袁 震，劉 鷹,3，吳禹濛，姜潔明，張 磊，劉 奇，葉仕根

(1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266205)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)俗稱河鲀，主要分布于太平洋西北部[1]，是中國、日本和韓國重要的海水養(yǎng)殖魚類[2]，因其味道鮮美、肉質(zhì)鮮嫩，素有“魚中之王”的美稱，深受消費(fèi)者喜愛，有較高的經(jīng)濟(jì)價值。近年來，紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖產(chǎn)量逐漸增大，2017年紅鰭東方鲀養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)24 403 t[3]。但由于養(yǎng)殖密度過高、水環(huán)境質(zhì)量較差等原因，紅鰭東方鲀病害問題屢屢發(fā)生[4-5]。異溝蟲(Heterobothriumtetrodonis)是養(yǎng)殖紅鰭東方鲀最常見的寄生蟲性病原之一[6]。

異溝蟲，屬鉤鋏蟲目、八鋏蟲科、異鉤盤蟲屬，為紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀 (T.obscurus) 等鲀科魚類所特有的寄生蟲，蟲體成舌狀，背腹扁平，體長5～20 mm[7]，后部有4對對稱排列的固著鋏。異溝蟲主要寄生于紅鰭東方鲀的鰓部，患病魚表現(xiàn)為體色發(fā)黑，食欲減退，游動遲緩或伏底不動[8]。該病病程較長，發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率超過75%，且一年四季均可發(fā)病。

福爾馬林是養(yǎng)殖水體消毒和水產(chǎn)動物疾病治療的常用藥物[9-11]。在韓國，質(zhì)量濃度為100～300 mg/L的福爾馬林常用于控制陸基水族箱和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、許氏平鲉(Sebastesschlegeli)等體表寄生蟲的防治[12]。與其他消毒、殺蟲類藥物相比，福爾馬林安全耐受劑量范圍較廣、毒性低、殘留少，成本相對低廉[13]。然而福爾馬林在水中可殘留一段時間[14]，同時福爾馬林會降低水中的溶解氧水平，易導(dǎo)致缺氧情況發(fā)生[15]。因此，在尚未有安全、有效的藥物之前，研究福爾馬林對異溝蟲的殺滅效果及其安全性，形成安全、有效的防治方案，對紅鰭東方鲀異溝蟲病的防治具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病紅鰭東方鲀幼魚(200日齡，150尾)，平均體質(zhì)量約為(20±5) g，取自大連某紅鰭東方鲀養(yǎng)殖企業(yè)。自150尾中隨機(jī)取10尾病魚檢查發(fā)現(xiàn)，其全部鰓的帶蟲數(shù)分別為47、53、41、41、48、39、58、54、49、44個。經(jīng)皮膚、黏液等組織鏡檢后未發(fā)現(xiàn)患有其他寄生蟲病，紅鰭東方鲀活體暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程技術(shù)研究中心。養(yǎng)殖水槽容積為1 m3，日換水2次，每次換水達(dá)90%，養(yǎng)殖水溫17～19 ℃，鹽度32，氨氮≤0.01 mg/L，亞硝態(tài)氮≤0.005 mg/L。24 h不間斷充氣，溶解氧≥5 mg/L。每日早、中、晚各飽食投喂顆粒飼料1次。

福爾馬林溶液(分析純，甲醛含量37.0%～40.0%)購自遼寧泉瑞試劑有限公司。

尼康顯微鏡(E600POL)用于異溝蟲以及蟲卵孵化過程的觀察與拍照。

1.2 異溝蟲蟲卵孵化觀察

自患有異溝蟲病的紅鰭東方鲀幼魚的鰓上取出蟲卵，放入500 mL燒杯中，微充氣孵化，水溫17～19 ℃，每日換水1次。每隔6 h觀察1次蟲卵，確定其孵化狀態(tài)。

1.3 福爾馬林對異溝蟲的殺滅效果

為了比較福爾馬林對不同發(fā)育階段異溝蟲的殺滅效果，根據(jù)蟲體大小將異溝蟲分為幼蟲(體長≤1 cm)和成蟲(體長>1 cm)兩組，分別進(jìn)行試驗。

首先，將15尾患病紅鰭東方鲀幼魚隨機(jī)放入5個水槽(10 L)中，每個水槽暫養(yǎng)3尾，水槽中福爾馬林溶液的劑量分別設(shè)置為500、550、600、650、700 mL/m3，浸浴0.5 h后，取魚兩側(cè)所有鰓組織，分別于顯微鏡下觀察；同時，將另外15尾病魚也隨機(jī)放入5個水槽中，每個水槽3尾，福爾馬林浸浴劑量與上述設(shè)置相同，即500、550、600、650、700 mL/m3，1 h后取魚兩側(cè)所有鰓組織鏡檢。若蟲體在30 s無內(nèi)蠕動現(xiàn)象發(fā)生即判定寄生蟲死亡。在每個試驗組中，分別計算異溝蟲總數(shù)(紅鰭東方鲀鰓部所有異溝蟲幼蟲和成蟲的總和)，藥浴后幼蟲存活數(shù)、藥浴后成蟲存活數(shù)、藥浴后異溝蟲幼蟲存活率，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。幼蟲存活率為幼蟲存活數(shù)占幼蟲總數(shù)的百分比。

1.4 福爾馬林藥浴安全性評價

為了評價福爾馬林藥浴的安全性，將45尾病魚隨機(jī)放入15個水槽中，每3個水槽為1個平行，分別加入福爾馬林溶液(劑量設(shè)置與1.3相同)，浸浴12 h。每隔0.5 h觀察并記錄魚體狀態(tài)，連續(xù)觀察12 h。統(tǒng)計各試驗組魚體出現(xiàn)如呼吸困難、游動緩慢甚至無力游動等異常狀態(tài)的時間及最終死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.0和Microsoft Excel 2016軟件分析處理，采用單因素方差分析顯著性，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 異溝蟲蟲卵孵化過程

經(jīng)觀察，在17～19 ℃下，異溝蟲蟲卵5.5 d孵化出幼蟲，8 d孵化結(jié)束，蟲卵孵化大致可分為4個階段。孵化初期(卵孵化開始后0～36 h)：蟲卵通體發(fā)黑，不透明，無法看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖1a)；孵化中期(卵孵化開始后36～84 h)：蟲卵顏色變淡，透明度增加，卵兩端變空，卵內(nèi)胞質(zhì)向中間聚集(圖1b)；孵化后期(卵孵化開始后84～132 h)：蟲卵顏色繼續(xù)變淡，呈黃綠色，卵內(nèi)胞質(zhì)繼續(xù)向中心聚集，已能初步觀察到幼蟲的形態(tài)(圖1c)；破卵(卵孵化開始后132～192 h)：幼蟲鉆出蟲卵，進(jìn)入水體中尋找宿主(圖1d)。整個異溝蟲蟲卵孵化過程約持續(xù)8 d。同一批次中，剩余未孵化成功的卵，若再繼續(xù)觀察3 d后仍未孵化，可判定該卵孵化失敗。對紅鰭東方鲀鰓部異溝蟲卵鏡檢統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其總體孵化率約為50%，并未觀察到明顯的孵化高峰期。

圖1 異溝蟲蟲卵孵化過程Fig.1 The incubation of H.tetrodonis eggs a.孵化初期；b.孵化中期；c.孵化后期；d.破卵.a.initial stage of incubation;b.middle stage of incubation;c.late stage of incubation;d.hatching.

2.2 福爾馬林對異溝蟲的殺滅效果

試驗發(fā)現(xiàn)，在試驗劑量范圍內(nèi)，福爾馬林藥浴對體長≤1 cm的異溝蟲殺滅效果較好，但不能有效殺滅體長>1 cm的異溝蟲。在福爾馬林藥浴0.5 h的試驗組中發(fā)現(xiàn)，500、550 mL/m3劑量不能徹底殺滅異溝蟲幼蟲。紅鰭東方鲀鰓絲中異溝蟲幼蟲存活率分別為34.74%和11.90%，當(dāng)福爾馬林劑量≥ 600 mL/m3，福爾馬林對異溝蟲幼蟲的殺滅效果良好，異溝蟲幼蟲存活率不足5%。在福爾馬林藥浴1 h的試驗組中，劑量為500、550 mL/m3的福爾馬林溶液對異溝蟲幼蟲的殺滅效果要好于藥浴0.5 h(P<0.05)，但仍有部分幼蟲存活。當(dāng)福爾馬林劑量≥600 mL/m3時，所有異溝蟲幼蟲均被殺滅(表1)。

表1 福爾馬林藥浴后異溝蟲的存活情況Tab.1 The survival of H.tetrodonis in the formalin bath

2.3 福爾馬林藥浴對紅鰭東方鲀安全性的初步評價

在福爾馬林劑量為500、550 mL/m3試驗組中，分別有2尾魚于7.5 h時出現(xiàn)異常，試驗結(jié)束時(12 h)分別有6尾魚死亡，死亡率為66.6%；在劑量為600 mL/m3的試驗組中，1尾魚于藥浴后5 h時出現(xiàn)異常，最終9尾魚全部死亡，死亡率為100%；在劑量為650 mL/m3的試驗組中，2尾魚藥浴后4 h出現(xiàn)異常，最終9尾魚全部死亡，死亡率為100%；在劑量為700 mL/m3的試驗組中，4尾魚藥浴后3 h出現(xiàn)異常，最終9尾魚全部死亡，死亡率為100%(表2)。

表2 福爾馬林藥浴紅鰭東方鲀安全性評價Tab.2 Safety evaluation of tiger puffer T.rubripes treated by formalin

3 討 論

3.1 福爾馬林藥浴防治紅鰭東方鲀異溝蟲病的有效性

《水產(chǎn)動物病害學(xué)》[7]中對于異溝蟲病的防治方法分別為實施淡水浸泡和雙硫二氯酚拌料投喂，其中淡水浸泡效果較差，而雙硫二氯酚作為劇毒藥物，對養(yǎng)殖魚類的毒性極大，并會產(chǎn)生藥物殘留，誤食后會對人體造成嚴(yán)重?fù)p傷，國家已禁止其用于養(yǎng)殖魚類。福爾馬林溶液是水產(chǎn)養(yǎng)殖常用藥物之一，常被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的體表寄生蟲的防治中。Shinn等[16]研究表明，合理控制水體中的福爾馬林含量，可有效預(yù)防多子小瓜蟲(Ichyhyophthiriusmultifiliis)病的暴發(fā)。閆茂倉等[17]研究表明，使用20～80 mg/L的福爾馬林溶液藥浴可有效防治刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，與魯哥氏液、高錳酸鉀相比，福爾馬林對多子扇形游仆蟲(Euplotesvannus)和寡毛雙眉蟲(Diophrysoligothrix)的殺滅效果更好[18-19]。此外，福爾馬林也被用于防治魚體外部感染所致疾病，如水霉(Saprolegnia)病、微杯蟲病、車輪蟲病、斜管蟲病等[20-22]。

本試驗結(jié)果表明，福爾馬林對紅鰭東方鲀異溝蟲幼蟲有較好的殺滅效果，600～700 mL/m3浸浴1 h可以殺滅絕大多數(shù)異溝蟲幼蟲，但對體長超過1 cm的成蟲沒有明顯效果。這可能是因為成蟲抵抗力較強(qiáng)，已經(jīng)很難在保證魚體安全的情況下通過藥浴的方式將其殺滅。因此，不建議使用福爾馬林殺滅異溝蟲成蟲。異溝蟲成蟲防治方法還需進(jìn)一步研究。前期試驗發(fā)現(xiàn)，異溝蟲蟲卵由卵絲互相連接成串狀，通常有數(shù)個蟲體的卵互相纏繞在一起，拖拉在宿主鰓孔的外面，在魚游泳時這些卵串會被掛在養(yǎng)魚的網(wǎng)箱上或海藻上并進(jìn)行孵化。孵化后的幼蟲會在水中尋找宿主，遇到合適的宿主后就隨著魚呼吸時的水流附著到鰓組織及皮膚上[7]。故研究蟲卵離體孵化時間在紅鰭東方鲀異溝蟲病實際防治過程中十分必要。本試驗結(jié)果顯示，離體狀態(tài)下，異溝蟲蟲卵經(jīng)5.5～8 d可孵化出幼蟲，所以在紅鰭東方鲀異溝蟲病防治期間應(yīng)階段性持續(xù)用藥，避免出現(xiàn)幼蟲再次寄生的情況。

3.2 福爾馬林藥浴防治紅鰭東方鲀異溝蟲病的安全性

研究表明，福爾馬林代謝快速度快，生物累積低，在合理控制施用劑量和時間的情況下，對魚體毒性相對較小[23]。研究發(fā)現(xiàn)，大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)幼魚每日使用質(zhì)量濃度為167 mg/L的福爾馬林溶液藥浴1 h，連續(xù)處理20 d后，魚的各項生長和生理的指標(biāo)均無顯著變化[24]；斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)幼魚經(jīng)質(zhì)量濃度為25 mg/L的福爾馬林溶液浸泡4 h，每周連續(xù)浸泡4 d，共計處理28周后進(jìn)行解剖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組魚的鰓部相比于對照組無明顯損傷[25]。福爾馬林浸泡不會影響大西洋鮭(Salmosalar)幼魚的生長速度，與對照組相比，魚的血清電解質(zhì)、血細(xì)胞和存活率均無明顯變化[26]。綜上所述，使用適量的福爾馬林浸泡，可以有效防治因外部感染所致疾病，且對魚體損傷較小，適用于防治紅鰭東方鲀異溝蟲病，故通過試驗手段確定福爾馬林溶液的安全用量對于紅鰭東方鲀養(yǎng)殖顯得尤為重要。本試驗顯示，在水溫為17～19 ℃，500～550 mL/m3福爾馬林浸泡下，20 g的幼魚在7.5 h之后會出現(xiàn)中毒反應(yīng)；在600～700 mL/m3福爾馬林浸泡時，4～5 h之后試驗魚會出現(xiàn)中毒反應(yīng)。婁忠玉等[27]利用福爾馬林藥浴銀鮭(O.kisutch)苗種時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其他條件不變時，水溫升高，福爾馬林毒性增大。因此，紅鰭東方鲀幼魚養(yǎng)殖環(huán)境的其他因素(如pH、溶解氧等)對防治效果的影響還有待進(jìn)一步探究。同時應(yīng)注意，用藥后切忌在福爾馬林休藥期內(nèi)將魚上市，以免藥物殘留危害消費(fèi)者的健康。

4 結(jié) 論

綜上，體質(zhì)量約為20 g的紅鰭東方鲀異溝蟲病的建議防治方案為：在17～19 ℃下，600 mL/m3的福爾馬林溶液浸浴1 h，8 d后重復(fù)藥浴1次。兩次藥浴處理后，可以殺滅全部異溝蟲幼蟲，使其出現(xiàn)斷代，從而達(dá)到治療紅鰭東方鲀異溝蟲病的效果。本試驗結(jié)果為紅鰭東方鲀水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了有益的科學(xué)資料。