吳俊東，耿智隆，楊勇麗，楊婉君，張強英

(1.蘭州大學第二臨床醫(yī)學院麻醉學系，蘭州730030； 2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院麻醉科，蘭州 730050)

膿毒癥是由感染引起的宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙綜合征[1]。有文獻報道，我國外科重癥監(jiān)護病房及綜合重癥監(jiān)護病房嚴重膿毒癥患病率分別為8.7%和37.3%；雖然不同國家和地區(qū)的發(fā)病率有所不同，但膿毒癥總體發(fā)病率仍有逐年上升趨勢，隨著醫(yī)療水平不斷提高，膿毒癥的預后已有極大改善，但病死率仍為30%～50%[2]。因此，明確膿毒癥的發(fā)病機制，對防治膿毒癥尤為關鍵。機體炎癥反應失控是膿毒癥發(fā)病的重要機制，炎癥小體在其中的作用受到越來越多的關注。炎癥小體是一種由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族成員與PYHIN (pyrin and HIN domain)家族成員組成的胞質多蛋白復合物，其中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)備受關注。NLRP3炎癥小體參與多種疾病的炎癥、免疫和代謝進程，是一種重要的先天免疫傳感器，可以對結構多樣的損傷相關分子模式做出反應，誘發(fā)炎癥反應[3]。NLRP3炎癥小體激活在膿毒癥及其多器官功能障礙中扮演重要角色。現(xiàn)就NLRP3炎癥小體的激活機制及其在膿毒癥中的作用予以綜述。

1 NLRP3炎癥小體的激活機制

1.1離子調節(jié) 離子調節(jié)包括K+外流、Na+內流、Cl-外流和Ca2+信號轉導，已被確定為NLRP3炎癥小體激活的關鍵因素[4-6]。其中，K+濃度降低是NLRP3炎癥小體活化的觸發(fā)因素，已知有許多NLRP3炎癥小體的激活因子(包括成孔毒素、尼日利亞菌素、腺苷三磷酸和顆粒物質)可誘導K+外流，由此認為細胞內K+減少是NLRP3炎癥小體激活的共同機制[4]。有研究指出，NIMA相關蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7，NEK7)可以直接與NLRP3蛋白結合，在K+外流的下游發(fā)揮調節(jié)NLRP3炎癥小體組裝和激活的作用[7]。研究表明，雙孔結構域K+通道TWIK2是觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活的K+外流通道[8]，使人們對K+外流激活NLRP3有了更進一步的認識。但有研究表明，咪喹莫特以及相關分子CL097可誘導活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產生，促進NLRP3炎癥小體活化，而不依賴于K+外流[9]。因此，K+外流在NLRP3炎癥小體激活中是一個重要但非必需的因素。

據(jù)報道，Ca2+信號通路是NLRP3炎癥小體活化的重要組成部分，抑制Ca2+動員可降低NLRP3炎癥小體的活化[5]。同時，Lee等[10]指出，通過鈣敏感受體觸發(fā)磷脂酶C產生1,4,5-三磷酸肌醇，而1,4,5-三磷酸肌醇與其受體相互作用，促進內質網釋放Ca2+，從而激活NLRP3炎癥小體。還有研究顯示，鈣敏感受體相關家族成員6A也具有相似作用[11]。細胞內Ca2+信號通路通過觸發(fā)線粒體損傷或細胞內釋放的Ca2+通過鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ激活轉化生長因子-β激活激酶1/c-Jun氨基端激酶通路，調控NLRP3炎癥小體的激活[12]。但另有研究通過對比K+外流和Ca2+內流的作用發(fā)現(xiàn)，Ca2+信號通路在NLRP3炎癥小體激活中不是必需的[4]。有研究表明，K+外流和Ca2+內流對線粒體ROS的生成至關重要，但K+外流是Ca2+內流的必要條件，從而觸發(fā)NLRP3炎癥小體[13]。因此，需要進一步研究Ca2+信號在NLRP3炎癥小體活化中的作用機制。

在炎癥通路中Cl-的作用也常被關注。有研究表明，非甾體抗炎藥通過抑制容量調節(jié)陰離子通道的Cl-外流來阻止NLRP3炎癥小體激活[14]。Tang等[6]報道了細胞內Cl-通道(chloride intracellular channel，CLIC)在NLRP3炎癥小體調控中的作用，CLIC作用于K+外流-線粒體ROS軸下游，可促進NLRP3炎癥小體的激活，而NLRP3激動劑可誘導K+外流，導致線粒體損傷和ROS生成；線粒體ROS可誘導CLICs轉位至質膜，誘導Cl-外流，促進NEK7-NLRP3相互作用、炎癥小體組裝、胱天蛋白酶(caspase)-1激活和白細胞介素(interleukin，IL)-1β分泌。Green等[15]的進一步研究證明了Cl-外流是凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain，ASC)的寡聚信號，激活caspase-1和分泌IL-1β需要K+外流依賴的NEK7激活與NLRP3的相互作用。有報道顯示，CLIC1和CLIC4也參與NLRP3炎癥小體的調控，CLIC1或CLIC4小干擾RNA轉染抑制了IL-1β轉錄、ASC斑點形成以及成熟IL-1β的分泌[16]。容量調節(jié)陰離子通道與CLIC之間是否也存在某種聯(lián)系值得進一步探討。有報道指出，Na+內流參與了NLRP3炎癥小體活化，但Na+內流和細胞內K+外流聯(lián)動才能激活NLRP3炎癥小體，且莫能菌素誘導的單純Na+內流并未導致NLRP3炎癥小體的激活[4]。因此，Na+內流可能不是NLRP3炎癥小體激活所必需的。

1.2溶酶體 Hornung等[17]證明，攝取內源性或外源性晶體物質(如二氧化硅和明礬)，可誘導溶酶體腫脹、滲漏和組織蛋白酶B釋放，觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活。Weber和Schilling[18]發(fā)現(xiàn)，在NLRP3炎癥小體活化過程中，溶酶體鈣信號通過IL-1β信使RNA穩(wěn)定機制調控IL-1β前體的產生(啟動步驟)，而溶酶體組織蛋白酶B則介導NLRP3-caspase-1 復合物的激活(組裝步驟)。Okada等[12]研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體破裂激活的Ca2+-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ激活轉化生長因子-β激活激酶1/c-Jun氨基端激酶途徑通過促進ASC寡聚化，調節(jié)NLRP3炎癥小體的激活，表明溶酶體破裂和Ca2+流通共同促進NLRP3的活化。Muoz-Planillo等[4]報道，顆粒物通過吞噬作用導致溶酶體膜損傷，且這種損傷通過打開一個或多個可滲透K+的膜孔，觸發(fā)K+外溢引起NLRP3炎癥小體活化；同時還發(fā)現(xiàn)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導可能會增強由晶體或溶酶體抑制劑引起的K+外流。由此可見，溶酶體和離子流通在激活NLRP3炎癥小體方面可能存在協(xié)同作用。

1.3ROS生成 ROS生成是NLRP3炎癥小體激活的重要因素，但目前還存在諸多爭議。許多物質可誘導不同類型細胞線粒體ROS生成，如介孔二氧化硅納米粒子可誘導肝細胞產生ROS，從而激活NLRP3，ROS清除劑則可以顯著改善肝細胞中NLRP3的活化[19]。有研究指出，咪喹莫特誘導ROS促進NLRP3炎癥小體活化，但如果細胞缺乏NEK7，咪喹莫特的刺激則不能產生IL-1β[9]。Tschopp和Schroder[20]指出，ROS的積累能夠釋放對ROS敏感的NLRP3配體，即硫氧還蛋白相互作用蛋白，導致NLRP3炎癥小體活化，但在沒有硫氧還蛋白相互作用蛋白的情況下，caspase-1的激活并未完全被阻斷。Li等[21]報道，線粒體ROS和NLRP3炎癥小體均參與臭氧誘導的肺部炎癥反應，但只有NLRP3參與臭氧誘導的肺氣腫，說明NLRP3炎癥小體可能被非線粒體ROS機制激活。因此，需要進一步研究闡明ROS在NLRP3炎癥小體活化中的確切作用。

1.4NLRP3翻譯后修飾 NLRP3翻譯后修飾包括磷酸化和泛素化，在NLRP3炎癥小體活化中起重要作用。Song等[22]研究顯示，JNK1介導的NLRP3磷酸化是一個關鍵的分子啟動事件，阻斷其S194位點磷酸化可阻止Cryopyrin蛋白相關周期綜合征中NLRP3的激活。Stutz等[23]證明，NLRP3的激活由其蛋白結構域的磷酸化控制，且激酶和磷酸酶的平衡在其中起重要作用。除絲氨酸外，酪氨酸磷酸化同樣參與了NLRP3的調控。Spalinger等[24]研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22與NLRP3相互作用，使蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22在Tyr861位點去磷酸化，從而促使NLRP3炎癥小體激活和IL-1β分泌。

蛋白質的磷酸化不僅可以直接影響NLRP3的活化，還可以通過作用于泛素化間接調控NLRP3的激活。研究表明，膽汁酸通過G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5信號通路磷酸化NLRP3蛋白第291位絲氨酸，并增強NLRP3蛋白泛素化水平，最終抑制NLRP3炎癥小體激活[25]。Yan等[26]研究顯示，神經遞質多巴胺通過多巴胺D1受體抑制NLRP3炎癥小體的激活，多巴胺D1受體信號通過第二信使環(huán)腺苷酸負調控NLRP3炎癥小體，環(huán)腺苷酸與NLRP3結合，并通過E3泛素化連接酶MARCH7(membrane-associated RING-CH-type finger 7)促進多巴胺D1受體泛素化和降解。E3泛素連接酶TRIM31(tripartite motif containing 31)和ARIH2(ariadne homolog 2)也被相繼報道在NLRP3通路中有重要作用[27-28]。一項研究指出，ABR01(abraxas brother 1)是BRISC(BRCC36 isopeptidase complex)去泛素酶復合物的一個亞基，高效的NLRP3活化需要ABRO1的參與，LPS啟動誘導ABRO1以S194磷酸化依賴的方式與NLRP3結合，隨后在激活劑的刺激下招募BRISC移除NLRP3的K63連接的泛素鏈[29]。因此，NLRP3的磷酸化和泛素化在NLRP3炎癥小體活化調控中起關鍵作用，但具體機制仍需更多的研究。研究其他翻譯后修飾(如甲基化和乙酰化)在NLRP3炎癥小體活化調控中的作用可能是一個新的切入點。

除上述調節(jié)機制外，還存在非經典途徑炎癥小體激活，膽堿的吸收和代謝過程也可促進NLRP3炎癥小體的活化?？傊?，NLRP3炎癥小體的激活是一個復雜的過程，只有明確其作用機制，才能針對性地開發(fā)藥物和使用藥物，防治NLRP3炎癥小體通路作用的相關疾病。NLRP3炎癥小體激活機制見圖1。

2 NLRP3炎癥小體與膿毒癥

在膿毒癥發(fā)生的最初階段炎癥因子風暴發(fā)揮重要作用。IL-1β等細胞因子的合成和分泌是誘導全身炎癥反應的關鍵因素，同時也是機體清除病原微生物的重要過程。因此，適當?shù)难装Y反應對機體是有利的，但過度的炎癥反應會造成細胞和組織損傷，引發(fā)膿毒癥甚至膿毒性休克。IL-1β的成熟和活化受caspase-1調控，而caspase-1的調控與NLRP3炎癥小體密切相關。

研究報道，膿毒癥時NLRP3炎癥小體的激活可引起組織線粒體功能障礙并誘發(fā)炎癥反應，而自噬介導的NLRP3炎癥小體失活可減輕膿毒癥引起的炎癥反應和器官損傷[3]。Lee等[30]指出，NLRP3基因缺陷可有效抑制盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒癥模型小鼠的炎癥反應，提高其存活率；可能的機制為NLRP3基因缺陷減輕了caspase-7對脂氧素B4生物合成的抑制，并通過脂氧素B4的產生抑制促炎細胞因子，從而促進多菌敗血癥炎癥的消除，提高存活率。Rahim等[31]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素治療和剔除NLRP3基因對CLP模型小鼠具有相似的作用，均能抑制NLRP3炎癥小體的激活，進而減輕炎癥反應。另外，炎癥小體的活化產物同樣也不容忽視，NLRP3炎癥小體的激活調控caspase-1的活化，從而促進IL-1β和IL-18的產生，而IL-18對感染性休克病死率的預測可能有重要作用[32]。有實驗證實，在剔除caspase-1的情況下，CLP模型小鼠假單胞菌的清除并未發(fā)生障礙，但CLP損傷后caspase-1表達升高和活性增加可能導致先天免疫功能降低[33]，這使得膿毒癥免疫紊亂發(fā)病機制更具說服力。同時，Meissner等[34]指出，超氧化物歧化酶1能夠調控caspase-1的激活，在體內實驗過程中發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶1缺乏的小鼠產生較少的caspase-1依賴性細胞因子，對LPS誘導的感染性休克也不敏感。然而，Vanden Berghe等[35]認為，在膿毒癥中同時靶向IL-1和IL-18才能有效提高生存率，而不是僅僅抑制上游的caspase-1，這為靶向上游NLRP3炎癥小體提供了新思路。綜上，靶向調控NLRP3炎癥小體通路對膿毒癥的預防、治療和轉歸可能具有積極的作用。

NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；CaSR：鈣敏感受體；GPRC6A：CaSR相關家族成員6A；CLIC：細胞內氯離子通道；IP3:三磷酸肌醇；ROS:活性氧類；JNK1：c-Jun氨基端激酶1；ABRO1：abraxas brother 1；PTPN22：蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22；NEK7：NIMA相關蛋白激酶7；TGR5：G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5；cAMP：環(huán)腺苷酸；PKA:蛋白激酶A；DRD1：多巴胺D1受體；MARCH7：membrane-associated RING-CH-type finger 7；TRIM31：tripartite motif containing 31；ARIH2：ariadne homolog 2；caspase-1：胱天蛋白酶1；IL：白細胞介素

3 NLRP3與膿毒癥后多器官功能障礙

2016年國際專家組將膿毒癥定義為感染引起的宿主反應失調所致的危及生命的器官功能障礙，而不單純是全身炎癥反應，同時強調器官功能障礙[1]。器官功能障礙是膿毒癥的嚴重并發(fā)癥，是患者預后不良的主要原因，發(fā)病機制復雜，炎癥反應可能是其發(fā)病機制之一。NLRP3炎癥小體在炎癥反應中扮演重要角色。

3.1NLRP3與膿毒癥心肌病 膿毒癥性心肌病是膿毒癥的嚴重并發(fā)癥，與重癥監(jiān)護病房的高病死率有關。因此，治療膿毒癥心肌病對改善膿毒癥患者的預后至關重要。但膿毒癥性心肌病的具體病因目前尚不明確，可能與過度的炎癥反應有關。研究顯示，膿毒癥時心臟成纖維細胞中的NLRP3炎癥小體被激活，誘導IL-1β等炎癥因子成熟和釋放，通過抑制心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體激活可以減輕LPS誘導的小鼠心肌功能障礙，提高腹膜炎型膿毒癥小鼠的存活率[36]。同時，一氧化碳釋放分子通過阻斷NLRP3炎癥小體與適應性蛋白ASC的相互作用，抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕膿毒癥小鼠的心肌功能障礙[37]。此外，Luo等[38]研究表明，通過阻斷NLRP3通路，可以減輕LPS誘導的炎癥反應和細胞凋亡，恢復受損的心肌功能。心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動力器官，心肌功能障礙會影響機體循環(huán)，破壞全身血流動力學穩(wěn)定。因此，探究NLRP3炎癥小體在膿毒癥心肌功能障礙中的作用，可能為逆轉心肌功能、恢復全身組織血流灌注、開發(fā)新的治療靶點提供依據(jù)。

3.2NLRP3與膿毒癥肺損傷 膿毒癥患者的肺組織往往是最先受累的器官，進而誘發(fā)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征。有證據(jù)表明，NLRP3炎癥小體活化在ALI中發(fā)揮重要作用[39]。研究顯示，在LPS誘導的ALI中，NLRP3炎癥小體可促進caspase-1激活和IL-1β表達，其可能機制為褪黑素通過抑制細胞外組蛋白的釋放或直接阻斷組蛋白誘導NLRP3炎癥小體激活[40]。在膿毒癥誘發(fā)的急性呼吸窘迫綜合征中發(fā)現(xiàn)，支氣管上皮細胞NLRP3炎癥小體通路激活導致支氣管上皮細胞分泌過量黏蛋白和炎癥細胞因子，促進趨化因子和細胞黏附分子的表達[41]。Wang等[42]報道，二氫楊梅素可顯著抑制CLP膿毒癥模型小鼠的NLRP3炎癥小體活化，并抑制肺內細胞焦亡相關蛋白的表達，從而保護CLP誘導的ALI。Luo等[43]指出，氯化血紅素可抑制NLRP3炎癥小體的活化，主要機制是氯化血紅素能夠增加血紅素加氧酶-1蛋白的表達和活性，減少IL-1β和IL-18的分泌，減輕炎癥反應。但該研究并未指明血紅素加氧酶-1與NLRP3相互作用的機制，還有待進一步研究。綜上可見，通過抑制NLRP3炎癥小體的活化能有效緩解ALI，但如何直接阻斷ALI中NLRP3炎癥小體的激活目前仍不清楚。

3.3NLRP3與膿毒癥腎損傷 在膿毒癥，尤其是嚴重膿毒癥或膿毒性休克中，極易伴發(fā)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)。有報道稱，在最初的膿毒癥、缺血或腎毒性損傷后，腎內皮細胞和腎小管上皮細胞釋放炎癥細胞因子和趨化因子，導致白細胞募集和腎損傷放大，炎癥小體在這一過程中發(fā)揮重要作用[44]。研究顯示，在LPS誘導的膿毒癥模型小鼠中NLRP3、caspase-1的表達均顯著升高，而通過金絲桃素的處理可有效降低膿毒癥小鼠血清尿素氮和肌酐水平，進而保護腎功能，其機制可能是通過抑制Toll樣受體4和NLRP3信號通路，減少腫瘤壞死因子-α和IL-1β等炎癥因子的表達[45]。有研究指出，外源性一氧化碳能夠抑制NLRP3炎癥小體活性，顯著降低CLP小鼠模型中腫瘤壞死因子-α和IL-1β水平，從而預防膿毒癥引起的AKI[46]。Zhao等[47]研究表明，在CLP小鼠模型中，沉默信息調節(jié)因子3通過降低ROS的產生，抑制NRLP3炎癥小體，減輕氧化應激，下調IL-1β和IL-18表達，對腎臟線粒體損傷起保護作用。由此可知，炎癥反應、氧化應激和線粒體損傷均參與了膿毒癥引發(fā)的AKI，若能全面了解氧化應激、線粒體損傷與Toll樣受體4及NRLP3信號通路在AKI中的具體作用，聯(lián)合運用多靶點治療，可能為臨床治療膿毒癥及AKI提供新的可能。

綜上所述，在膿毒癥的多器官損傷中NRLP3炎癥小體信號通路扮演重要角色，但目前NRLP3炎癥小體在膿毒癥肝、腦、腸等器官損傷中的研究較少。因此，NRLP3炎癥小體在器官損傷中的作用值得進一步發(fā)掘。膿毒癥發(fā)病機制復雜，僅通過阻斷炎癥小體通路預防膿毒癥多器官損傷是否可靠仍需要更深入的研究。

4 小 結

炎癥小體在先天性免疫及免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。近年來NLRP3炎癥小體成為研究熱點，但關于NLRP3炎癥小體組裝及活化的機制仍有待進一步研究。研究人員針對NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18炎癥通路研發(fā)的一些特異性抑制劑，為膿毒癥和其他炎癥性疾病的治療提供了新的可能。但目前大多研究為動物實驗，未來能否在人類受益仍需要大樣本、多中心、前瞻性的臨床試驗?？傊瑢LRP3炎癥小體在膿毒癥中作用研究的不斷深入，可能為膿毒癥的發(fā)病機制及治療提供新的思路。