孟 霄，管 艷

濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濰坊 261053

呼吸系統(tǒng)疾病是影響公共健康的重大問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類健康。肺癌是臨床最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病率和病死率均居各類型腫瘤之首，受到廣泛關(guān)注[1]。此外，肺結(jié)核、慢性阻塞性肺病、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病給患者的家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，揭示呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生機(jī)制、尋找特異性生物標(biāo)志物以及發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)是改善現(xiàn)有診療狀況的重要策略。1995年，Wilkins 等首次提出蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的概念——由基因組、細(xì)胞或組織類型表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成分[2]。幾十年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，已成為基因組技術(shù)的重要補(bǔ)充，憑借獨(dú)特的技術(shù)方法和研究策略，為呼吸系統(tǒng)疾病病因、診斷、治療和耐藥性等方面的研究提供了更加全面的依據(jù)。本文簡(jiǎn)述了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，并對(duì)近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。

1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

1.1 雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE) 和熒光差異凝膠電泳(difference in gel electrophoresis，DIGE)2-DE 技術(shù)可根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分解為單個(gè)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的大規(guī)模分析[3]。2-DE 的缺點(diǎn)是重復(fù)性差及敏感度有限。2DDIGE 是2-DE 的一種進(jìn)化，用不同的熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品，在同一塊膠上共同電泳，通過(guò)掃描不同波長(zhǎng)的最終圖像，檢測(cè)凝膠上不同樣品的斑點(diǎn)，從而克服了2-DE 的缺點(diǎn)[4]。

近年來(lái)，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示肺腺癌的發(fā)病率極高，已成為最常見(jiàn)的肺癌病理類型[5]，為了尋找肺腺癌的生物標(biāo)志物，Liu 等[6]分離了A549 和16HBE 的細(xì)胞線粒體，提取線粒體總蛋白并進(jìn)行2-DE，采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)AAA-TOB3 在肺腺癌線粒體中顯著上調(diào)，該研究提示AAA-TOB3 表達(dá)增高可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Li 等[7]使用2D-DIGE 技術(shù)分析肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)PRDX6型蛋白表達(dá)與腫瘤反應(yīng)密切相關(guān)，可作為化療不良反應(yīng)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。Ciereszko 等[8]采用2DDIGE 技術(shù)對(duì)肺癌患者化療前后的血液樣本進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與肺癌組的轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能反映了化療誘導(dǎo)貧血后鐵代謝的紊亂，此外腺癌(adenocarcinoma，ADC) 患者與鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)患者的血漿蛋白差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一發(fā)現(xiàn)提示蛋白質(zhì)組學(xué)可用于區(qū)分ADC 與SCC。

1.2 數(shù)據(jù)非依賴性采集定量技術(shù)(data independent acquisition，DIA)該技術(shù)是將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，高速、循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中所有離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測(cè)，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得離子的全部碎片信息[9]。連續(xù)窗口全理論碎片離子采集質(zhì)譜(sequential window acquisition of all theoretical fragment ions mass spectra，SWATHMS)是DIA 的一種特殊變體，該方法在快速掃描混合質(zhì)譜儀上進(jìn)行測(cè)量，通常采用四極桿作為第一質(zhì)量分析儀，TOF 或Orbitrap 作為第二質(zhì)量分析儀。在SWATH-MS 模式下，先記錄一個(gè)前驅(qū)體離子光譜，然后記錄具有寬前驅(qū)體隔離窗口的碎片離子光譜，通過(guò)在一個(gè)確定的質(zhì)量范圍內(nèi)重復(fù)循環(huán)連續(xù)前驅(qū)體隔離窗，記錄一個(gè)全面的數(shù)據(jù)集。與經(jīng)典的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring，PRM)相比，SWATHMS 對(duì)肽的定量敏感度低3～ 10 倍，其優(yōu)勢(shì)是支持覆蓋1 000 種蛋白質(zhì)的多肽的定量分析，將深度覆蓋能力與精準(zhǔn)定量分析相結(jié)合，適合復(fù)雜樣品的大規(guī)模定量[10]。

Ortea 等[11]采用DIA 技術(shù)對(duì)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，證實(shí)了CO4A、HPT 和GTSP1是潛在的肺癌生物標(biāo)志物。Yang 等[12]從健康對(duì)照者、2型糖尿病患者、肺腺癌患者和2型糖尿病合并肺腺癌患者中共采集20 份樣本進(jìn)行SWATHMS 分析，用PRM-MS 分析和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)妊娠區(qū)帶蛋白(pregnancy zone protein，PZP)可作為一種新的血清生物標(biāo)志物用于2型糖尿病合并肺腺癌的輔助診斷和早期治療。Ma 等[13]對(duì)肺癌患者和健康人群的呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC) 樣本進(jìn)行DIA 分析，共鑒定出1 151個(gè)蛋白質(zhì)，與健康對(duì)照組相比，肺癌組有10 種蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，其中S100A11、ANXA1、ENO1、和FABP5 可能是肺癌的新型生物標(biāo)志物。Geary 等[14]在肺腫瘤手術(shù)過(guò)程中采集血液，用以鑒定從腫瘤流至肺靜脈的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與健康肺靜脈血相比，腫瘤引流靜脈血中40 種蛋白質(zhì)的豐度增加，使用SWATHMS 對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)AQR、C9、EPPK1、F13B、GPI、GPX3、LAMC1、LDHA、MTA2、NAMPT、P4HB 和SCP2 均與肺腺癌有關(guān)。以上研究表明DIA 技術(shù)有利于肺癌的早期篩查和臨床診斷，可作為發(fā)現(xiàn)肺癌生物標(biāo)志物的重要工具。

1.3 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(label-free quantitative proteomics，LFQP)LFQP 技術(shù)是對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)比較肽段的質(zhì)譜信號(hào)或肽段數(shù)量完成相應(yīng)蛋白質(zhì)的定量。該技術(shù)對(duì)質(zhì)譜分析高度敏感，不容易出錯(cuò)，因此能夠從體液(血液、血漿、唾液和尿液)、細(xì)胞系和組織等復(fù)雜樣本中鑒定數(shù)千種蛋白質(zhì)，適用于生物樣本的大規(guī)模分析，并且具有成本低、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛認(rèn)可[15]。

結(jié)核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion，TBPE)和惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)在滲出性胸腔積液中較為常見(jiàn)，二者的鑒別診斷在臨床上備受關(guān)注[16]，LFQP 技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)二者潛在的鑒別診斷標(biāo)志物。Pan 等[17]對(duì)TBPE 和MPE 進(jìn)行非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用Western blot 和ELISA 對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)AGP1、ORM2、C9 和SERPING1 這4 種蛋白可能是TBPE 與MPE的鑒別診斷標(biāo)志物。此外，LFQP 技術(shù)也為結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)制的研究和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了重要數(shù)據(jù)。Li 等[18]采用LFQP 技術(shù)鑒定兒童活動(dòng)性肺結(jié)核(active tuberculosis，ATB)與潛伏結(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI) 的血漿蛋白差異，選擇4 種蛋白用qPCR 和Western blot 進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與LTBI 相比，ATB 組中XRCC4、PCF11 和SEMA4A 的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。

1.4 同位素親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope-coded affinity tags，ICAT)ICAT 技術(shù)是用帶有生物素半分子的同位素標(biāo)簽標(biāo)記樣品中蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基，標(biāo)記后的蛋白樣品經(jīng)過(guò)酶解成為肽段后，經(jīng)過(guò)親和層析，進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定[19]。該方法只標(biāo)記蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基，而生物素幫助捕獲含有半胱氨酸的多肽，因此大大降低了樣品的復(fù)雜性，從而簡(jiǎn)化了之后的質(zhì)譜分析過(guò)程。ICAT 的主要缺點(diǎn)是連接區(qū)中的氘原子改變反相色譜過(guò)程中輕肽和重肽的洗脫時(shí)間，導(dǎo)致了肽的鑒定困難，而ICAT 的新變種——可裂解同位素親和標(biāo)記(cleavable isotope-coded affinity tag，c-ICAT)，用13C、13C9或12C9來(lái)代替氘原子，解決了這一問(wèn)題[15]。

非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%。由于大多數(shù)NSCLC 患者在就診時(shí)已屬晚期，故總體的治療效果不理想[20]。利用ICAT 技術(shù)可發(fā)現(xiàn)用于預(yù)測(cè)NSCLC 藥物療效的新型生物標(biāo)志物，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療途徑有重要作用。Qu 等[21]使用ICAT 和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)比較了NSCLC 細(xì)胞系H460 及其吉西他濱耐藥亞系H460/GEM 的蛋白質(zhì)組特征，并用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示66.1%的NSCLC 腫瘤表達(dá)抗藥蛋白SORCIN，該蛋白的過(guò)度表達(dá)與吉西他濱耐藥和預(yù)后不良有關(guān)。

1.5 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification，ITRAQ)和串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法(tandem mass tag，TMT)ITRAQ 技術(shù)是由AB SCIEX 公司開(kāi)發(fā)的基于其公司生產(chǎn)的質(zhì)譜的體外同位素標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)可分析多達(dá)4個(gè)(iTRAQ 4-plex)或8個(gè)(iTRAQ 8-plex)不同的生物樣本，與無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)相比，增加了統(tǒng)計(jì)相關(guān)性和結(jié)果準(zhǔn)確性[22]。TMT 是用等壓標(biāo)簽標(biāo)記不同樣本中的多肽，將其混合后以反相高效液相色譜儀結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。其流程包括蛋白質(zhì)消化、TMT 反應(yīng)、樣品純化、分離、高效液相色譜-質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)分析[23]。TMT 試劑最初能夠同時(shí)定量6個(gè)樣本，之后進(jìn)一步擴(kuò)展到10～ 11個(gè)樣本，最近開(kāi)發(fā)的16-plex TMT pro(TMT16)試劑將通道擴(kuò)展到了16個(gè)，實(shí)現(xiàn)了一次性對(duì)16個(gè)樣品的量化，在多達(dá)16個(gè)不同的生物樣本中，可對(duì)超過(guò)10 000個(gè)蛋白質(zhì)和翻譯后修飾同時(shí)進(jìn)行定量分析，為基礎(chǔ)和臨床研究提供了有力工具[24]。

為尋找新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)潛在的治療靶點(diǎn)，Shu 等[25]采用22 份新冠肺炎患者感染高峰期血漿和8 份健康人血漿，經(jīng)TMT 標(biāo)記定量分析、基因本體論(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白高度富集于炎癥、免疫細(xì)胞遷移/脫顆粒、補(bǔ)體系統(tǒng)凝血級(jí)聯(lián)和能量代謝過(guò)程，最終確定了11個(gè)宿主蛋白和1 組生物標(biāo)志物組合。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全球病死率和發(fā)病率較高的疾病之一，嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量，為全球第四大死亡原因[26]，TMT 為探究COPD 的生物標(biāo)志物提供了技術(shù)方法。Sun 等[27]采集19例COPD 患者和19例對(duì)照者的EBC 樣本進(jìn)行TMT 分析，共鑒定出257 種蛋白質(zhì)，與對(duì)照組相比，COPD 患者有24 種蛋白表達(dá)存在差異，經(jīng)過(guò)GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白可能是COPD 中EBC 的新型生物標(biāo)志物。此外，Zhang 等[28]收集了1例接受HER2 定向治療和化療并存活了7年的轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者的腫瘤組織，采用Super-SILAC 和TMT10plex 定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)不同轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，經(jīng)靶向多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)cdk12-g879v 突變可能與肺轉(zhuǎn)移部位的化療易感性有關(guān)。為了研究雷公藤甲素(triptolide，TP)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，Li 等[29]使用iTRAQ 技術(shù)分析了TP 處理NSCLC 的A549 細(xì)胞后蛋白譜的變化，經(jīng)GO 與KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)TP 對(duì)A549 肺腺癌細(xì)胞有抗腫瘤作用。該發(fā)現(xiàn)揭示了可作為肺癌治療潛在靶點(diǎn)的候選蛋白。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)SILAC技術(shù)是高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)的有力手段，使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸對(duì)整個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行代謝編碼，從而實(shí)現(xiàn)高精度的蛋白質(zhì)定量[30]。該技術(shù)將同位素標(biāo)記的氨基酸摻入細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)中——輕型(1H、12C、14N)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成可以與重型(2H、13C、15N)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行比較[31]，其主要優(yōu)點(diǎn)是能夠在單個(gè)儀器運(yùn)行中同時(shí)檢測(cè)同位素標(biāo)記的肽，從而保證大量肽的相對(duì)定量[32]。

SILAC 技術(shù)已被用于研發(fā)肺癌的新療法。Duan 等[33]利用SILAC 定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中鑒定出82個(gè)去整合素金屬蛋白酶12(a disintegrin and metalloproteinase domain 12，ADAM12S) 調(diào)控蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因操作和體外實(shí)驗(yàn)，揭示了ADAM12S 可促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，為小細(xì)胞肺癌的治療干預(yù)研究提供了有價(jià)值的信息。Wang 等[34]采用SILAC 技術(shù)對(duì)肺癌細(xì)胞中6-O-angeloylenolin(6-OA) 調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)6-OA 通過(guò)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS) 發(fā)揮抗癌作用，提示6-OA 可用于肺癌的治療。Wang 等[35]采用SILAC 技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)異去氧苦地膽素(isodeoxyelephantopin，ESI) 可以通過(guò)Nrf2-p62-Keap1 反饋環(huán)激活保護(hù)性自噬以維持細(xì)胞存活，靶向此調(diào)控軸結(jié)合ESI 治療可作為肺癌治療的新策略。

2 定性蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

鳥槍法(shotgun)是一種高通量的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，其原理是將蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段，引入質(zhì)譜儀對(duì)這些肽進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)集生成后，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論肽進(jìn)行匹配[36]。該技術(shù)的特色是基于肽段水平而非完整的蛋白質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、快速、高通量的蛋白組學(xué)分析。

鳥槍法已被用于研究多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和診斷方法。Rahman 等[37]采用鳥槍法在肺癌患者的氣道上皮細(xì)胞中鑒定出2 869個(gè)蛋白，選擇其中312個(gè)顯著改變的蛋白進(jìn)行WebGestalt途徑分析，在這些蛋白質(zhì)中，有48個(gè)代謝酶在支氣管上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)中表現(xiàn)為失調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)為研究肺癌的分子發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。Heyder等[38]采用鳥槍法對(duì)慢性肺部疾病患者支氣管肺泡灌洗液和血清中的Fc 多糖進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IgG4 Fc 段半乳糖基化與慢性肺部疾病有關(guān)，該發(fā)現(xiàn)有助于解釋潛在肺部疾病的病因。Rivera 等[39]采集了10 份用于診斷COVID-19 的口咽拭子樣本，其中5 份為核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本，5 份為核酸檢測(cè)陰性標(biāo)本，用鳥槍法鑒定這些樣本中的蛋白質(zhì)，所有的陽(yáng)性標(biāo)本中均檢測(cè)到SARS-CoV-2 核蛋白的特異性肽段。

3 結(jié)語(yǔ)

迄今為止，蛋白質(zhì)組學(xué)的各種分析技術(shù)不斷完善與革新，其研究的廣度和深度也在迅速發(fā)展，使我們對(duì)于蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)和功能有了更加深刻的理解。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，已成功篩選出很多較為特異的新型潛在生物標(biāo)志物，為肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的早期診斷和治療提供了可能的靶點(diǎn)。將來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)憑借已取得的重大進(jìn)展及其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，會(huì)在探索呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制、診斷、尋找有效治療靶點(diǎn)等方面發(fā)揮更大作用。