石子林　李軍喬　王雅瓊　金占林

摘要： 使用響應(yīng)面法優(yōu)化密花香薷總皂苷提取工藝并探究其抗氧化活性及抑菌活性。以密花香薷總皂苷提取率為評估指標(biāo)，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度為因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化密花香薷總皂苷提取工藝;采用2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法測定密花香薷總皂苷的抗氧化活性;并使用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌進行抑菌試驗測定其抑菌活性。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：液料比20∶1 （體積質(zhì)量比），乙醇體積分?jǐn)?shù)62%，提取時間125 min，提取溫度69 ℃，在此提取工藝下，提取率為1.19%。密花香薷總皂苷對ABTS自由基、DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）分別為0.74 mg/ml、0.56 mg/ml。密花香薷總皂苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制作用，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用強于對酵母菌的抑制作用。說明，采用響應(yīng)面法得到的密花香薷總皂苷的最佳提取工藝簡便可行，且提取的總皂苷具有較好的抗氧化活性及抑菌活性。

關(guān)鍵詞： 密花香薷;皂苷;響應(yīng)面法;提取工藝;抗氧化活性;抑菌活性

中圖分類號： R284.2 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0185-07

Optimization on the extraction process of total saponins from the Elsholtzia densa Benth. and its biological activity

SHI Zi-lin1，2，3， LI Jun-qiao1，2，3， WANG Ya-qiong1，2，3， JIN Zhan-lin1，2，3

（1.Tibetan Plateau Juema Research Centre， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China;2.Qinghai Provincial Key Laboratory of Highvalue Utilization of Characteristic Economic Plants， Xining 810000， China;3.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China）

Abstract： Response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Elsholtzia densa Benth. and explore its antioxidant and antibacterial activities. Taking liquid-solid ratio， ethanol concentration， extraction time and extraction temperature as factors， extraction rate of total saponins from Elsholtzia densa Benth. as evaluation index， the extraction process was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test. The antioxidant activity of total saponins was determined by 2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radicals scavenging methods. In addition， the antibacterial activity was tested by Staphylococcus aureus， Escherichia coli and yeast. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： liquid-solid ratio 20 ml/g， ethanol concentration 62%， extraction time 125 min， extraction temperature 69 ℃. Under the above conditions， the yield was 1.19%. The half-inhibiting concentrations of ABTS and DPPH for the total saponins were 0.74 mg/ml and 0.56 mg/ml， respectively. The total saponins from Elsholtzia densa Benth. had inhibitory effects on， and yeast. Moreover， the inhibitory effect on? Staphylococcus aureus and Escherichia coli was stronger at the concentration of 1.0 mg/ml. In conclusion， the optimum extraction process of total saponins from Elsholtzia densa Benth. by response surface methodology is convenient and feasible， and the total saponins have good antioxidant and antibacterial activitive.

Key words： Elsholtzia densa Benth.;saponins;response surface methodology;extraction process;antioxidant activity;antibacterial activity

密花香薷 （Elsholtzia densa Benth.）為唇形科 （Labiatae）香薷屬 （Elsholtzia） 植物[1]，一年生草本，廣泛分布于青海、四川、甘肅、西藏等海拔2 800～4 100 m的高山、林緣、草甸等環(huán)境中[2]。密花香薷是中國的一種重要的野生草本蜜源植物、芳香植物，具有較高的藥用價值[3]，可全草入藥，具有治療夏季感冒、發(fā)熱無汗等功效[4]。

密花香薷在田間分布廣泛且常被當(dāng)做惡性雜草，綜合開發(fā)利用密花香薷，既可使其變廢為寶，又大大減少除草劑使用，保護環(huán)境。包錦淵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，密花香薷體內(nèi)含有皂苷、黃酮、多糖、有機酸、蒽醌等活性成分。密花香薷具有較為發(fā)達的蜜腺[6]，目前對于其揮發(fā)性成分的研究較為充分，Zhou等[7]用水蒸氣蒸餾法提取密花香薷中的揮發(fā)油成分并進行GC-MS分析，結(jié)果表明密花香薷揮發(fā)油中主要成分有4-吡啶醇以及麝香草酚，且密花香薷揮發(fā)油具有潛在的殺螨活性。石子林等[8]用水提醇沉法對密花香薷多糖進行提取，優(yōu)化工藝后最佳工藝下密花香薷多糖提取率為1.88%。目前尚未發(fā)現(xiàn)對密花香薷總皂苷的研究。

植物皂苷由糖和皂苷元組成，是一種天然的活性物質(zhì)，其具有抗菌[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤、抗疲勞[11]以及降血糖[12]等多種作用。王曉娟等[13]對土家族藥物扣子七中的三萜皂苷進行研究，得出其抗腫瘤活性與齊墩果烷型皂苷密切相關(guān)。本試驗采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法對密花香薷總皂苷進行提取工藝優(yōu)化，并對所提取的總皂苷進行抗氧化以及抗菌活性研究，為今后密花香薷總皂苷的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

密花香薷于2019年6月采自青海省西寧市湟源縣牧場村蕨麻種植基地，經(jīng)青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院李軍喬教授鑒定為唇形科香薷屬植物密花香薷。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌均購自上海魯威科技有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

儀表恒溫水浴鍋（龍口市電爐制造廠產(chǎn)品）、EPED-20TH實驗室級超純水器（南京易普易達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品）、UV-5500型紫外-可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司產(chǎn)品）

1.3 材料預(yù)處理

將采摘的密花香薷全草自然風(fēng)干至恒質(zhì)量，粉碎，過60目篩，采用液料比10∶1（體積質(zhì)量比）的石油醚回流脫脂，抽濾后取濾渣，風(fēng)干，備用。

1.4 試驗方法

稱取1 g密花香薷粉末，以一定濃度的乙醇做溶劑，按一定比例的液料比，在一定溫度下提取一定時間后，抽濾，取濾液，旋干濾液后，用10.0 ml的乙醇定容，取0.2 ml定容后的濾液，在80 ℃水浴下?lián)]發(fā)掉溶劑，加0.2 ml 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加0.8 ml高氯酸溶液，70 ℃水浴10 min后加冰醋酸定容至10.0 ml，之后于550 nm波長下測其吸光度。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取5 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于50.0 ml乙醇中得0.1 mg/ml 的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管中，80 ℃水浴揮發(fā)掉試管內(nèi)溶劑，按方法1.4中的方法顯色后測其吸光度（A）。以純水為空白對照，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，回歸方程為：Y=34.200 0x+0.060 8 （R2=0.999 5），在0.002 mg/ml至0.010 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.6 密花香薷總皂苷得率的測定

密花香薷總皂苷得率=（密花香薷總皂苷質(zhì)量/密花香薷粉末質(zhì)量）×100%

1.7 密花香薷總皂苷提取單因素試驗

按方法1.4的試驗方法，研究液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間以及提取溫度4個因素對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.1 液料比 稱取2 g密花香薷粉末，固定乙醇濃度70%，提取時間90 min，溫度70 ℃，考察不同液料比（體積質(zhì)量比）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質(zhì)量比），提取時間90 min，提取溫度70 ℃，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.3 提取時間 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質(zhì)量比），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70 ℃，考察不同提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.4 提取溫度 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質(zhì)量比），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間120 min，考察不同提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.8 密花香薷總皂苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為自變量，以密花香薷總皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計原理，采取3因素3水平試驗來選取最佳提取工藝。試驗因素水平見表1。

1.9 密花香薷總皂苷抗氧化性試驗

1.9.1 ABTS自由基清除試驗 將最佳條件下提取的密花香薷總皂苷配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml的總皂苷溶液。將2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液與7.00 mmol/L ABTS溶液等體積混合后避光靜置過夜，再用純水將其稀釋成λ734 =0.70±0.02，得到ABTS·+工作液。精密吸取各質(zhì)量濃度的密花香薷總皂苷溶液0.1 ml于試管中，滴加3.9 ml工作液，搖勻，避光靜置反應(yīng)30 min后于734 nm波長處測其吸光度，得樣品組的清除率（A1）?？瞻捉MA0用0.1 ml超純水代替總皂苷溶液，對照組A2則用3.9 ml無水乙醇代替ABTS·+工作液。以VC為陽性對照，平行試驗3次，取平均值。清除率公式如下：

清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

1.9.2 DPPH自由基清除試驗 將最佳條件下提取的密花香薷總皂苷配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml的總皂苷溶液。配制40 μg/ml的DPPH溶液，分別精密吸取各質(zhì)量濃度的密花香薷總皂苷溶液0.1 ml于1.0 ml試管中，滴加0.1 ml DPPH溶液，作為樣品組A1，空白組A0用0.1 ml超純水代替總皂苷溶液，對照組A2則用0.1 ml無水乙醇代替DPPH溶液。以VC為陽性對照，平行試驗3次，取平均值。

1.10 密花香薷總皂苷抑菌活性試驗

1.10.1 培養(yǎng)基的制備 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨6 g/L、氯化鈉6 g/L、牛肉膏3 g/L，再用2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.1，用超純水定容至500 ml，在125 ℃下滅菌30 min。向LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂制成LB固體培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基：稱100 g去皮后的土豆，切碎后加水500 ml，放入鍋中煮沸25 min，用紗布趁熱將其過濾，棄除濾渣，將濾液補水至500 ml，加10 g葡萄糖，在115 ℃下滅菌30 min。

1.10.2 抑菌活性試驗 以金黃色葡萄球菌、酵母菌、大腸桿菌3種菌為指示菌，將活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種接入到LB液體培養(yǎng)基中，于35 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將活化后的酵母菌菌種接種到PDB培養(yǎng)基中，于30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用移液槍分別吸取0.2 ml細菌含量為1.0×107CFU/ml的2種細菌菌懸液于LB固體培養(yǎng)基中，吸取0.2 ml細菌含量為1.0×107CFU/ml的酵母菌菌懸液于PDB培養(yǎng)基中，涂抹均勻后打孔，吸取0.1 ml質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的密花香薷總皂苷提取液于孔中，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測定其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 密花香薷總皂苷提取工藝單因素試驗

2.1.1 液料比 如圖1A所示，密花香薷總皂苷提取率隨著液料比的增大呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，這可能是因為液料比過高，旋蒸時間過長，導(dǎo)致總皂苷有所損失。當(dāng)液料比為20∶1（體積質(zhì)量比）時，提取率達到最大值，此時的提取率為0.87%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳液料比為20∶1（體積質(zhì)量比）。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 如圖1B所示，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，提取率達到最大值，此時的提取率為0.95%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.3 提取時間 如圖1C所示，密花香薷總皂苷提取率隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，可能是因為提取時間過長，導(dǎo)致提取出的總皂苷又被水解。當(dāng)提取時間為120 min時，提取率達到最大值，此時的提取率為1.17%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳提取時間為120 min。

2.1.4 提取溫度 如圖1D所示，密花香薷總皂苷提取率隨著提取溫度的增大呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，這可能是由于溫度過高，導(dǎo)致提取出的總皂苷被分解。當(dāng)提取溫度為70 ℃時，提取率達到最大值，此時的提取率為1.19%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳提取溫度為70 ℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化密花香薷總皂苷提取工藝試驗

選取上述單因素試驗中對密花香薷總皂苷提取率影響較大的3個因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、提取溫度（C），以密花香薷總皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計原理，進行試驗設(shè)計，試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示，利用 Design-Expert8.0.6軟件對表2結(jié)果進行回歸統(tǒng)計分析，所得回歸方程如下：

Y=-10.389 800+0.175 675A+0.048 608B+0.091 100C+0.000 008AB-0.000 050AC-0.000 067BC-0.001 403A2-0.000 178B2-0.000 578C2

為了檢驗此回歸方程的可靠性，進一步分析各因素對密花香薷總皂苷提取率的影響，對此回歸方程進行方差分析。由表3可知，該模型F=40.305 5，P<0.01（差異極顯著），表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;失擬項的P=0.571 3>0.05（差異不顯著），表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義;上述模型的P值及失擬項的P值說明該方程對試驗結(jié)果具有良好的擬合性，試驗誤差比較小。該方程的R2=0.981 1，說明此模型對本實驗結(jié)果具有較好的擬合性;R2adj=0.956 7說明該模型可解釋95.67%的響應(yīng)值變化。

模型中的一次項A和B，二次項A2、B2和C2均小于0.05，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間以及乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度的二次項對總皂苷提取率具有顯著影響;而提取溫度以及三因素的交互項顯著性較差，表明該試驗因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。由表3的F值大小可推斷三因素對密花香薷總皂苷提取率影響的強弱，F(xiàn)值越大，說明影響越強，越小則越弱。因此，各因素對密花香薷總皂苷提取率影響的強弱為：提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度。

為了更直觀地看出各因素對密花香薷總皂苷提取率的影響，繪制了三維響應(yīng)面圖，響應(yīng)面圖坡度越陡峭，則說明試驗因素對密花香薷總皂苷提取率的影響越大。

圖2顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～62%，提取時間在90～125 min時，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇濃度及提取時間的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且提取時間曲面較乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面更為陡峭，說明提取時間較乙醇體積分?jǐn)?shù)對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

圖3顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～62%，提取溫度在60～70 ℃時，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇濃度及提取溫度的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面較提取溫度曲面更為陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)較提取溫度對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

圖4顯示，當(dāng)提取時間在90～125 min，提取溫度在60～70 ℃時，密花香薷總皂苷提取率隨提取時間及提取溫度的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且提取時間曲面較提取溫度曲面更為陡峭，說明提取時間較提取溫度對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

綜上所述，三因素對密花香薷總皂苷提取率的影響大小為：提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度，與表3結(jié)論一致。

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化之后，得到的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)：61.77%、提取時間125.02 min、提取溫度68.99 ℃、液料比20∶1（體積質(zhì)量比），此時密花香薷總皂苷提取率為1.22%。考慮到實際操作的可行性，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)62.00%、提取時間125.00 min、提取溫度69.00 ℃、液料比20∶1（體積質(zhì)量比），平行試驗3次，此時密花香薷總皂苷提取率為1.19%。與回歸方程的預(yù)測值1.21%相近，進一步證明了該回歸方程模型的可行性以及該提取工藝的穩(wěn)定性。

2.3 密花香薷總皂苷抗氧化性

2.3.1 ABTS自由基清除率 由圖5可知，密花香薷總皂苷具有清除ABTS自由基的能力，且清除率隨著密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度達到1.20 mg/ml時，ABTS自由基清除率達到71.54%，之后隨著密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度增加，清除率趨于平緩。此時，密花香薷總皂苷對ABTS自由基的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為0.74 mg/ml。

2.3.2 DPPH自由基清除率 由圖6可知，密花香薷總皂苷具有清除DPPH自由基的能力，且清除率隨著密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度達到1.0 mg/ml時，DPPH自由基清除率達61.25%，之后隨著密花香薷總皂苷質(zhì)量濃度增加，清除率趨于平緩。此時，密花香薷總皂苷對DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為0.56 mg/ml。

2.4 密花香薷總皂苷抑菌性

密花香薷總皂苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈直徑大小分別為2.74 cm、2.97 cm、1.27 cm，說明質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml 的密花香薷總皂苷溶液對細菌以及真菌均有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

本試驗采用乙醇回流法對密花香薷總皂苷進行提取，用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法對提取工藝進行了優(yōu)化，所得的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)62.00%、提取時間125.00 min、提取溫度69.00 ℃、液料比20∶1（體積質(zhì)量比），此時的提取率為1.19%。試驗的實測值與模型的預(yù)測值差異較小，說明該方法具有較好的穩(wěn)定性;采用ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法對密花香薷總皂苷的抗氧化活性進行評估，以維生素C為對照，結(jié)果表明密花香薷總皂苷具有較好的抗氧化活性，測定皂苷類物質(zhì)的抗氧化活性方法較多，本試驗選擇的DPPH、ABTS自由基清除法操作較為簡便，所得數(shù)據(jù)較為直觀因而在測定活性成分的抗氧化性上被廣泛采用;以細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）和真菌（酵母菌）對密花香薷總皂苷的提取液進行了抑菌活性測定，結(jié)果表明密花香薷總皂苷提取液對3種菌均有較明顯的抑菌活性。

皂苷類物質(zhì)具有多種藥理活性，而目前對密花香薷總皂苷的研究較少，僅對密花香薷總皂苷進行了定性研究，本研究對青海西寧地區(qū)的密花香薷進行定量研究，并初步測定了所提取總皂苷的抗氧化活性及抑菌活性，為之后對密花香薷總皂苷的深入研究提供了試驗依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-05-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31660425）;2019年度青海省“高端創(chuàng)新人才千人計劃培養(yǎng)拔尖人才”項目;青海省自然科學(xué)基金項目（2019-ZJ-978Q）;青海民族大學(xué)2019年度校級理工自然科學(xué)項目 （2019XJG08）

作者簡介：石子林（1996-），男，湖北黃石人，碩士研究生，研究方向為藥用植物開發(fā)與利用。（E-mail）2424632465@qq.com

通訊作者：李軍喬，（E-mail）ljqlily2002@126.com