涂許許，趙小萱 綜述，馮曉玲 審校

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科二科，黑龍江哈爾濱 150040

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指妊娠20周之前的自然流產(chǎn)在同一對配偶中出現(xiàn)2次或2次以上[1]，發(fā)病率約為5%，病因包括解剖學(xué)異常、染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染、環(huán)境污染、自身免疫機(jī)制等，但仍有40%～50%的RSA病因不明，被稱為不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)[2]。RSA嚴(yán)重影響患病女性的身心健康，使患者及其家庭對生育喪失信心，同時也增加了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

微小RNA(miRNA)是一種由22個左右核苷酸構(gòu)成的非蛋白編碼短單鏈RNA，通過與靶向信使RNA(mRNA)的3′未翻譯區(qū)域(3′UTR)結(jié)合介導(dǎo)基因沉默[3]。miRNA的經(jīng)典產(chǎn)生途徑中，細(xì)胞核中DNA被轉(zhuǎn)錄為初級miRNA(pri-miRNA)，RNase Ⅲ內(nèi)切核酸酶Drosha對其切割和處理，并釋放60～100 nt的莖環(huán)中間體，稱為miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA還可通過非Drosha依賴的mirtron途徑產(chǎn)生。隨后Ran-GTP和輸出受體Exportin-5將pre-miRNA從細(xì)胞核主動轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中RNase Ⅲ內(nèi)切核酸酶Dicer對pre-miRNA進(jìn)行加工，使其成為miRNA雙鏈，包含了成熟miRNA(15～22 nt)。隨后鏈體解開，成熟miRNA通過Watson-Crick堿基配對機(jī)制與mRNA的3′UTR互補序列結(jié)合，組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。它們在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，包括發(fā)育、分化、凋亡和癌變[5]?；谕庵苎?、絨毛和蛻膜的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，RSA患者miRNA表達(dá)存在顯著差異[6]，但對于miRNA參與RSA發(fā)生的可能機(jī)制仍處于探索階段，以下將對此做一綜述。

1 miRNA介導(dǎo)血管生成參與RSA的發(fā)生

在較為穩(wěn)定的成年人血管網(wǎng)絡(luò)中，血管的新生是一個相對罕見的事件，但在特殊情況下，例如胚胎的著床和發(fā)育中，血管網(wǎng)絡(luò)可以擴(kuò)張和重塑以適應(yīng)不斷變化的條件，此過程被稱為血管生成，該過程包括3個階段：啟動、增殖-侵襲和成熟-分化[7]。子宮內(nèi)膜血管生成及受其影響的蛻膜化是胚胎植入成功及成功妊娠的前提。血管生成與胎盤正常發(fā)育也有密切聯(lián)系，胎盤是母體與胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的重要場所，胎盤的血管生成有助于建立豐富的血液循環(huán)及促進(jìn)其自身發(fā)育，使其更好地實現(xiàn)為胎兒提供營養(yǎng)及排出廢物的功能。大多數(shù)以流產(chǎn)為結(jié)局的妊娠被認(rèn)為是由于母體螺旋動脈缺乏生理變化而導(dǎo)致胎盤缺陷引起的，胎盤血管發(fā)育缺陷及血管內(nèi)皮功能受損可能導(dǎo)致RSA，血管生成水平受相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，miRNA可通過影響血管生成相關(guān)因子導(dǎo)致RSA的發(fā)生[8]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是關(guān)鍵的血管生成啟動因子，來源于絨毛滋養(yǎng)層和絨毛間質(zhì)巨噬細(xì)胞，在妊娠早期蛻膜細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)血管發(fā)育和維持穩(wěn)定。肖碧如等[9]發(fā)現(xiàn)，URSA患者絨毛中miR-29a水平與VEGF及微血管密度(MVD)呈負(fù)相關(guān)。還有一些研究也發(fā)現(xiàn)了RSA中miRNA與VEGF的關(guān)系，如URSA患者絨毛中高水平miR-200抑制VEGF，而低水平miR-155降低了血管新生因子sFlt-1的對抗，使血管生成狀態(tài)發(fā)生改變[10]；miR-150抑制VEGF表達(dá)[11]；RSA患者的miR-575水平與VEDF呈負(fù)相關(guān)[6]。

從妊娠早期開始，高度不成熟的血管內(nèi)皮即使不斷膨脹也無法完全滿足不斷生長的胚胎/胎兒的氧氣和營養(yǎng)需要，導(dǎo)致胚胎發(fā)育在低氧環(huán)境中進(jìn)行。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)對細(xì)胞氧濃度非常敏感，低氧濃度下積累的HIF-1蛋白與HIF-1二聚為有效的轉(zhuǎn)錄激活劑，與特定的DNA序列結(jié)合，在海綿狀滋養(yǎng)細(xì)胞的形成中起關(guān)鍵作用，調(diào)控胎盤的形成過程。miRNA對HIF有調(diào)控作用，URSA患者絨毛中miRNA-223-3p表達(dá)水平升高，而Rps6kb1mRNA、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達(dá)水平及MVD均降低[12]。miRNA-223-3p可能通過抑制Rps6kb1/HIF-1α信號通路而使HIF-1α和VEGF表達(dá)水平下降，影響血管生成過程，導(dǎo)致絨毛及胎盤血管發(fā)育不良，無法供應(yīng)胚胎及其附屬物的發(fā)育而導(dǎo)致流產(chǎn)。URSA女性絨毛中miR-210表達(dá)水平也被發(fā)現(xiàn)與HIF-1α、VEGF、MVD呈負(fù)相關(guān)[13]，提示miRNA作用于血管生成過程參與RSA的發(fā)生。

2 miRNA介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增殖參與RSA的發(fā)生

細(xì)胞凋亡是一種程序性調(diào)控的主動死亡過程，是妊娠期的正常生理過程，胎盤絨毛組織的細(xì)胞凋亡水平影響胎盤重塑，調(diào)節(jié)胎盤生長，而蛻膜化的內(nèi)膜是母胎界面的重要組成部分，參與構(gòu)成母體與胎兒物質(zhì)交換的通道，絨毛和蛻膜的凋亡水平異常都可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，miRNA通過對多個信號通路的作用影響細(xì)胞凋亡水平，導(dǎo)致RSA的發(fā)生[14]。

p53是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子，p53基因編碼在DNA修復(fù)中起重要作用的53kd磷酸蛋白，p53可以感應(yīng)DNA損傷并介導(dǎo)下游靶基因而實現(xiàn)調(diào)控功能，包括阻滯細(xì)胞周期、引起細(xì)胞衰老、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、修復(fù)DNA等[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，URSA女性絨毛組織中高表達(dá)的let-7f-5p可能通過調(diào)控p53信號通路中的MDM-X/MDM2/p53基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并參與URSA的發(fā)生[16]。ZHAO等[17]發(fā)現(xiàn)，URSA患者蛻膜中miRNA-365高表達(dá)，靶向細(xì)胞凋亡抑制因子SGK1下調(diào)MDM2及上調(diào)p53，造成G1期細(xì)胞周期停滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miRNA也可通過其他通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

此外，miRNA調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)(DDR)相關(guān)因子，從而影響細(xì)胞凋亡水平。DONG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者的絨毛中高表達(dá)的miR-520與多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)miR-520的體外人滋養(yǎng)細(xì)胞中觀察到PARP1水平降低和以DNA損傷為特點的細(xì)胞凋亡，而PARP1過表達(dá)可恢復(fù)凋亡水平。PARP1被認(rèn)為是DDR中的關(guān)鍵物質(zhì)，DDR是一種復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，響應(yīng)DNA損傷而被觸發(fā)，是保持基因組穩(wěn)定的基礎(chǔ)。另一項研究指出，miR-520誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路而實現(xiàn)[19]。

3 miRNA介導(dǎo)免疫耐受參與RSA的發(fā)生

妊娠是一種復(fù)雜的生理過程，胎兒攜帶父系基因及父系人類白細(xì)胞抗原(HLA)而不受到母體免疫系統(tǒng)的攻擊，是因為建立了良好的免疫耐受，RSA的發(fā)生與免疫異常相關(guān)[20]。

HLA-G是主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰb類抗原，組織表達(dá)分布集中，幾乎僅在母胎界面處絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，其與自然殺傷細(xì)胞受體結(jié)合并傳遞抑制信號,從而使胎兒免受母體淋巴細(xì)胞的免疫性攻擊,這些現(xiàn)象反映了HLA-G可使胎兒免遭母體免疫系統(tǒng)的排斥[21]。WANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，正常核型RSA絨毛中miR-133a表達(dá)水平顯著升高，可能通過結(jié)合HLA-G 3′UTR阻斷翻譯過程，從而降低HLA-G水平。

母胎微環(huán)境中Th1/Th2平衡在正常妊娠中必不可少，ZHAO等[23]發(fā)現(xiàn)，URSA患者蛻膜中低水平miR-146a-5p通過TLR/白細(xì)胞介素(IL)-1R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生過量的γ-干擾素(IFN-γ)，破壞Th1/Th2平衡，從而引發(fā)URSA。RSA患者miR-155表達(dá)水平降低，并與升高的TIM3(Th1的調(diào)節(jié)蛋白)、IL-4、IL-13及降低的IFN-γ水平具有相關(guān)性，提示miR-155可能作用于Th1/Th2平衡而參與RSA[24]。小鼠實驗證明了低水平miR-155將導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)不足而造成反復(fù)的胎兒丟失[25]。

4 影響miRNA表達(dá)的因素

4.1表觀遺傳修飾影響miRNA的表達(dá)水平 表觀遺傳學(xué)包括一系列不涉及基因組改變且易受環(huán)境影響的可遺傳性進(jìn)程，如DNA甲基化、非編碼RNA等。表觀遺傳學(xué)不僅影響細(xì)胞分化、發(fā)育等生理進(jìn)程，也被證實參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程[26]。

基因附近或內(nèi)部胞嘧啶-磷酸-鳥苷酸(CpG)甲基化水平的改變可引起基因表達(dá)水平的改變，在miRNA基因的表達(dá)中也不例外[27]。馬天仲等[28]發(fā)現(xiàn)，URSA患者絨毛CpG甲基化位點與健康女性存在差異。DNA甲基化水平影響miR-133a-3p表達(dá)，RSA患者中高水平miR-133a可能通過抑制細(xì)胞增殖而導(dǎo)致RSA的發(fā)生。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過直接作用于miRNA影響其表達(dá)水平。崔進(jìn)等[29]研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者胚胎中l(wèi)ncRNA H19水平升高。H19在胎盤轉(zhuǎn)錄物中的水平位于第2，是第一批被發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一。H19位點通過miR-675調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子2(IGF2)及其受體胰島素樣生長因子受體(IGF1R)的水平，IGF1R與IGF2共同影響絨毛的增殖發(fā)育過程，參與流產(chǎn)的發(fā)生。此外，H19還可影響miRNA-675的靶蛋白NOMO1，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，影響妊娠進(jìn)程。另一種lncRNA-miRNA的作用方式是“分子海綿”機(jī)制。“分子海綿”指lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)與miRNA結(jié)合，影響miRNA與編碼蛋白質(zhì)的mRNA結(jié)合，使miRNA表達(dá)水平下降。RSA患者中miR-34a表達(dá)水平升高而lncRNASNHG7呈現(xiàn)低水平，lncRNASNHG7 可與miR-34a結(jié)合，從而降低miR-34a對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用[30]。

除lncRNA外，環(huán)狀RNA(circRNA)也具有ceRNA的能力，QIAN等[31]發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛中有8種與健康妊娠期女性差異表達(dá)的circRNA，而已有證據(jù)顯示circRNA可調(diào)控miRNA，表明circRNA可能通過ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)miRNA，從而參與RSA的發(fā)生[32]。

4.2基因多態(tài)性影響miRNA表達(dá)水平 單核苷酸多態(tài)性或miRNA編碼區(qū)突變可能改變miRNA的表達(dá)及成熟情況。而這種現(xiàn)象在多個國家的RSA患者中被證實。miRNA-27a rs895819 A/G多態(tài)性中的GA+GG和G等位基因與埃及女性對RSA的易感性增加有關(guān)[33]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，韓國RSA女性中，miR-27a變體G等位基因風(fēng)險較低，而miR-449b變體G等位基因與高風(fēng)險相關(guān)[34]。另一項基于韓國女性的研究提示，miR-25 C>T和miR-222 G>T的組合與RSA的發(fā)生有關(guān)[35]。在針對中國女性的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-196a-2中的miR-196a-2 rs11614913 T/T可能通過破壞成熟miR-196a-3p的產(chǎn)生和增強(qiáng)二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)而導(dǎo)致RSA的遺傳易感性[36]。另一項研究證實，pri-miR-125a編碼區(qū)的A>G突變使?jié)h族RSA患者成熟miR-125a表達(dá)降低[37]。

5 miRNA檢驗技術(shù)的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

生物標(biāo)志物應(yīng)提供正常生理狀態(tài)或病理過程的關(guān)鍵信息，穩(wěn)定性好，容易通過非侵入性手段獲得，可通過簡單和廉價的方法檢測，且具有良好的特異度。miRNA基本符合這些標(biāo)準(zhǔn)，已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、病毒感染等疾病中存在變化，從而成為不同細(xì)胞事件和疾病診斷、預(yù)后和治療監(jiān)測的有效生物標(biāo)志物[38]。

準(zhǔn)確、可靠、靈敏的檢測方法是miRNA作為新一代生物標(biāo)志物的前提。目前，分析miRNA最常用的方法都存在其優(yōu)勢和一定的局限性。qRT-PCR靈敏度高，應(yīng)用廣泛，但缺乏多路復(fù)用和全基因組覆蓋，而且作為基于指數(shù)擴(kuò)增的方法，其中的偏差或錯誤也會指數(shù)級擴(kuò)增而影響實驗結(jié)果[39]。印跡雜交(Northern blotting)可用于檢測非擴(kuò)增的miRNA，但其要求原料量大、放射性強(qiáng)，且靈敏度低、耗時長、勞動強(qiáng)度大[40]。原位雜交可展示細(xì)胞或組織切片中的時空分布，但技術(shù)難度高、費時，且結(jié)果不具體[41]。微陣列技術(shù)提供全基因組覆蓋，但需要特定的探頭和專門的設(shè)備，數(shù)據(jù)規(guī)范化困難，缺乏不同平臺之間的重現(xiàn)性[42]。新一代測序提供全基因組覆蓋，識別新的miRNA和miRNA中的單核苷酸多態(tài)性，但其需要專門的設(shè)備、熟練的生物信息學(xué)家且數(shù)據(jù)分析復(fù)雜[43]。等溫指數(shù)放大靈敏度高，信號放大效率高，不需要熱循環(huán)設(shè)備，但需要包括切割酶在內(nèi)的多種酶，且探針設(shè)計復(fù)雜[44]。DNA四面體、DNA折紙、DNA器件和基元等DNA納米技術(shù)可直接檢測miRNA，從而消除任何基于擴(kuò)增的錯誤，彌補了qRT-PCR和Northern blotting中缺乏多路復(fù)用的不足，一些納米技術(shù)還可通過對設(shè)備、培訓(xùn)需求的降低從而降低成本和復(fù)雜性[38]。

一些miRNA可以在多種不同疾病中朝著相似的方向改變。例如，miR-21表達(dá)水平在一些疾病中發(fā)生改變，包括心血管疾病、炎癥，以及一些癌癥，包括乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌和皮膚癌[45-46]。因此，需要對循環(huán)的miRNA進(jìn)行全局篩選，以生成針對特定疾病或癌癥類型的miRNA特征，從而提高生物標(biāo)志物的特異度。年齡、性別、既往治療方案等因素也必須加以考慮。此外，數(shù)據(jù)再現(xiàn)性是檢測方法、分析方法及數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化可能產(chǎn)生的另一個主要問題[47-48]。在miRNA可以用作新一代人類疾病的生物標(biāo)志物之前，miRNA診斷的前景必須與仍然存在挑戰(zhàn)的現(xiàn)實相適應(yīng)。

6 小 結(jié)

綜上所述，miRNA可能通過參與對于妊娠極其重要的血管生成、細(xì)胞侵襲和凋亡、免疫平衡及耐受等過程，從而導(dǎo)致RSA的發(fā)生，miRNA受表觀遺傳、基因多態(tài)性等因素的影響而參與RSA進(jìn)程。盡管miRNA有希望被應(yīng)用于臨床，但仍存在許多問題?，F(xiàn)有研究大多數(shù)集中于miRNA在RSA中的差異表達(dá)，但標(biāo)本處理方式、孕周、標(biāo)本類型差異較大，還需要更多實驗來確定miRNA參與RSA診斷及治療的具體應(yīng)用方案。此外，RSA的發(fā)病機(jī)制及類型較為復(fù)雜，對RSA發(fā)生發(fā)展過程的進(jìn)一步研究對于miRNA的臨床應(yīng)用也具有重要意義。希望通過后續(xù)研究，可以將miRNA應(yīng)用于臨床，在RSA的治療方面發(fā)揮重要作用。