李勝，昌強(qiáng)，李彥志，李莞婷，蘭芯，吳心悅，呂光華，龍飛▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起[1]。具有傳播迅速廣泛、傳染性強(qiáng)、易感染的特點[2]。截至2020年5月11日24時我國累計報告確診病例82 919例，全球累計確診超過400萬余例[3]。該病臨床以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，輕型僅表現(xiàn)為低熱、輕微乏力等，無肺炎表現(xiàn)，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官功能衰竭，甚至死亡。其中重型危重指標(biāo)包括外周血炎癥因子如IL-6、反應(yīng)蛋白進(jìn)行性上升等[4]。國內(nèi)在新冠肺炎救治過程中，中醫(yī)藥發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢，中醫(yī)藥參與的治療超過了90%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道以2020年2月19為節(jié)點，國內(nèi)共發(fā)布52張中醫(yī)藥防治新冠肺炎不同時期診療方案代表方[5]。

厚樸-廣藿香藥對多見于濕滯中焦證。廣藿香，性微溫，味辛，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有化濕解暑、止嘔的功效，為芳香化濕濁要藥，《本草圖經(jīng)》言其“治脾胃吐逆，為之要藥”；厚樸，性溫，味苦、辛，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有行氣消積、燥濕平喘的功效，為消除脹滿之要藥，《別錄》有言“消痰下氣，治霍亂及腹痛脹滿”[6]。兩者配伍化濕醒脾、和胃止嘔、行氣除滿。厚樸-廣藿香藥對常見于《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》所列出的中醫(yī)藥治療方案中，兩藥配伍主要用于臨床表現(xiàn)為輕型、普通型、重型及恢復(fù)期中相關(guān)方劑(寒濕郁肺方、寒濕阻肺方、濕熱蘊(yùn)肺方、濕毒郁肺方)[7]。此外有研究指出，廣藿香在新冠肺炎防治中藥方劑中出現(xiàn)的頻率最高，超過30%，尤其是在預(yù)防，醫(yī)學(xué)觀察期和輕癥期階段的占比最高，且厚樸配伍廣藿香為高頻使用中藥配伍藥對[5]。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為新冠肺炎屬于中醫(yī)學(xué)“寒疫”范疇,主要病位在肺,其次在衛(wèi)表、脾胃[8]。《尚篇·詳論溫疫以破大惑》中指出“中焦為陰陽交界，凡清濁之邪必從此區(qū)分，甚者三焦相涸”。筆者在藥物歸經(jīng)及藥對選用頻率的啟示下，選擇厚樸-廣藿香藥對探討其在治療“寒濕疫”中的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，篩選厚樸-廣藿香的活性化合物，運(yùn)用TCMSP、BATMAN-TCM、GeneCards 、Uniprot等數(shù)據(jù)庫收集厚樸-廣藿香及COVID-19相關(guān)疾病靶點，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)、靶點蛋白間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、進(jìn)而對潛在靶點功能信號通路等進(jìn)行多維度可視化處理，從分子水平探討厚樸-廣藿香治療COVID-19的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究和新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 厚樸-廣藿香活性成分的篩選及作用靶點的預(yù)測

本研究通過TCMSP平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[9]，以“厚樸”“廣藿香”為檢索關(guān)鍵詞，滿足口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18條件進(jìn)行篩選，并利用中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),滿足Score cutoff=20，P Value Cutoff=0.01條件和查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索補(bǔ)充獲取厚樸-廣藿香的有效化合物及其作用靶點。將得到符合篩選條件的活性成分靶點信息通過Uniport數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白名稱，并去除非人源的靶點基因使基因名標(biāo)準(zhǔn)化(BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得的標(biāo)準(zhǔn)基因不作處理)。

1.2 COVID-19相關(guān)靶點的預(yù)測

借助GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www. genecards.org/)，以“novel coronavirus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到治療新型冠狀病毒(COVID-19)肺炎疾病作用靶點。

1.3 厚樸-廣藿香治療COVID-19潛在靶點的預(yù)測

借助ImageGP在線數(shù)據(jù)分析平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)將1.1中所得到的藥物作用靶點與1.2中COVID-19肺炎疾病可能作用靶點繪制韋恩圖，二者的交集為治療COVID-19潛在作用靶點。將搜集得到的有效化合物潛在作用靶點及疾病靶點通過Excel整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點的篩選

將1.3中得到的交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)定物種來源“Homo sapiens”，進(jìn)行蛋白與蛋白的相互作用分析，得到交集靶點PPI信息。再利用Cytoscape3.7.2軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用 Network Analyzer 對該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，計算網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點(靶點蛋白)度值(degree)，按照度值大小進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓拔分析。

1.5 GO富集分析與KEGG通路分析

將1.4中的交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，設(shè)定Min Overlap=3，P Value Cutoff=0.01，Min Enrichment=1.5，進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG信號通路富集分析。對于滿足條件的富集分析結(jié)果借助ImageGP在線數(shù)據(jù)分析平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 厚樸-廣藿香活性成分及作用靶點

共檢索得到厚樸-廣藿香活性成分15個，其中厚樸4個，廣藿香11個，廣藿香11個活性成分中2種活性成分無相應(yīng)作用靶點，將通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的兩者活性成分靶點分別借助UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化得到標(biāo)準(zhǔn)基因名，結(jié)合BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)共計獲得227個作用靶點(去除重復(fù)值及非人源的靶點基因)，厚樸-廣藿香活性成分OB、DL值及藥物作用靶點個數(shù)詳見表1。

表1 厚樸-廣藿香活性成分OB、DL值及藥物作用靶點個數(shù)

2.2 厚樸-廣藿治療COVID-19的潛在作用靶點預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共檢索到350個與COVID-19疾病相關(guān)的靶點，借助ImageGP在線數(shù)據(jù)分析平臺與2.1中的得到的227個活性成分作用靶點進(jìn)行映射，映射后得到共同靶點47個，將二者繪制成維恩圖。47個交集靶點即為治療COVID-19的潛在作用靶點。

圖1 厚樸-廣藿香活性成分作用靶點和COVID-19疾病靶點維恩圖

2.3 “藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

“藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)共包含55個節(jié)點(其中藥材節(jié)點2個，潛在藥物活性成分6個，潛在作用靶點47個，56條邊。圓形代表藥材，三角形代表厚樸-廣藿香中活性成分(黃色為廣藿香，紫色為厚樸)，菱形代表潛在作用靶點，節(jié)點間連線越多說明二者之間對應(yīng)關(guān)系密切，在整個網(wǎng)絡(luò)中可能起到樞紐的作用，在圖2中MOL 000098-槲皮素、MOL 005916-葛花苷元、MOL 005573-莞花素、MOL 005970-桉樹醇、MOL 000210-厚樸酚、MOL 005955-和厚樸酚的度值分別為36、7、3、4、3、3。說明槲皮素、葛花苷元、桉樹醇等在治療COVID-19方面具有較大潛在活力，尤其是槲皮素(見圖2)。

2.4 厚樸-廣藿香治療COVID-19潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建出的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)包含47個節(jié)點，571條邊，平均節(jié)點度值為24.3。網(wǎng)絡(luò)圖中圓代表蛋白，線代表蛋白與蛋白相互作用關(guān)系。圖中圓圈大小由內(nèi)至外依次變小，顏色由深變淺，表示該網(wǎng)絡(luò)中蛋白蛋白相互作用關(guān)系越不相關(guān)，顏色越深，圓圈越大代表該節(jié)點的度值(degree)越大，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。經(jīng)過拓拔分析，其中節(jié)點度值最大為40(IL6、TNF)，最小為1(F10)。按度值大小依次為IL6、TNF、TP53、CASP3、MAPK1、IL10、CCL2、CXCL8、IL1B等。在網(wǎng)絡(luò)蛋白互作圖中，度值越大表示該節(jié)點蛋白在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，選取度值前9的節(jié)點分析，這些度值較高的靶點(degree≥35)可能是厚樸-廣藿香發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點。

2.5 GO生物富集分析及KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫將1.3中的交集靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，共有4 854條生物功能顯著富集(P<0.01)，其中BP條目4 178個，CC條目311個，MF條目365個。在BP中靶點主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號通路、白細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等；在CC中靶點主要涉及膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、核包膜；在MF中靶點主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白激酶活性等。分別選取滿足1.5中設(shè)定條件的lgP(圖中為Log10)值，將得到的富集分析結(jié)果用分別采用高級氣泡圖進(jìn)行可視化分析。詳見圖4、圖5、圖6。

使用Metascape數(shù)據(jù)庫對47個潛在作用靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果共得到187條信號通路(P<0.01)，前20個條目及其他大部分條目主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡等通路。選取lgP值較小的前20條通路,利用高級氣泡圖進(jìn)行可視化分析。詳見圖7。

圖2 “藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 潛在靶點的相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

脾胃居于中焦，為氣機(jī)升降、水液代謝、水谷傳化之樞[10]。有學(xué)者將此次疫病歸于“寒濕疫”[11]，認(rèn)為寒濕直入脾胃而致水谷不得運(yùn)化，寒濕疫毒閉肺困脾為核心病機(jī)，治療應(yīng)宣肺透邪、健脾除濕、辟穢化濁，從表、肺、脾胃三個途徑開通肺氣。而臨床COVID-19的常見癥狀有腹瀉、惡心、嘔吐等表現(xiàn)[12]，這充分揭示了中焦脾胃病變在新冠肺炎中的重要影響。厚樸-廣藿香配伍重在治療濕滯中焦證，寒邪易傷脾陽致脾虛生濕[13]，故厚樸-廣藿香臨床治療“寒濕疫”的中醫(yī)機(jī)理是通過兩藥配伍散寒除濕、和胃止嘔從而達(dá)到寒濕除，疫病去的效果。從早期臨床表現(xiàn)來看，藥物配伍使用率最高者為“厚樸-廣藿香”，體現(xiàn)于藿香正氣膠囊、藿樸夏苓湯、荊防藿樸解毒方等眾多初期中成藥或治療方中[14]。基于此，對厚樸-廣藿香中有效潛在活性成分及其對應(yīng)疾病靶點之間的關(guān)系研究在厚樸-廣藿香配伍治療COVID-19方面具有較大前景。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法共篩選出厚樸-廣藿香活性成分15個，作用靶點227個，借助數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步得到具有潛在治療COVID-19活性成分6個，潛在作用靶點47個。從“藥物-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)拓拔分析來看，得到可能治療COVID-19關(guān)鍵化合物為槲皮素、葛花苷元、莞花素、桉樹醇、厚樸酚、和厚樸酚。現(xiàn)代藥理研究證實，槲皮素有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[15]。有國外研究者認(rèn)為槲皮素是一種最有希望應(yīng)用于疾病預(yù)防和治療的天然化合物[16]。此外還發(fā)現(xiàn)槲皮素納米粒能降低IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平，在蛋白水平下調(diào)NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表達(dá)從而起到抗炎作用，另外還可通過組織NF-κB的活性在mRNA水平和蛋白水平抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iN-OS)、環(huán)氧化酶2(COX-2) 和C反應(yīng)蛋白(CRP)途徑從而起到抗炎作用[17]。再者槲皮素還可有效抑制肺纖維化相關(guān)蛋白FN,α-SMA,Collagen I的表達(dá)水平并且抑制S1P、SphK1表達(dá)，從而改善肺纖維化，減輕肺纖維損傷[18]。葛花苷元和和莞花素均是黃酮類化合物，有國外學(xué)者研究指出大多數(shù)黃酮類活性化合物可以通過阻斷病毒和宿主受體結(jié)合、抑制病毒復(fù)制、直接靶向殺滅病毒、抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)等多途徑協(xié)同發(fā)揮發(fā)揮廣譜抗病毒作用[19]，此外黃酮類物質(zhì)還可以抑制EB病毒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)[20]，能通過直接殺滅病毒、抑制病毒唾液酶活性、阻斷病毒吸附等途徑抗流感[21]，由此可見葛花苷元和莞花素具有潛在的抗病毒，抗流感活性。同時，已有研究表明，槲皮素，葛花苷元能夠與SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2 進(jìn)行較為穩(wěn)定的構(gòu)象對接，其結(jié)果與現(xiàn)階段文獻(xiàn)報道新型冠狀病毒肺炎常用藥物如瑞德西韋、洛匹那韋、利巴韋林等相近[22-23]。另外基于已有文獻(xiàn)報道，厚樸中厚樸酚、和厚樸酚、厚樸木脂等體Ⅰ、桉葉油醇、和厚樸新酚、新橙皮苷、反亞油酸甲酯具有抗菌、抗病毒、抗炎、潛在抑制花生四烯酸代謝通路，改善腸動力促進(jìn)腸運(yùn)動等作用[24-26]。廣藿香中廣藿香醇具有明顯的抗柯薩奇病毒、抗腺病毒和抗甲型流感病毒的作用[27]，同時相關(guān)文獻(xiàn)指出廣藿香中廣藿香油具有顯著抗菌、抗流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒和柯薩奇病毒、調(diào)節(jié)腸胃功能、止咳、平喘、止嘔、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用[28-30]。故厚樸-廣藿香治療COVID-19具有較高的開發(fā)前景。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選可知厚樸-廣藿香主要通過IL6、TNF、TP53、CASP3、MAPK1、IL10、CCL2、CXCL8、IL1B這9個靶點發(fā)揮主要治療作用。IL6、IL10、CCL2、IL1B介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，共同參與炎癥的多條通路。HUANG C等[31]在《柳葉刀》發(fā)文指出新型冠狀病毒的感染與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”存在密切聯(lián)系，“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是機(jī)體對病毒、細(xì)菌等外界刺激產(chǎn)生的一種過度免疫反應(yīng)[26]。而在9個關(guān)鍵靶點中有6個與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”有關(guān)，其中IL家族是最重要的炎癥因子,TNF是一種可激活炎性應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、參與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，CCL2為CC趨化因子亞家族成員之一，可對炎癥細(xì)胞產(chǎn)生募集作用、還能夠能夠刺激平滑肌收縮[32]。MAPK1是絲分裂原活化蛋白激酶家族成員，在細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡過程起著重要作用。CASP3在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CASP3能夠明顯抑制先天免疫激活，進(jìn)而防止細(xì)胞因子過度產(chǎn)生[32]。TP53是最重要的抑癌基因之一，其編碼的蛋白——腫瘤抑制蛋白p53能夠使許多基因保持其穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、衰老[34]。

通過GO生物富集分析主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等過程。對于脂多糖反應(yīng)，近年來研究表明，LPS可以觸發(fā)TLR通路，進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB等激活和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[35]。此外，LPS還可通過激活NLRP3炎癥小體從而誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡[36]。大量文獻(xiàn)表明細(xì)胞因子介導(dǎo)的通路與炎癥密切相關(guān)[37-38]。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，其主要途徑為死亡受體途徑和線粒體途徑[39],執(zhí)行依據(jù)主要為caspase-3的活化及其對多種蛋白酶和核酸酶的水解活化[40]。

KEGG富集結(jié)果分析得到主要涉及的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡等通路。AGE-RAGE信號通路能激活NF-κB信號通路，刺激產(chǎn)生VGEF從而增加血管通透性，同時還能增強(qiáng)TGF-β1、MCP-1的表達(dá)。這些作用有助于促炎細(xì)胞的表達(dá)與釋放,進(jìn)而引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷及促進(jìn)纖維化[41]。IL-17信號通路與炎癥密切相關(guān)，IL-17作用于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞后產(chǎn)生IL-6,引起炎癥發(fā)生[42]，另外當(dāng)IL-17作用于樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞時引起IL-1、TNF和IL-6的分泌,導(dǎo)致炎癥[43]。IL-17信號通路參與免疫反應(yīng),T細(xì)胞亞群平衡會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇,可能造成肺損傷[44]。MAPK信號通路和NF-κB信號通路也是炎癥反應(yīng)中的重要通路，研究報道通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路可以起到控制炎癥反應(yīng)且改善炎性纖維化[45-46]。由此可以預(yù)測厚樸-廣藿香可能調(diào)節(jié)多條信號通路，主要是通過減少炎癥反應(yīng)、減少纖維化、抑制細(xì)胞損傷凋亡來達(dá)到治療COVID-19的目的。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初步探討了厚樸-廣藿香通過多成分、多靶點、多通路從炎癥反應(yīng)、減少纖維化、細(xì)胞凋亡等方面治療 COVID-19的作用機(jī)制。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性[47]，后期須進(jìn)一步對主要活性成分、關(guān)鍵潛在靶點和關(guān)鍵通路進(jìn)行驗證，并且圍繞相關(guān)潛在靶點，代謝通路進(jìn)行動物體內(nèi)外藥理實驗，對厚樸-廣藿香治療COVID-19的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，為進(jìn)一步研究和新藥開發(fā)提供參考。