上主要包含三種成分：將整個結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞膜中的脂質(zhì)A成分、核心寡糖和稱為O抗原的末端側(cè)鏈[28]。其中脂質(zhì)A是位于細(xì)胞膜外單層的疏水部分，由lpx基因簇編碼的一系列酶合成。脂質(zhì)A由于游離磷酸基團(tuán)的存在而帶有負(fù)電荷，而多粘菌素對脂質(zhì)A負(fù)電荷具有高親和力，兩者結(jié)合后可破壞脂多糖的穩(wěn)定性，使細(xì)胞外膜不完整，最終導(dǎo)致多粘菌素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮殺菌作用[63]。但當(dāng)脂多糖中帶正電的殘基如4-氨基-L-阿拉伯糖、磷酸乙醇胺或氨基半乳糖增加，則可改變脂質(zhì)A的負(fù)電荷狀態(tài)，從而減少多粘菌素與脂質(zhì)A間的相互作用并增強多粘菌素抗性。4-氨基-L-阿拉伯糖的生物合成由pmrEHFIJKLM基因編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控，而pmrEHFIJKLM基因受雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PmrAB的直接調(diào)節(jié)和 PhoPQ的間接調(diào)節(jié)[64]。PmrAB 還通過磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶PmrC控制合成磷酸乙醇胺所需基因的表達(dá)[65]。Huang等[38]研究也證實，hvKp菌株中pmrHFIJKLM的高表達(dá)增加了脂多糖的修飾，通常與多粘菌素抗性有關(guān)。Choi等[66]研究表明，hvKp中多粘菌素抗性的獲得與編碼phoPQ或pmrAB基因的上調(diào)，以及pmrD和pbgP基因表達(dá)的增加有關(guān)，并且指出這種抗性可能導(dǎo)致與毒力相關(guān)的表型缺陷，如莢膜多糖、HMV表型和血清抵抗力等。另外，Lee等[67]指出，攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒是革蘭陰性菌產(chǎn)生多粘菌素抗性的重要原因，并可通過水平基因轉(zhuǎn)移；mcr-1基因編碼一種磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，催化磷酸乙醇胺與脂質(zhì)A反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)多粘菌素抗性。此與研究[11-12]結(jié)果一致。Sellick等[68]在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，mgrB突變誘導(dǎo)PhoPQ調(diào)控的脂質(zhì)A重塑，進(jìn)而賦予肺炎克雷伯菌對多粘菌素的抗性。隨后，研究[69]表明，此機制亦出現(xiàn)在hvKp中，發(fā)現(xiàn)IS Kpn18對mgrB基因的截斷，導(dǎo)致對多粘菌素和碳青霉烯類耐藥hvKp的出現(xiàn)。

4 總結(jié)與展望

自1980年中國臺灣首次報道以來，hvKp已在包括中國、印度、歐洲和美國等多個國家甚至全球范圍內(nèi)被報道[48, 69]。hvKp能引起健康人群感染，且一旦感染極易導(dǎo)致多部位感染，造成極高的病死率。多重耐藥hvKp的出現(xiàn)更是增加了感染患者的治療難度。目前已有研究[24]證實，hvKp的高毒力受毒力質(zhì)粒、ICEs、鐵載體、莢膜多糖等多種相關(guān)因素調(diào)控，但有關(guān)hvKp耐藥機制的研究仍較少，同時有關(guān)hvKp毒力因子及其耐藥機制相關(guān)性的研究更少。雖然，目前hvKp耐藥率仍遠(yuǎn)低于cKp，但耐藥hvKp感染一旦出現(xiàn)，往往造成難以預(yù)估的嚴(yán)重后果。因此，對于hvKp毒力因子、耐藥機制以及其相關(guān)性的研究是非常有必要的。本綜述詳細(xì)介紹了hvKp菌株相關(guān)毒力因素以及可能存在的各種耐藥機制，旨在探討hvKp的耐藥性是否與其高毒力相關(guān)，為臨床診療提供一定的參考意見。此外，針對目前越來越多的多重耐藥hvKp菌株的出現(xiàn)，更加有效的藥物開發(fā)非常必要，而根據(jù)hvKp菌株毒力因子以及耐藥機制尋找新的阻斷方式是未來可以考慮的一個方向。