高營　林云　袁星星　薛晨晨　陳新　朱月林

摘要： GASA（Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis）蛋白是一類受赤霉素調(diào)控的小分子蛋白質(zhì)，參與植物生長發(fā)育的多條途徑。本研究在蠶豆（Vicia faba）中同源克隆了VfGASA1基因，該基因的開放閱讀框全長為363 bp，編碼1個(gè)包含120個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，VfGASA1在蠶豆葉片和嫩莢中高表達(dá)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，VfGASA1是一個(gè)定位于質(zhì)外體的分泌蛋白。異源過表達(dá)VfGASA1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥開花延遲、蓮座葉數(shù)量增多，外施赤霉素能夠恢復(fù)這一現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中FT基因顯著下調(diào)，而DELLA基因中的GAI基因顯著上調(diào)，說明VfGASA1可能是通過間接抑制DELLA蛋白的表達(dá)從而調(diào)控植物開花。本研究結(jié)果為蠶豆的開花調(diào)控育種提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 蠶豆;VfGASA1;擬南芥;開花時(shí)間;赤霉素

中圖分類號(hào)： S643.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）01-0044-09

Heterologous overexpression of Vicia faba VfGASA1 gene delays flowering in transgenic Arabidopsis

GAO Ying1， 2， LIN Yun2， YUAN Xing-xing2， XUE Chen-chen2， CHEN Xin2， ZHU Yue-lin1

（1.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;2.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis （GASA） protein is a kind of protein with small molecular weight regulated by gibberellin and participates in various pathways of plant growth and development. In this study， the GASA gene VfGASA1 in faba bean （Vicia faba） was got by homologous cloning. The open reading frame（ORF） of VfGASA1 was 363 bp in length and encoded a protein containing 120 amino acid residues. VfGASA1 was highly expressed in the leaves and capsules of faba beans， and subcellular localization showed that VfGASA1 was a secretory protein located in the apoplast. Heterologous overexpression of VfGASA1 in Arabidopsis could delay flowering and increase the number of rosette leaves， while the phenomenon could be recovered by the application of exogenous gibberellin. Results of real-time PCR （RT-PCR） showed that the expressional level of ‘florigen gene （FT） was significantly down-regulated in transgenic Arabidopsis while GAI （one of DELLA genes） was significantly up-regulated. Therefore， VfGASA1 might regulate the flowering of plants by indirect inhibiting the expression of DELLA genes. This study provides theoretic basis for breeding programs targeted on the flowering control of faba bean.

Key words： Vicia faba;VfGASA1;Arabidopsis;flowering time;gibberellin

開花是指被子植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，是植物生命史的重要相變，也是農(nóng)作物的重要農(nóng)藝性狀之一;開花時(shí)間受到不同信號(hào)的影響，在擬南芥中有光周期、自主途徑、春化途徑及赤霉素（GA）信號(hào)途徑等[1-4]。一些關(guān)鍵的調(diào)控因子負(fù)責(zé)整合這些信號(hào)途徑，包括FT、SOC1以及LFY的表達(dá)[5-7]，這些調(diào)控因子激活LFY、AP1和FUL在花序分生組織側(cè)部的表達(dá)，誘導(dǎo)花原基的產(chǎn)生[8]。其中，F(xiàn)T是開花調(diào)控的整合因子和決定基因，各信號(hào)途徑最終通過影響其表達(dá)水平而誘導(dǎo)開花。FT基因的表達(dá)量受到CO蛋白的正向調(diào)控[9]，CO蛋白在光照條件下積累，在黑暗條件下降解，引起FT的節(jié)律表達(dá)和蛋白質(zhì)積累，從而影響開花[10]。

赤霉素是重要的植物激素之一，參與種子萌發(fā)、節(jié)間伸長、葉片發(fā)育、開花時(shí)間調(diào)控、花器官建成以及花粉成熟等生理過程[11-15]。DELLA蛋白是赤霉素信號(hào)途徑中的核心抑制因子，能夠結(jié)合眾多下游蛋白質(zhì)，阻礙GA信號(hào)的傳遞[16]。擬南芥共有5個(gè)DELLA基因（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3），這些基因編碼的蛋白質(zhì)均可以抑制開花[17]。研究發(fā)現(xiàn)，DELLA蛋白可以結(jié)合CO蛋白，阻止CO蛋白對下游FT基因的調(diào)控，從而抑制植物開花[18];DELLA蛋白中的RGA蛋白可以結(jié)合FLC蛋白并促進(jìn)FLC蛋白對SOC1和FT基因的抑制作用[19]。當(dāng)植物感受到GA信號(hào)后，GA的受體蛋白GID1通過結(jié)構(gòu)的改變與DELLA蛋白互作，使其泛素化并降解，受DELLA蛋白綁定的轉(zhuǎn)錄因子得以釋放并行使功能，從而使得下游基因響應(yīng)表達(dá)[20-21]。

植物體內(nèi)有大量的基因受到GA的調(diào)控，但這些基因是如何行使功能的，目前尚不明確。GASA （Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis） 是一類受赤霉素調(diào)節(jié)的基因，最早在番茄GA合成缺陷突變體gib1中被鑒定[22]，目前已在多種單子葉植物（如水稻、玉米）[23-24]和雙子葉植物（如擬南芥、草莓）[25-26]中被克隆。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)GASA基因表達(dá)量都受到赤霉素的影響，這些基因可以調(diào)控植物生長發(fā)育，包括種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長、細(xì)胞分裂、開花時(shí)間、脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)交流等[27-28]。GASA蛋白屬于小分子多肽，一般長80～120個(gè)氨基酸，具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的信號(hào)肽、中間的親水區(qū)域和C端高度保守的GASA結(jié)構(gòu)域[29]。在模式植物擬南芥中共有15個(gè)GASA家族基因（AtGASA1～AtGASA15）[27-28]，其中AtGASA4、AtGASA6、AtGASA7、AtGASA8和AtGASA13受GA誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，而AtGASA1、AtGASA5、AtGASA9 和AtGASA11受GA誘導(dǎo)表達(dá)量下調(diào)[30]。AtGASA4能夠促進(jìn)擬南芥開花[31]，而AtGASA5卻抑制擬南芥開花[32]，說明GASA基因家族在植物生長發(fā)育中出現(xiàn)了功能分化，但有關(guān)GASA蛋白的研究還不明確。

蠶豆是重要的冬季食用豆作物，在中國有廣泛的種植[33]，在南方地區(qū)，蠶豆一般在冬季播種，次年春季收獲鮮莢，促進(jìn)蠶豆田間適量提早開花有助于蠶豆提前上市。前人研究發(fā)現(xiàn)，苗期春化處理可以導(dǎo)致蠶豆葉片中大量bHLH、ERF以及WRKY基因家族轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化[34]，此外還有91個(gè)參與不同路徑的蛋白質(zhì)在春化處理后有顯著積累[35]，但是關(guān)于進(jìn)一步的機(jī)理研究以及其他途徑對蠶豆開花時(shí)間影響的研究未見報(bào)道。由于蠶豆的基因組巨大，測序和組裝的難度極大，其可用基因組信息較少[36]，因此有關(guān)蠶豆基因的克隆和功能研究較少。

本研究以通蠶鮮6號(hào)為研究材料，同源克隆VfGASA1基因，對VfGASA1蛋白的同源性和亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，并在擬南芥中過表達(dá)VfGASA1基因，以期研究該基因?qū)πQ豆開花及其他性狀的影響，豐富蠶豆開花機(jī)制研究的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及其 RNA 的提取

本試驗(yàn)采用的蠶豆（Vicia faba）品種為通蠶鮮6號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。按照根、莖、葉片、花、嫩莢、籽粒等組織取樣后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱備用。用RNA提取試劑[天根生化科技（北京）有限公司]提取總RNA。

1.2 基因克隆

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科中與蠶豆親緣關(guān)系較近的物種[37]，根據(jù)美國國家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的蒺藜苜蓿MtGASA13（LOC11422708）的序列信息，設(shè)計(jì)引物VfGASA-F1和VfGASA-R1（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，終延伸5 min，循環(huán)數(shù)為33。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用DNA回收試劑盒[擎科生物科技（南京）有限公司]純化回收，測序獲得VfGASA1序列。本研究所用引物根據(jù)需求按照序列信息設(shè)計(jì)，采用的軟件為Primer 5。

1.3 同源比對

通過在線BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比對，將同源性較高、不同植物品種的GASA家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹用 MEGA 10.0 本地軟件鄰接法構(gòu)建;利用InterPro網(wǎng)站（www.ebi.ac.uk/interpro）對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 載體構(gòu)建

根據(jù)pCAMBIA1305.1-GFP序列設(shè)計(jì)VfGASA1的接頭引物VfGASA1-F2和VfGASA1-R2并擴(kuò)增，Xba Ⅰ酶切產(chǎn)生的線性化載體和PCR產(chǎn)物通過重組酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行重組連接，構(gòu)建

35S∶∶VfGASA1-GFP融合載體。利用DH5α大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，通過測序獲得正確的單克隆菌株，菌株擴(kuò)繁后利用質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中。

1.5 亞細(xì)胞定位

將農(nóng)桿菌在28 ℃ 條件下培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8，收集菌體并用浸染液重懸至OD600為0.1左右，選擇生長28 d左右健康本氏煙草（Nicotiana benthamiana）的倒三至倒五葉，利用注射器進(jìn)行浸染，浸染后48 h內(nèi)在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。觀察到熒光后利用30%蔗糖水溶液處理葉片30 min，觀察煙草葉肉細(xì)胞質(zhì)壁分離后的熒光情況。

1.6 擬南芥浸染

向250 ml LB液體培養(yǎng)基中加入農(nóng)桿菌菌液，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。至菌液OD600達(dá)到1.0左右，室溫離心收集菌體，配制植物浸染液，用等體積的浸染液重懸菌體。將長勢良好的擬南芥花苞浸入農(nóng)桿菌浸染液中，4 min后拿出并用保鮮膜包裹，避光倒伏放置24 h，然后按常規(guī)方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲T0代種子。

1.7 RT-PCR分析

利用TaKaRa實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBR Green Ⅱ熒光染料法進(jìn)行基因的表達(dá)量分析。設(shè)計(jì)特異性引物（表1），反應(yīng)體系為：SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μl，Primer F/R 各0.8 μl，滅菌水6.4 μl，DNA模板2.0 μl，總體系為20.0 μl。進(jìn)行Real Time PCR兩步法擴(kuò)增反應(yīng)，每份樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果利用相對定量2-△△Ct方法計(jì)算表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

數(shù)據(jù)采用Excel軟件繪圖，用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對平均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆GASA1基因的克隆與同源比對

根據(jù)與蠶豆親緣關(guān)系較近的蒺藜苜蓿中的MtGASA13（基因識(shí)別號(hào)：LOC11422708）序列設(shè)計(jì)引物（表1），從蠶豆葉片cDNA中擴(kuò)增出全長約 630 bp的單一條帶，根據(jù)測序結(jié)果預(yù)測該基因編碼序列（CDS）全長363 bp，編碼1個(gè)包含120個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，將該基因命名為VfGASA1。進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖1A）顯示，與VfGASA1同源性最高的蛋白質(zhì)是來自苜蓿的MtGASA13（登錄號(hào)：XP_003625068.1），相似性為88.3%，其次是鷹嘴豆CaGASA1蛋白（登錄號(hào)：XP_004493436.1），相似性為85.8%，這也和豆科植物與苜蓿、鷹嘴豆有較近的親緣關(guān)系一致[38]。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，與蠶豆VfGASA1蛋白同源性最高的蛋白質(zhì)是AtGASA15（登錄號(hào)：NP_001319515.1），相似性約為69.0%。根據(jù)InterPro網(wǎng)站（www.ebi.ac.uk/interpro）的預(yù)測，VfGASA1蛋白的一級結(jié)構(gòu)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，前24個(gè)氨基酸殘基是一段信號(hào)肽，第61至第120個(gè)氨基酸是GASA結(jié)構(gòu)域，中間是一段不保守區(qū)域，與其他物種中同源蛋白相比，VfGASA1蛋白在GASA結(jié)構(gòu)域內(nèi)高度保守，包含12個(gè)半胱氨酸殘基，而在信號(hào)肽區(qū)域的差異較大（圖1B）。

2.2 VfGASA1亞細(xì)胞定位

根據(jù)TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的預(yù)測，VfGASA1蛋白是一個(gè)分泌蛋白，可能定位于質(zhì)外體，這與大部分GASA蛋白的定位有差別，為檢測VfGASA1蛋白的亞細(xì)胞定位情況，將重組質(zhì)粒35S∶∶VfGASA1-GFP以及PP2A-mCherry共同轉(zhuǎn)入本氏煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白（GFP）信號(hào)與膜marker的熒光重疊，均出現(xiàn)在細(xì)胞輪廓上（圖2A），繼續(xù)用30%蔗糖溶液對煙草葉片進(jìn)行質(zhì)壁分離處理，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)壁分離后的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上均能觀察到GFP熒光（圖2B），綜合以上結(jié)果推測VfGASA1是一個(gè)定位在質(zhì)外體的分泌蛋白。

2.3 VfGASA1基因的表達(dá)模式

GASA家族基因參與植物側(cè)根、葉片、莖稈、花器官和種子的生長發(fā)育，因此VfGASA1的表達(dá)模式會(huì)決定其最終功能。我們通過RT-PCR對蠶豆不同部位VfGASA1的表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，VfGASA1在嫩莢中表達(dá)量最高，在葉中也有很高的表達(dá)量，在花器官中有一定的表達(dá)量，但是在莖和籽粒中表達(dá)量很低，而在根中幾乎檢測不到表達(dá)（圖3），說明VfGASA1是一個(gè)在嫩莢和葉片中高表達(dá)的基因。

2.4 VfGASA1在擬南芥中抑制開花的機(jī)制

VfGASA1蛋白與擬南芥體內(nèi)AtGASA15編碼蛋白高度同源，此前未有關(guān)于AtGASA15功能的研究，為進(jìn)一步研究VfGASA1在植物體內(nèi)的作用，我們購買了擬南芥突變體gasa15，并在Col-0型（野生型）擬南芥中過表達(dá)了VfGASA1，在T2代篩選得到陽性轉(zhuǎn)基因株系L16和L24。定量結(jié)果顯示，在這2個(gè)陽性株系體內(nèi)的VfGASA1有較高的表達(dá)量（圖4A），過表達(dá)株系在長日照條件下（光照16 h/黑暗8 h），開花時(shí)間明顯延遲（圖4B、圖4C），播種后第23 d，野生型以及gasa15突變體擬南芥均已開花，而L16、L24仍未抽薹（圖4B），L16、L24株系在開花時(shí)蓮座葉數(shù)量也較野生型及gasa15突變體擬南芥顯著增加（圖4D），說明外源VfGASA1基因的過表達(dá)可以延遲擬南芥的開花，gasa15突變體開花時(shí)間與野生型擬南芥比沒有差異，這可能是由其他GASA基因的功能冗余導(dǎo)致的。

為明確VfGASA1是否參與開花信號(hào)途徑，我們對長日照條件下擬南芥開花途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了連續(xù)定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株AtFT的表達(dá)模式與野生型一致，但是轉(zhuǎn)基因植株中AtFT的表達(dá)量顯著降低，尤其在光照16 h后（圖4E）。AtCO的表達(dá)模式及表達(dá)量在野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥之間沒有明顯差異（圖4F），此外，開花途徑負(fù)調(diào)控基因FLC的相對表達(dá)量在L24植株中極顯著上調(diào)，而正向調(diào)控基因SOC1的相對表達(dá)量顯著下調(diào)（圖4G），這些結(jié)果表明在過表達(dá)植株中開花途徑被抑制。GA途徑主要通過解除DELLA對CO的綁定，促進(jìn)FT的表達(dá)從而誘導(dǎo)開花，因此我們對比了野生型和轉(zhuǎn)基因株系DELLA基因的表達(dá)量，5個(gè)DELLA基因中，GAI在過表達(dá)株系L24中極顯著上調(diào)（圖4H）。

通過對開花基因以及GAI的定量分析，我們推測VfGASA1參與了赤霉素調(diào)控開花的過程，為驗(yàn)證這一猜想，我們對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株外施GA3處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤霉素處理后過表達(dá)VfGASA1株系L24與野生型的開花時(shí)間沒有明顯差異（圖5），并且相對于未處理的植株，開花時(shí)間明顯提前，外源赤霉素可以恢復(fù)VfGASA1對開花的延遲作用，說明VfGASA1缺失參與了赤霉素對開花時(shí)間的影響，并且起到負(fù)調(diào)控的作用，可能是通過促進(jìn)DELLA基因中GAI基因的表達(dá)，從而抑制開花。

3 討論

中國是世界第一大蠶豆消費(fèi)國和生產(chǎn)國[39]，在蠶豆生產(chǎn)中晚花會(huì)導(dǎo)致蠶豆受到高溫脅迫，從而使產(chǎn)量降低[40]以及異交率大幅提升[41]。近年來，蠶豆晚花給蠶豆的產(chǎn)量提升以及育種工作帶來了極大的困擾，因此蠶豆晚花是亟待解決的問題。目前生產(chǎn)上常用苗期春化處理的方式促進(jìn)蠶豆早花，但是這種方式需要大量前期投入，而且對某些春化不敏感品種沒有效果，因此尋找其他辦法，例如外源赤霉素處理等來促進(jìn)早花對于蠶豆生產(chǎn)非常重要。

赤霉素信號(hào)途徑通過解除DELLA蛋白對CO蛋白的抑制，提升CO蛋白對FT的轉(zhuǎn)錄激活能力，提高FT的表達(dá)，從而促進(jìn)植物開花[18-19]。但是關(guān)于赤霉素下游基因如何行使功能的研究較少，GASA家族基因是一類赤霉素下游響應(yīng)基因[27-28]，前人的研究發(fā)現(xiàn)部分GASA成員可以參與赤霉素對植物開花的調(diào)控，例如AtGASA4能夠促進(jìn)擬南芥提早開花[31]，AtGASA5能夠抑制擬南芥開花[32]，此外GASA家族成員還能夠調(diào)控株型建成以及種子大小等[27-28]，顯示出該家族成員在分子育種中的潛力。

蠶豆龐大的基因組是蠶豆基因克隆和分子育種的巨大障礙[36]，前期關(guān)于蠶豆的研究較少，大部分集中于抗病和抗列當(dāng)寄生基因的QTL定位[42]，以及產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位[43]，關(guān)于蠶豆開花時(shí)間的研究僅有春化的相關(guān)報(bào)道[34-35]。本研究通過同源比對的方式從蠶豆cDNA中克隆出1個(gè)GASA家族基因并命名為VfGASA1，發(fā)現(xiàn)VfGASA1是一個(gè)定位在質(zhì)外體的分泌蛋白，受到赤霉素的調(diào)控，在擬南芥中異源過表達(dá)VfGASA1能夠顯著延遲擬南芥的開花時(shí)間，熒光定量的結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因植株中擬南芥DELLA基因中GAI基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，說明VfGASA1可能是通過影響DELLA基因的表達(dá)，從而參與赤霉素對開花時(shí)間的調(diào)節(jié)，考慮到VfGASA1定位在質(zhì)外體，因此VfGASA1不會(huì)直接調(diào)控DELLA基因的表達(dá)，應(yīng)該存在某種間接途徑影響DELLA基因的表達(dá)，這需要后續(xù)的深入研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-04-29

基金項(xiàng)目：國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物防治與綜合防控崗位科學(xué)家項(xiàng)目（CARS-08-G15）;江蘇特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心項(xiàng)目[JATS（2019）399]

作者簡介：高 營（1994-），女，河南南陽人，碩士研究生，從事豆類作物分子育種研究。（E-mail）3099618289@qq.com

通訊作者：朱月林，（E-mail）ylzhu@njau.edu.cn