韓森 馬旭 方健

從20世紀30年代開始，人們逐漸了解染色體上的一段特殊結(jié)構(gòu)——端粒（telomere）。端粒位于真核細胞染色體的末端，與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成特殊的“帽狀”結(jié)構(gòu)，保持染色體的完整性和控制細胞分裂周期。其實質(zhì)為一小段DNA——蛋白質(zhì)的復(fù)合體。根據(jù)DNA復(fù)制的機制及特點，每次染色體復(fù)制后，延伸鏈上的DNA末端必有一小段無法被復(fù)制。所以，細胞每分裂一次，端?？s短30 bp-200 bp，當其縮短到2 kb-4 kb的特定臨界值時，細胞將會進入靜默期或者啟動凋亡機制。因此，端粒被推測與細胞老化有明顯的關(guān)系[1]。但是，人體的部分細胞，例如精原母細胞、腫瘤細胞等，含有端粒酶，能在DNA末端接上新的端粒片段，使其不會隨著分裂次數(shù)增加而縮短，從而實現(xiàn)細胞的無限復(fù)制。端粒酶也被認為與腫瘤有著密切的關(guān)系[2]。2009年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予在端粒和端粒酶研究領(lǐng)域有突出貢獻的伊麗莎白·布萊克本等3位科學家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了端粒和端粒酶保護染色體的機制。從此，端粒與端粒酶的研究在腫瘤領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注，尤其是阻斷端粒延長機制以及端粒酶抑制劑等可能成為潛在的抗腫瘤治療新靶點[3]。

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計每年有超過一百萬人死于肺癌[4]。肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC），二者在臨床病理特征及預(yù)后方面存在很大差異?？傮w來說，肺癌的5年生存率只有18%左右[5]。雖然隨著近年來抗腫瘤治療手段的提高，靶向藥物和免疫治療極大地改善了進展期肺癌患者的預(yù)后，但是靶向和免疫治療的耐藥仍不可避免[6,7]。為了能夠更好地控制腫瘤，人們在端粒和端粒酶的研究方面也做出積極探索。不僅如此，端粒及端粒酶在腫瘤及正常組織中的差異，使其可能成為天然有效的抗腫瘤治療靶標和預(yù)測指標，近年來也有許多相關(guān)報道。因此，本文將對端粒和端粒酶研究在肺癌領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用進展進行闡述，并提出該研究領(lǐng)域的發(fā)展前景和面臨的挑戰(zhàn)。

1 端粒與端粒酶

端粒是真核細胞線性染色體的末端結(jié)構(gòu)，在細胞復(fù)制過程中起保護作用，避免DNA受到損傷，并且像帽子一樣有效防止染色體間末端重組、融合和染色體退化。端粒的DNA序列是高度保守的，所有哺乳動物的端粒是由“d-TTAGGG”重復(fù)序列組成，并且包含六種蛋白質(zhì)而形成的特定“shelterin”復(fù)合體，維持染色體和基因組的穩(wěn)定性[8]。正常體細胞受精后，端粒隨著每次細胞分裂和染色體復(fù)制而逐漸縮短，這導(dǎo)致一旦端?？s短達到特定的長度（稱為“Hay flick極限”），細胞就會進入靜止期，從而停止分裂，或者啟動細胞凋亡機制。由于大部分體細胞中缺乏端粒延長的機制，所以該過程很大程度上參與了正常細胞的衰老過程。具有增殖功能的干細胞和癌細胞可以通過一種功能性核糖核蛋白酶復(fù)合物，即端粒酶，來解決端粒縮短問題。

端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體復(fù)合體。端粒酶屬于一種逆轉(zhuǎn)錄酶，與端粒（長度）的調(diào)控機制密切相關(guān)。人類端粒酶的組成包括：端粒酶RNA（human telomerase RNA component, hTR）、端粒酶活性催化單位（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）以及端粒酶結(jié)合蛋白。它以自身的RNA作為端粒DNA復(fù)制的模板，合成出富含脫氧單磷酸鳥苷（G）的DNA序列后，添加到染色體的末端并與端粒蛋白質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定了染色體的結(jié)構(gòu)。在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到嚴格調(diào)控，只有在癌細胞、干細胞和生殖細胞中才能檢測到具有活性的端粒酶。

2 端粒、端粒酶與腫瘤

相對于正常體細胞，腫瘤細胞的端粒一般較短。研究[9,10]證實絕大多數(shù)膀胱癌的浸潤前期、頭頸癌、結(jié)腸癌、食管癌和口腔癌端粒長度非常短，而大多數(shù)腫瘤細胞通過端粒酶的激活維持端粒在一個穩(wěn)定的長度，確保細胞的快速增殖及永生化。一個有趣的現(xiàn)象是：盡管在85%-90%的腫瘤中都能夠檢測到端粒酶的活性，但端粒酶并不是導(dǎo)致細胞癌變的直接原因，而是在腫瘤生長和增殖過程中具有決定性的作用。因此，端粒酶的激活發(fā)生在癌變之后（當?shù)谝粋€腫瘤細胞已經(jīng)產(chǎn)生），端粒酶使得這個腫瘤細胞變得不朽，并能夠無限分裂增殖。有時，端粒酶也是可以抑制腫瘤的。當端粒酶進入非活性狀態(tài)，則會減少細胞分裂的數(shù)量，這成為人們利用端粒酶抑制劑進行抗腫瘤的機制。

3 端粒、端粒酶與肺癌

3.1 端粒長度與肺癌的發(fā)生風險 Jang等[11]研究端粒長度與肺癌發(fā)生風險之間的關(guān)系，結(jié)果顯示端粒長度的縮短與肺癌發(fā)生風險升高相關(guān)。該研究通過定量聚合酶鏈反應(yīng)測量了243例肺癌患者和243名健康對照者的外周血淋巴細胞相對端粒長度，這些患者的年齡、性別和吸煙狀況均匹配。結(jié)果提示肺癌患者的端粒長度明顯短于健康對照組（1.59vs2.16,P＜0.000,1）。將端粒長度的中位數(shù)作為臨界點時，端粒短的個體患肺癌的風險明顯高于端粒長的個體（OR=3.15, 95%CI: 2.12-4.67,P＜0.000,1）。當按肺癌組織亞型進行分類時，端粒長度縮短對肺癌發(fā)生風險影響最大的是SCLC，這一影響比鱗狀細胞癌和腺癌均明顯（P=0.001，均一性檢驗）。因此表明端粒的縮短可能是肺癌的危險因素，或可作為肺癌易感性的預(yù)測指標[11]。

但是，另一項針對重度吸煙人群的前瞻性觀察研究[12]卻得出不同的結(jié)論，即端粒長度增加的個體肺癌發(fā)生風險增加。該研究是一項包含709例肺癌患者和1,313例健康個體的巢式病例對照研究，在端粒長度最長的人群中（采用三分位數(shù)），總體肺癌和肺腺癌的發(fā)生風險均升高，并且與肺腺癌的關(guān)聯(lián)最強。一項針對26,540名新加坡華人的健康隨訪[13]也得出了相似的結(jié)論。該研究測定所有受試者外周血白細胞的相對端粒長度，經(jīng)過12年的隨訪，有654名觀察對象罹患肺癌，其中包括288例腺癌、113例鱗狀細胞癌和253種其他/未知組織學類型的肺癌。使用Cox風險回歸模型來評估肺癌發(fā)生的風險，結(jié)果顯示端粒長度前20%者與后20%者相比，肺腺癌的發(fā)生風險升高（HR=2.84,95%CI: 1.94-4.14,P＜0.000,1），而端粒長度與肺鱗癌和其他病理類型的發(fā)生風險無明顯相關(guān)性[13]。

基于上述兩種不同的觀點，理論上分別有相應(yīng)的解釋：①端粒長度的縮短，使得細胞的基因不穩(wěn)定性增加，因此容易發(fā)生基因突變等異常情況，使得肺癌的腫瘤發(fā)生風險增加；②端粒長度的延長，使得細胞壽命延長，獲得了更多分裂的機會，而在更長的時間和更多的分裂機會下，發(fā)生基因突變的幾率會升高。如果發(fā)生了肺癌腫瘤驅(qū)動基因的改變，那么發(fā)生肺癌的風險自然就會增加[14]。因此，兩種截然相反的結(jié)果，都有其合理的理論解釋。為了解答這一問題，對于端粒長度與肺癌發(fā)生風險的研究，尤其是機制方面的研究還有待進一步完善。

3.2 端粒長度與肺癌患者的預(yù)后 有研究[15-17]顯示外周血白細胞中端粒長度與癌癥患者的死亡風險相關(guān)。雖然不同研究得到的結(jié)果并不完全一致，但總體來說端粒長度的縮短提示肺癌患者的預(yù)后較差。一項針對13項非血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究的薈萃分析[18]發(fā)現(xiàn)，外周血端粒長度縮短與癌癥患者死亡風險增加相關(guān)。Weischer等[15]通過對丹麥人群的研究發(fā)現(xiàn)，診斷為肺癌之前檢測到端粒長度縮短與肺癌患者死亡率增加有關(guān)。Kim等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在早期NSCLC患者確診時測得的端粒長度過長與根治性肺癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)風險增加相關(guān)。Jeon等[20]為了明確端?？s短對早期NSCLC患者生存的影響，通過定量聚合酶鏈反應(yīng)在164例手術(shù)切除的NSCLC患者中測量了腫瘤組織中的相對端粒長度，并且分析端粒長度與總生存期（overall survival, OS）和無病生存期（disease free survival, DFS）之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù)端粒長度的四分位數(shù)分類，端粒長度最短的患者與端粒長度第2-第4個四分位數(shù)的患者相比，OS和DFS明顯縮短（其中OS的調(diào)整后HR=2.67，95%CI：1.50-4.75，P=0.001；DFS調(diào)整后的HR=1.92，95%CI：1.17-3.14，P=0.01）。在鱗狀細胞癌中，端粒長度與預(yù)后的關(guān)聯(lián)比腺癌更為明顯。因此，該研究的結(jié)論是手術(shù)切除的早期NSCLC患者的腫瘤組織端粒長度是肺癌患者獨立的預(yù)后因素。

一項針對吸煙人群的大規(guī)模前瞻性研究[21]顯示，端粒長度縮短與SCLC的死亡率增加密切相關(guān)，尤其是III期/IV期的SCLC患者，端粒長度縮短者與較長者（采用三分位數(shù)）相比，死亡風險增加3.32倍（95%CI: 1.78-6.21）。但是端粒長度與肺癌其他病理類型的死亡風險無明顯相關(guān)性。以上是基于788例肺癌患者，在確診之前平均6年的時間里進行的端粒長度測定，并且隨訪8年時間而得出的結(jié)論。

3.3 端粒酶與肺癌及肺癌驅(qū)動基因 Dobija-Kubica等[22]報道了端粒酶活性與NSCLC的病理類型及其預(yù)后的關(guān)系。該研究檢測了47例肺癌組織的端粒酶活性，并與30例肺癌旁的正常肺組織進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的端粒酶活性顯著高于癌旁組織，并且分化越差的肺癌中端粒酶活性越高（P=0.008）。但是，端粒酶活性與病理類型和患者的2年生存率均無明顯相關(guān)性[22]。

Xing等[23]通過對828例受試者（410例NSCLC，418名健康對照）進行TERT基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，在rs2736100基因位點攜帶G的人群發(fā)生NSCLC的風險顯著增高（TG+GGvsTT, OR=1.68, 95%CI: 1.28-2.07）。在rs2736098基因位點攜帶A的人群發(fā)生NSCLC的風險顯著增高（GA+AAvsGG, OR=1.52, 95%CI: 1.19-1.93）。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因是NSCLC中最重要的腫瘤驅(qū)動基因。越來越多的研究[24-26]認識到EGFR信號通路可能與端粒酶的活性有關(guān)，EGFR可以通過增加TERT的轉(zhuǎn)錄，從而增強端粒酶的活性。Yuan等[27]研究TERT基因啟動子區(qū)域基因多態(tài)性與肺癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EGFR基因野生型的NSCLC中，rs2853669 T/C等位基因與TERT的低表達顯著相關(guān)（與C/C和T/T相比，P＜0.001）；而在EGFR突變?nèi)巳褐袩o明顯相關(guān)性。rs2853669 T/C等位基因與端粒長度縮短及肺癌患者的預(yù)后也存在明顯相關(guān)性。Wei等[28]研究發(fā)現(xiàn)TERT基因位點rs2736100-C等位基因與EGFR基因突變呈顯著相關(guān)性，而EGFR野生型無關(guān)。

3.4 端粒和端粒酶研究在肺癌治療中的應(yīng)用前景 肺癌是一種個性化比較豐富的腫瘤，臨床上用藥有效率不高，繼續(xù)通過化療、放療、靶向治療甚至是免疫治療有效，腫瘤的耐藥也不可避免，這一直困擾著肺癌臨床治療。雖然目前在端粒和端粒酶的相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)尚無一種藥物可以成功用于臨床抗腫瘤治療，但人們正在從不同的角度積極進行靶向治療藥物的研究和探索，例如：端粒結(jié)構(gòu)的類似物和端粒酶抑制劑等。

3.4.1 鳥氨酸四聯(lián)體穩(wěn)定劑 正常情況下，端粒會形成鳥氨酸四聯(lián)體（G-quadruples complex, G4）的二級結(jié)構(gòu)，從而維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和發(fā)揮正常的生理功能[29]。針對端粒的這一結(jié)構(gòu)特點，一些小分子的靶向藥物被設(shè)計出來，例如BRACO19、RHPS4、Telomestain等[30]。希望以此來阻斷端粒與端粒酶的結(jié)合，從而阻止端粒的延長、抑制其對染色體的保護功能，達到抗腫瘤的作用。

3.4.2 端粒末端單鏈核苷酸類似物 端粒3'末端單鏈核苷酸類似物（oligonucleotides mimicking the 3' overhang of telomere sequences, T-oligo）通過模擬端粒末端突出的單鏈，被細胞的防御機制識別為危機長度的端粒，啟動類似DNA損傷的反應(yīng)，進入細胞凋亡途徑[31]。同時，T-oligo還可以阻斷端粒與端粒酶的結(jié)合?？傮w來說，針對端粒的小分子靶向藥物初步顯示出較好的抗腫瘤效果，但是因其不良反應(yīng)較嚴重，即對于增殖較快的正常細胞和干細胞產(chǎn)生損害，所以目前還不能進入臨床應(yīng)用階段。另外，針對端粒的小分子靶向藥物并不依賴端粒酶，所以對于端粒酶陰性的腫瘤也可以發(fā)揮抑制作用[32]。

3.4.3 針對人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶模板RNA的反義寡核苷酸 針對人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶模板RNA的反義寡核苷酸屬于端粒酶抑制劑，通過結(jié)合端粒酶RNA-蛋白復(fù)合體中的RNA部分，發(fā)揮抑制端粒酶功能的作用，例如端粒酶抑制劑Imetelstat（GRN163L）。一項旨在探討Imetelstat在進展期NSCLC維持治療中作用的II期臨床研究[33]顯示，端粒長度縮短的患者可以從Imetelstat的維持治療中得到生存獲益，但是對整體患者而言并不能提高NSCLC的無進展生存率，反而增加3度以上骨髓抑制的不良反應(yīng)。

3.4.4 hTERT抑制劑 hTERT是端粒酶復(fù)合物的活性催化亞基，因此抑制hTERT也屬于端粒酶抑制劑的范疇，例如BIBR1532。臨床前研究[34,35]顯示BIBR1532可以有效地抑制多種腫瘤細胞端粒酶的活性，縮短端粒并最終導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖阻滯和凋亡。還有研究[36]還顯示BIBR1532能夠增加NSCLC患者的放射治療敏感性，提示未來其有可能成為一種放療增敏劑。

3.4.5 針對hTERT的免疫治療 端粒酶中的部分肽段結(jié)構(gòu)能夠作為端粒酶相關(guān)抗原（telomerase-associated antigens,TAAs）活化CD4+及CD8+T細胞，另一方面可以促進hTERT特異性細胞毒性T淋巴細胞的激活。這些特點使得TAAs具有產(chǎn)生強大的免疫殺傷反應(yīng)的潛能，從而介導(dǎo)特異性的免疫殺傷效應(yīng)。例如GV1001，在包括黑色素瘤、進展期NSCLC及肝癌等多項I期/II期臨床試驗中取得了較好的療效以及安全性，但目前尚無成功的III期臨床試驗，因此也未臨床應(yīng)用于肺癌治療[10]。

3.4.6 靶向結(jié)合端粒酶的小RNA 小RNA（microRNA,miRNA）作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平進行基因表達的調(diào)控，即與信使RNA（message RNA,mRNA）靶向結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或者促進mRNA的裂解消亡。因此一些miRNA可以影響端粒酶基因的表達，從而影響端粒酶的合成代謝及功能。有研究[37,38]顯示miR-138、miR-128、miR-1182、miR-133a、miR-342、miR-491和miR-541等小RNA都可以與hTERT的mRNA結(jié)合，負向調(diào)節(jié)hTERT的表達，因此這些小RNA未來有可能作為腫瘤抑制性的RNA，成為肺癌治療的新靶點。

4 端粒和端粒酶研究面臨的問題與挑戰(zhàn)

4.1 端粒長度測定的局限性 通過外周血標本進行端粒長度的檢測是簡便易行的方法，因為獲得血液標本相比肺組織標本具有更少的侵入性，容易獲得，并且肺癌的血液標志物對篩查易感人群具有重要意義。但是，血液中端粒長度的縮短也與常見的年齡相關(guān)疾病有關(guān)，例如中心型肥胖、睡眠不足和高血壓等[39]。另外，腫瘤治療相關(guān)的混雜因素、端粒測定方法的統(tǒng)一標準等問題，使得端粒長度的結(jié)果判定存在很大的局限性。

4.2 端粒長度維持機制的旁路激活的問題 雖然肺癌中端粒長度的維持主要依靠端粒酶的作用，即端粒酶是維持端粒長度、促進細胞不斷分裂增殖的主要因素，但是有研究[40]發(fā)現(xiàn)，還存在一些端粒酶以外的旁路機制，即不依賴端粒酶也可以維持腫瘤端粒的長度穩(wěn)定。這使得單一的端粒酶抑制劑在抗腫瘤治療方面的作用大大削弱。因此，下一步可能需要深入研究端粒長度維持的旁路激活機制，并研究研發(fā)端粒酶抑制劑與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用，為開發(fā)新的抗腫瘤治療藥物提供理論依據(jù)。

4.3 針對端粒和端粒酶的靶向藥物治療肺癌面臨的挑戰(zhàn)雖然近年來靶向端粒/端粒酶的抗腫瘤治療取得了許多進展，研發(fā)出包括鳥氨酸四聯(lián)體穩(wěn)定劑、端粒末端單鏈核苷酸類似物、針對人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶模板RNA的反義寡核苷酸、hTERT抑制劑等多種藥物，有的已進入臨床試驗階段，但是仍然存在很多問題。例如：端粒酶抑制劑

Imetelstat在進展期NSCLC維持治療中使患者得到生存獲益，但是并未提高NSCLC的無進展生存率，反而增加3度以上骨髓抑制的不良反應(yīng)[33]，使其在未能成功應(yīng)用于臨床。端粒酶抑制劑存在局限性的主要原因為：由于正常機體內(nèi)的干細胞、生殖細胞及增生較快的正常細胞也表現(xiàn)出端粒酶活性，所有靶向端粒酶的治療很可能導(dǎo)致對正常組織的損害，從而表現(xiàn)出各種近期和遠期的不良反應(yīng)，很難在取得抗腫瘤療效的同時避免正常組織及器官的損傷。另外，肺癌是一種異質(zhì)性很強的惡性腫瘤，不同的病理亞型、不同的分子分型對于藥物的治療反應(yīng)相差很大。同樣地，肺癌中有的端粒酶活性高，并且端粒酶在腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用，那么這部分肺癌患者對于端粒酶抑制劑可能有較好的療效。而那些端粒酶活性不高的肺癌，或者腫瘤進展不依賴端粒酶，或者存在端粒長度維持機制的旁路激活，可能對于端粒酶抑制劑的療效就差。因此，端粒/端粒酶抑制劑要想在臨床應(yīng)用上取得重大進展，很可能也要尋求個體化的治療方案，找到一些更精準的“驅(qū)動基因”或者“腫瘤靶點”。

5 小結(jié)

端粒和端粒酶與細胞衰老和腫瘤密切相關(guān)。雖然端粒酶可能并不是導(dǎo)致細胞癌變的直接原因，但是在維持端粒長度和腫瘤生長方面卻發(fā)揮著重要作用。包括肺癌在內(nèi)的大部分腫瘤端粒長度縮短。端粒長度的變化與肺癌發(fā)生風險相關(guān)，并可能作為肺癌，尤其是SCLC患者的預(yù)后指標。針對端粒和端粒酶作用機制的抗腫瘤靶向治療正在不斷探索中，其中以端粒酶抑制劑最具潛在治療價值。但是，人們對于端粒和端粒酶在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制認識還遠遠不夠，例如端粒長度維持的旁路激活機制等。因此，下一步需要繼續(xù)深入研究端粒和端粒酶的作用機制，期待能夠早日研發(fā)出應(yīng)用于肺癌治療的靶向藥物。